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滚环扩增(RCA)技术放大信号实现17β-雌二醇(E2)的超灵敏检测王伟亚,白家磊①,彭媛①,王玖,高志贤①*(滨州医学院公共卫生与管理学院,烟台264033) 摘要:目的为实现食品中17β-雌二醇(E2)污染物的超灵敏检测,本研究将适配体㊁分子信标和滚环扩增(RCA )技术相结合,用于E2的荧光检测㊂方法E2能解旋由适配体和cDNA 杂交生成的复合DNA ,使cDNA 游离并与环DNA 特异性结合,在Phi29酶的作用下生成长单链DNA ㊂长单链DNA 与分子信标杂交后,解旋分子信标的发夹结构,使FAM 荧光基团的荧光恢复,从而实现E2的超灵敏检测㊂结果经过条件优化,在0.001ng /mL-10ng /mL 的浓度范围内E2浓度与荧光强度呈现良好的线性关系:y =594.17LgC+3868.87(R 2=0.9758),检出限为0.19pg /mL ㊂在牛奶和自来水中,加标回收率分别为81.33%-117.42%和89.25%-107.04%,相对标准偏差是2.02%-3.13%和1.09%-2.45%㊂结论在本研究中,我们基于适配体技术和等温扩增技术提出了一种E2的超灵敏荧光检测方法㊂该方法灵敏度高㊁特异性强㊁操作简单㊁实验仪器要求低㊂该策略为E2的检测提供了一种新的方法,也为其他污染物的检测提供了新的思路㊂ 关键词: 滚环扩增(RCA ); 适配体技术; 分子信标; 荧光共振能量转移 中图分类号:TS207.5 文献标志码:A 文章编号:1001-5248(2020)12-0078-06基金项目:军事医学研究院基金(No.2019GGRC03,2019CXTD03)作者简介:王伟亚(1991-),女,硕士,执业医师㊂从事食品安全与检测技术㊂①军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所*通信作者E-mail:gaozhx@ 环境雌激素,又被称为 内分泌干扰化合物”(en⁃docrine disrupting chemicals,EDC),广泛存在于在人类生存环境中,可对人类的生殖㊁免疫㊁神经㊁内分泌等多个系统产生危害引起一系列的生理功能的改变甚至引起癌变(乳腺癌),严重扰乱正常生理功能〔1〕㊂17β-雌二醇(E2)是诸多环境雌激素中作用最强烈的一种,仅仅是nM 级别的残留量即可对人类内分泌系统产生不良影响〔2〕㊂由于雌激素类药物的非法使用,在靠近废水处理设施的地点和全球各地的地下水中都检测到了处于污染水平的雌激素㊂水产品㊁饮用水以及牛奶和乳制品中的E2残留问题更是日益严重〔3〕㊂E2的污染问题已经成为严重的公共卫生问题㊂为了保证公共卫生健康和食品安全,对于雌激素类污染物的监管力度正在加强㊂欧盟2015年发布的观察清单,E2以极低的检测限(0.4ng /L)被纳入其中,由于现有的监测技术的限制,2018年监测结束时,8个成员国未达到E2所需的灵敏度㊂因此,E2在2018年发布的修订版观察清单中得到了保留〔4〕㊂显然挑战仍然存在,建立更敏感和更稳健的分析方法达到保证监测效能是至关重要的㊂目前E2检测有多种方法,且各有利弊,如Elisa〔5〕㊁免疫分析〔6〕等方法有良好的特异性,但检测灵敏度不够;电化学传感器〔7〕㊁液相色谱串联质谱〔8〕等灵敏度高㊁稳定性强且有较好的特异度,但样品的前处理复杂㊁实验仪器要高求㊁实验周期长;量子点〔9〕检测技术虽然操作简单,但耗费时间长,重复性差,且目前已有的方法很难达到要求的灵敏度(0.4ng /L)㊂通过放大待测目标物的信号,可以实现目标物的超灵敏检测㊂适配体技术与等温扩增技术相结合,是一种有效的检测目标物信号放大手段〔10〕㊂适配体是能够与目标物或相应的配体严格识别和高度特异性结合的寡核苷酸序列〔11〕㊂因为具有高度特异性㊁靶分子广㊁易于体外合成和修饰等优点在基础领域㊁临床诊断和治疗中得到广泛应用〔12〕㊂目前应用较广泛的等温扩增技术主要包括环介导的核酸等温库增技术(LAMP)〔13〕㊁链替代等温扩增技术(SDA)〔14〕㊁滚环扩增技术(RCA)〔15〕等㊂其中RCA 是一种简单有效的恒温酶依赖型技术㊂一个典型的RCA 反应由一个短的引物序列㊁环状DNA 模板㊁DNA 聚合酶以及dNTPs 四部分组成〔15〕㊂环DNA 和引物在DNA 聚合酶的作用下,生成具有数十到数万个与环状DNA 序列互补的串联重复长单链DNA,RCA 能从一个分子结合生长出一条长DNA 单链,从而能够在单分子水平上检测目标〔10〕㊂分子信标是一种DNA 荧光探针,两端分别修饰有荧光基团和猝灭基团〔16〕㊂自然状态下分子信标呈闭合的发夹状,荧光基团和猝灭基团互相靠近,由于荧光共振能量转移荧光基团的荧光被猝灭基团猝灭㊂当目标DNA 存在时,分子信标与其特异性杂交结合解旋发夹结构,荧光共振能量转移消失,荧光基团的荧光恢复〔17〕㊂因分子信标具有极高的特异性和灵敏度,目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具〔17〕㊂本研究我们将适配体㊁分子信标和RCA技术相结合建立了一种超灵敏㊁便捷的E2荧光检测技术(图1)㊂我们向微量反应管中加入数量相等的cDNA 和适配体㊂当溶液中存在E2小分子时,E2小分子优先与E2适配体结合,从而释放出cDNA,游离的cD⁃NA与环DNA特异性结合,在Phi29酶的作用下生成能解旋分子信标颈环结构的长单链DNA㊂分子信标与长单链DNA杂交结合后荧光恢复,在波长为498nm的激发光下,发出波长为525nm的荧光㊂1 材料和方法1.1 仪器和试剂DYY-15D电泳系统(北京六一生物技术有限公司),F97pro荧光分光光度计(上海棱光科技有限公司),OSE-DB-01/02金属浴(天根生物科技有限公司),生物安全柜(ESCO classⅡBiohazard Safety Cabinet)(北京六一生物技术有限公司)㊂T4DNA连接酶㊁ExonucleaseⅠ核酸外切酶(ExoⅠ)㊁ExonucleaseⅢ核酸外切酶(ExoⅢ)㊁Phi29DNA polymerase㊁脱氧核糖核酸三磷酸(dNTPs)购自新英格兰生物实验室(NEB) (北京),17β-雌二醇(E2)㊁雌三醇(E3)㊁双酚A(BPA)和己烯雌酚(DES)㊁任基酚(NP)购自Sigma Aldrich, 30%聚丙烯酰胺从上海阿拉丁生化科技有限公司购买,20bp DNA Ladder㊁6×DNA Loading buffer和5×TBE 从北京索利宝科技有限公司购买,GeneGreen10000×核酸染料来自天根生化科技(北京)有限公司㊂实物检测所用的牛奶是从天津市大型连锁超市购买的脱脂牛奶,水样为天津市自来水系统自来水㊂用于实验的DNA序列(如表1所示)均由上海生工生物技术有限公司(中国上海)合成,并经的HPLC纯化㊂除特殊说明外所用试剂均为分析纯㊂水由Milli-Q水净化系统获得的超纯水(18.2MΩcm)㊂图1 实验原理图表1 寡核苷酸序列DNA链序列(5’-3’)锁式探针5’-Phosphate-ATTGAATTACACCTCAGCCCCTACCATTATTAATAGACTG CCTCAGCCACCATCACCTTTGCTATTTAACCTCAGCGCTTCCAGCTT-3’引物探针5’-TGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3’E2适配体5’-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCAT TCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-Biotin-3’cDNA5’-AAAATTTAAAATGTAATTCAATAAGCTGGAAGC-3’分子信标5’-6-FAM-ATGACTACACCATCACCTTTGCTATTTAATAGTCAT-BHQ1-3’1.2 环DNA的制备 取等体积的P(10μM)和p (10μM),以及10×T4DNA连接酶buffer加入到微量反应管中,充分涡旋混匀放置于金属浴上,设置五段程序进行退火杂交㊂向微量反应管的中产物加入T4DNA连接酶(350U/uL)㊁振荡混匀离心后,在16℃条件下㊁反应2h,在65℃条件下㊁灭活酶10min㊂上一步反应结束后向微量反应管中产物中加入ExoⅠ㊁ExoⅢ㊁10×ExoⅠbuffer㊁10×ExoⅢbuffer,振荡混匀,在37℃下消解过夜,80℃,灭活酶20min㊂将合成好的环DNA-20℃储存备用㊂1.3 E2和cDNA竞争结合适配体 Apt和cDNA 按照不同浓度比例加入微量反应管,充分涡旋混匀后放置于金属浴上,设置五段程序进行退火杂交㊂再向每个反应管中加入相同浓度的E2,在37℃下垂直混悬30min㊂反应结束后用圆二色谱仪测量㊂1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 用超纯水清洗凝胶用玻璃片,吹干后用垂直胶固定架固定㊂按凝胶配方表进行配置12%聚丙烯酰胺凝胶的配置㊂将配置好的凝胶液倒入固定好玻璃板中,插入梳子,静置40min等待凝胶㊂将制备好的凝胶固定在电泳内槽,加入1×TBE缓冲液㊂将制备好的样品与loading buffer混匀后依次加入点样口,并设置电泳仪的参数:U=100V㊁I=300mA㊁T=60min,进行电泳㊂电泳结束后剥离凝胶后放入染色箱中,用配置好的3×genegreen染料,25℃避光染色25min㊂用Amersham Imager680凝胶成像仪,UV模式下成像㊂1.5 RCA产物解旋分子信标颈环结构 取10μL circ-DNA和cDNA(1μM),充分涡旋混匀放置于金属浴上,设置程序进行退火杂交㊂再将Phi29和dNTPs加入,混匀后在16℃条件下㊁反应2h㊂最后向RCA产物中加入分子信标,退火后用荧光分光光度计测量荧光强度㊂1.6 E2检测方法 适配体和cDNA等量混合后退火后加入一系列列浓度的E2标准液,37℃垂直混悬30min㊂向第一步的反应中产物在加入环DNA (1μM)㊁Phi29酶(10U/μL)㊁10xPhi29buffer㊁dNTPs㊁分子信标㊁DEPC水,并在30℃下孵育90min, 80℃,20min灭活酶㊂反应结束后用F97pro荧光分光光度计测定荧光(狭缝宽度:10nm;PMT电压: 750V;激发:498nm;发射:520nm)㊂1.7 实际样品中E2的检测 我们进行了水和牛奶的加标回收实验㊂在真实样品中分别加入1ng/mL㊁0.1ng/mL㊁0.01ng/mL三种浓度的E2㊂对于牛奶和水的预处理,采用下面方法:将购买的牛奶或水加入具塞离心管中,加入等体积乙腈,涡旋混匀5min,4℃, 10000r/min下离心10min,上清液转入洁净离心管中,残渣用乙腈重复提取1次,合并上清液于离心管中, 4℃冰箱静止过夜,取上清过0.22μm有机滤膜㊂2 结果和讨论2.1 合成环DNA 锁式探针在引物探针和T4连接酶的作用下连接成环,经ExoⅠ和ExoⅢ的消解作用后生成环DNA,并通过凝胶电泳进行了表征如图2,1-6为6个平行组(均经过锁式探针成环以及环化后的消解反应),各组之间互为对照㊂与未成环的锁式探针相比,成环后的锁式探针形成的环状DNA结构在电泳的过程中的阻力大于单链DNA,电泳条带出现了较为靠上(后)的位置㊂此外,各泳道内均只有一个目标条带,无其他条带存在,说明环化后的锁式探针经ExoⅠ和ExoⅢ消解完全,没有未还化的单链DNA存在,生成环DNA无需进行纯化㊂图2 锁式探针合成环DNA的电泳表征2.2 E2和cDNA竞争结合适配体验证 我们也用圆二色谱表征了三者之间的亲和力,如图3所示当溶液体系中只有E2适配体和cDNA时,在260nm和300nm 处观察到了相应的二级峰,当加入目标物E2小分子后,适配体与E2结合,其二级结构发生改变,并且由于碱基堆积和螺旋结构的改变,峰值下降㊂说明E2能够解旋适配体和cDNA杂交生成的复合DNA㊂2.3 RCA产物和分子信标结合效果 如图4所示RCA产物和分子信标杂交结合前后荧光强度存在明显差异㊂说明RCA生成的长单链DNA能够与分子信标杂交结合解旋分子信标的颈环结构,恢复修饰在其5’端的FAM荧光基团的荧光㊂图3 E2、cDNA和E2适配体三者之间亲和力的圆二色谱表征图4 RCA产物和分子信标结合效果的荧光表征2.4 实验条件优化 对于对实验结果影响较大的因素如:RCA反应时间,分子信标浓度,我们进行了分步优化㊂如图5A所示,RCA过程中,在Phi29㊁dNTPs㊁和分子信标(过量)恒定的条件下,随着反应时间的增加,荧光强度先增加然后趋于稳定,考虑到实验反应的稳定性和检测时间,选定90min为最适的RCA反应时间㊂图5B显示了RCA反应完成后随着分子信标加入量的增加,荧光强度的变化过程,基于同样的原则,选择分子信标的最适添加量为50μL(1μM)㊂2.5 荧光检测 采用优化好的实验条件,进行扩增实验与荧光检测㊂如图6所示E2浓度与荧光强度在0.001ng/mL-10ng/mL的范围内表现出良好的线性关系,呈正相关㊂线性方程为y=594.17LgC+ 3868.87,R2=0.9758,检出限为0.19pg/mL㊂值得强调的是我们提出的检测策略检测限低至pg/mL,归功于以下原因:(1)首先痕量的cDNA引发了RCA反应;(2)RCA生成的长单链DNA序列能够打开分子信标的颈环结构使其荧光恢复㊂2.6 特异性实验 为了验证该策略的特异性和灵敏度,我们在相同的条件下检测了E2和其他雌激素类似物㊂E2小分子溶液浓度选1ng/mL,其他干扰物小分子浓度为100ng/mL㊂如图5C所示NP㊁BPA㊁Atrazine㊁E3和DES即使浓度远高于E2(100倍)也不能和cDNA 竞争结合适配体游离cDNA㊂更不会引发后续的扩增㊂说明该方法对E2检测具有良好的特异性和灵敏度㊂特异性源自于:(1)cDNA和环DNA的特异性识别;(2) RCA的生成得长单链DNA产物和分子信标的特异性结合打开分子信标颈环结构㊂图5 RCA反应时间的优化(A);分子信标加入量用量的优化(B);本实验方法的特异性(C)图6 RCA检测E2的校准曲线2.7 加标回收实验和方法学比较 通过样品加标回收实验来评估本研究方法测定的稳定性㊂如表2所示牛奶和水样的回收率分别为81.33%-117.42%和89.25%-107.04%,相对标准偏差是2.02%-3.13%和1.09%-2.45%㊂为了证实该方法的可靠性,我们用高效液色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)建了E2的检测标准曲线,E2的检测限为0.4ng/mL㊂与HPLC/MS/MS相比灵敏度和操作简单是本方法的主要优点㊂表2 牛奶和水样品的加标回收率样品加标量(ng/mL)检出量荧光值检出率(%)RSD(%)牛奶10.81287597.0381.33 3.130.10.10475068.22104.73 2.020.010.01174503.76117.42 3.68水1 1.12205681.09112.20 1.090.10.09295038.1292.93 1.760.010.00824145.5181.97 2.45 3 结论 在本研究中,我们将适体技术和等温扩增技术结合建立了一种超灵敏便捷的E2荧光检测技术㊂DNA 的特异性互补配对原则保证了该方法的特异性,RCA 的高效率保证了灵敏度,并且分子信标的应用将检测信号进一步放大,使其检测限低至0.19pg/mL㊂该研究中RCA技术与适配体技术结合获得了良好的特异性和较高的灵敏度,且操作简单,检测成本低㊁实验仪器要求低㊂本策略为E2检测提供了一种新的方法,也为具有适配体的污染物的检测提供了新的思路㊂参考文献:〔1〕 GORE A C,CHAPPELL V A,FENTON S E,et al.Execu⁃tive Summary to EDC-2:The Endocrine Society's SecondScientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals〔J〕.Endocr Rev,2015,36(6):593.〔2〕 WANG S,LI Y,DING M J,et al.Self-assembly molecu⁃larly imprinted polymers of17beta-estradiol on the sur⁃face 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PCR的相关技术介绍一、聚合酶链反应的历史回顾1、核酸体外扩增最早的设想由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。
但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。
2、聚合酶链反应的发明1985 年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。
其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。
开始是使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。
由于该酶不耐热，因此，每次加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。
在操作多份标本时，这一过程耗时，费力，且易出错。
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。
Mullis等因此项技术于1993年获得诺贝尔奖金。
二、聚合酶链反应相关技术的发展PCR 及其相关技术的发展速度是惊人的。
国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。
第一届会议主要讨论了PCR的应用与技术本身的优化问题;第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进展。
这充分体现了生物学家对PCR的重视。
名称主要用途简并引物扩增法扩增未知基因片段巢居PCR 提高PCR敏感性、特异性，分析突变复合PCR 同时检测多个突变或病原反向PCR 扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物PCR 扩增未知基因组DNA 单侧引物PCR 通过已知序列扩增未知cDNA 锚定PCR 分析具备不同末端的序列增效PCR 减少引物二聚体，提高PCR特异性固着PCR 有利于产物的分离膜结合PCR 去除污染的杂质或PCR产物残留表达盒PCR 产生合成或突变蛋白质的DNA片段连接介导PCR DNA甲基化分析、突变和克隆等RACE-PCR 扩增cDNA末端定量PCR 定量mRNA或染色体基因原位PCR 研究表达基因的细胞比例等臆断PCR 鉴定细菌或遗传作用通用引物PCR 扩增相关基因或检测相关病原信使扩增表型分型(mapping) 同时分析少量细胞的mRNA三、其它扩增技术与PCR及其相关技术发展的同时，新的扩增技术也不断诞生。
链置换扩增术（SDA）及其进展关键词：链置换扩增术；DNA检测摘要链置换扩增术（strand displacement amplification，SDA）是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。
在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。
被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。
该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。
本文主要介绍SDA的原理及其发展。
关键词链置换扩增术；DNA检测近几年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸（DNA或RNA）检测的诊断方法（如各种PCR、Southern杂交和Northern 杂交）已大量建立并获得广泛应用。
这给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。
虽然这些方法在临床实践中也遇到一些问题，如PCR的假阳性与假阴性问题，但基因诊断具有一些特殊优点，如：需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛；因此，众多学者学者不断改进现有技术探索新方法。
新技术如转录依赖的扩增系统（TAS）、自主序列复制（3SR）、循环探针反应、Qβ复制酶扩增法、快速导流杂交法、DNA凝集反应等陆续出现。
SDA就是在这样的背景下产生发展起来的，与其它的DNA扩增技术相比，SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。
1992年，美国Becton Dickinson研究中心的Walker等发表了关于SDA的研究报道，标志一种新的DNA扩增技术SDA的诞生[1]。
人们也在不断对SDA进行改良。
用BsoBⅠ代替HincⅡ和采用exo-Bca酶代替exo-Klenow酶建立了嗜热SDA （thermophilic sDA），并以荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）检测技术代替电泳法作为SDA产物检测方法，使SDA检测更快速、灵敏且可定量。
PCR扩增原理及过程PCR（聚合酶链反应）是一种体外合成DNA的方法，通过不断复制目标DNA片段，实现DNA分子的快速扩增。
PCR技术的核心包括三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR扩增通过逐渐增加DNA双链的数量，实现DNA片段的体外扩增。
市面上的PCR基本都是以酶作为模板DNA的探针。
PCR是介导DNA合成的酶是DNA聚合酶。
PCR扩增是通过在DNA双链单进程替代法中采取优化条件，达到模板DNA的特殊的扩增性，使DNA受检测的区域能选择性地被扩增，以便能被轻松的检测。
1.变性：在PCR开始时，反应液被加热到94-98°C，将DNA双链变性为两条单链，使DNA双链解开形成两条单链，反应液中的所有杂质和目标DNA均为两条单链。
加热时间一般为30秒至2分钟。
2.退火：反应液被冷却到45-68°C，引入适量的引物，引物是PCR 反应中的两个特异性寡核苷酸片段，通过与目标DNA片段序列互补配对，形成引物-目标DNA复合物。
引物的设计至关重要，它需要在特定的温度下与目标DNA序列完全互补，以确保反应的特异性。
3.延伸：在退火温度下，引物-目标DNA复合物提供一个起始点，DNA 聚合酶开始在引物上合成新的DNA链。
在延伸过程中，DNA聚合酶沿着模板DNA链移动，合成互补的新DNA链。
该过程需要DNA聚合酶、缺少的DNA碱基和引物的存在。
延伸温度一般为72°C。
在延伸完成后，新合成的DNA链会与模板DNA分离，得到两个完全相同的DNA分子。
随后，整个反应过程会重复多次，使DNA的数量呈指数增长。
PCR的优势在于：扩增速度快、产量高、特异性强、灵敏度高。
由于其优异的特性，PCR广泛应用于DNA检测、基因克隆、疾病诊断、遗传研究等领域。
恒温扩增技术在分子诊断中的应用摘要：既往临床诊断中主要对聚合酶链反应（PCR）技术进行应用，但其存在一定程度的缺陷，而恒温扩增技术因为具有引物种类的多样性，所以检测方法相对多变，能够对传统PCR中存在的缺陷有效弥补，并在分子诊断工作中得到了广泛应用。
关键词：恒温扩增技术；分子诊断；应用相对于常规PCR技术，对恒温扩增技术进行应用，其不仅不需要应用专门的仪器，且更加的快速和高效。
当前广泛应用的恒温扩增技术主要包括依赖核酸序列扩增（NASBA）、转录介导扩增（TMA）、环介导等温扩增（LAMP）等多种形式，其各具优缺点，且能够在分子诊断工作之中起到不同的作用。
一、依赖核酸序列扩增（NASBA）NASBA是主要适合应用于RNA的扩增之中，针对体外特异、连续均一且引物介导的单链RNA实施恒温扩增，需要于42℃的环境中使用两个小时左右的时间，将模板RNA扩增至其109——1012倍。
对NASBA进行应用：（1）在NASBA电化学发光技术检测法方面，需要对电化学发光技术原理进行应用，针对RNA产物实施检测工作，完成扩增反应以后，使用经过生物素标记的探针与RNA产物结合形成复合物，并由寡核苷酸饱和磁珠携带至电极处，受到低电压影响，钌离子能够出现氧化还原反应并产生光子，并于三丙胺作用下再生，可见电极处的RNA产物与光信号强度具有密切关联性，二者呈正相关关系，所以可以通过电化学发光检测技术对620nm位置的发光强度进行检测并明确RNA定量；（2）核酸杂交检测法的应用，将NASBA为基础结合原位杂交技术形成原位NASBA，使用原位杂交技术探针及RNA扩增产物进行杂交，再使用紫外分光光度计对探针量进行监测，可以实现RNA产物的定量分析工作[1]。
二、环介导等温扩增（LAMP）LAMP属于一项新型的核酸扩增技术，其具有扩增效率较高的特点，其扩增效率最高能够达到普通PCR的100倍左右，同时特异性较强，并且所需的反应时间较短，一般30——60min即能够实现一次扩增反应，在临床样本量大时，可以实现快速的检测，另外，对LAMP进行应用的成本相对较低，仅需恒温器即可。
