间接免疫荧光试验

间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。

2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。

37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。

2.3 收集293细胞。

用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。

2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。

2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。

2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。

2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。

PBS洗8~9遍，保持湿润。

2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。

PBS洗8~9遍，室温晾干。

(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。

超纯H2O洗3遍，室温晾干。

2.9 50%甘油封片。

2.10 显微镜下观察照相。

3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。

检测结果应为阳性。

注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。

2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。

3、丙酮固定过夜效果较好。

PBS稀释。

当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。

培养液成分太多了。

而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。

抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。

上网查一下，有很多protocol。

一般一比几百到一万都有，依抗体而定。

免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。

本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。

一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。

二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。

2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。

3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。

4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。

5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。

6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。

三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。

1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。

2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。

3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。

4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。

5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。

结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。

该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。

间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。

以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。

对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。

对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。

对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。

2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。

常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。

通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。

3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。

4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。

洗涤后回收一抗。

5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。

取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。

6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。

待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。

请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。

如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。

间接免疫荧光试验的基本原理
间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence Assay，简称IFA）是一种检测抗体的方法。

其基本原理是利用荧光标记的抗人类IgG二抗与被检物中的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光二抗复合物，通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和分布情况，来判断被检物中是否存在特定抗体。

具体操作步骤如下：
1. 准备样本：收集被检测物质，如血清、尿液、组织、细胞等。

2. 制备标记荧光素的抗人类IgG二抗：将荧光素标记的二抗与人类IgG反应，制备出荧光素标记的抗人类IgG二抗。

3. 处理被检测物质：将被检测物质加入载玻片上，用荧光素标记的抗人类IgG 二抗处理，使其与被检测物中的抗体结合。

4. 观察荧光信号：在荧光显微镜下观察样本中荧光信号的强度和分布情况，判断被检测物中是否存在特定抗体。

IFA方法具有灵敏度高、特异性强、可同时检测多种抗体等优点，广泛应用于医学、生物学和病毒学等领域中的抗体检测和诊断工作中。