嘌呤霉素说明书

细胞筛选一嘌呤霉素(一) 确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。

一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。

1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。

（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105 个/ml 的细胞悬液。

3. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。

（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。

） 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。

（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。

（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。

） 5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。

如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。

6. 在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。

在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。

最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。

(二) 转染细胞 1. 第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。

2. 第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。

将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。

去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。

说明：蛋白质合成抑制剂。

抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。

某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。

作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。

嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。

这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。

嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。

在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。

溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。

使用方法1.建议使用浓度哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。

注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

2.溶解方法用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。

3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。

为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。

建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。

慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于：¾构建Cas9蛋白表达细胞系¾在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004pGR载体系列 CR2011~CR2013pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916Tel：010‐62495135Emai：order@Web site：目录1、产品简介 (2)1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2)1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2)2、Cas9表达慢病毒制备 (3)2.1试剂准备 (3)2.2简要实验流程 (4)2.3实验前准备 (4)2.4病毒制备步骤 (5)2.4 PEG纯化慢病毒 (6)3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7)3.1 试剂 (7)3.2 实验前准备 (7)3.3 筛选细胞系实验步骤 (8)3.4 Cas9表达细胞系检测 (9)4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10)4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10)4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11)5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13)5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13)5.2 靶点设计 (13)5.3 pGR载体构建步骤 (14)附录1 用到的产品 (17)附录2 引物列表 (17)11、产品简介1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。

Polybrene (Hexadimethrine Bromide)产品编号 产品名称包装 C0351-1ml Polybrene (Hexadimethrine Bromide) 10mg/ml×1mlC0351-50mgPolybrene (Hexadimethrine Bromide)50mg产品简介：Polybrene (聚凝胺)，也称Hexadimethrine Bromide (海美溴铵)，是一种聚溴化季铵阳离子，可显著提高慢病毒(lentivirus)、腺病毒(adenovirus)等病毒对细胞的感染效率。

本产品为进口分装。

Polybrene 的化学名称为1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide ，分子式为(C 13H 30Br 2N 2)n ，CAS 号为28728-55-4，纯度≥94% (titration)。

Polybrene 可显著提高慢病毒、腺病毒等病毒对某些细胞的感染效率，其原理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。

另外，Polybrene 也可用于哺乳动物细胞的转染、增强脂质体的转染效率。

带正电荷的Polybrene 也是一种抗肝素剂(肝素拮抗剂)，可中和红细胞表面负电荷而常用于制备非特异性凝集的红细胞；其抗凝特性也为体外测定肝素活性提供了一种准确、快速、简单的方法。

Polybrene 在蛋白测序中有一定的作用：少量的Polybrene 在自动测序分析中可明显增加多肽的降解；加入Polybrene 能提高PVDF 膜的亲水性，降低测序过程中多肽的机械损伤。

Polybrene 也可降低某些酶原的自发激活而用于酶动力学测定。

本产品为进口分装，其中10mg/ml 包装产品为超纯水配制并用0.22μm 滤膜除菌处理。

50mg 包装为粉末装。

包装清单：产品编号 产品名称包装 C0351-1ml Polybrene (Hexadimethrine Bromide) 10mg/ml×1mlC0351-50mgPolybrene (Hexadimethrine Bromide)50mg —说明书1份保存条件：4ºC 保存，至少一年有效；-20ºC 保存，至少二年有效。

重庆英茂盛业‐产品说明书Vero ‐EGFP 细胞说明书品名：Vero ‐EGFP 细胞 货号：CG008包装：1×10^6~1×10^7 1 支细胞株类型：稳定表达EGFP 荧光蛋白多克隆细胞株 细胞来源：Vero(非洲绿猴肾细胞） 表达基因：EGFP 抗性：嘌呤霉素培养基：DMEM (g i b c o 货号：12100-061)培养基+10%FBS消化液：0.25%胰蛋白酶，0.53mM EDTA 冻存液：50%胎牛血清，40%DMEM ，10%DMSO 培养条件：37℃，5% CO 2 产品简介：Vero-EGFP 细胞稳定表达EGFP 荧光蛋白，培养时无需抗生素维持。

可作为慢病毒感染实验中的对照细胞株使用。

细胞株构建方法：慢病毒载体pLV ‐EGFP ‐C （货号VL3215）包装慢病毒后感染Vero 细胞，用嘌呤霉素筛选得到EGFP 过表达多克隆细胞株。

收到细胞的处理：根据客户所在地及发货季节，我们可能采用干冰运输的冻存细胞或者常温运输的培养瓶细胞两种不同形式发货。

收到细胞后根据细胞运输类型采用下面两种方式操作。

干冰运输细胞：1、 37℃水浴融化细胞冻存液，间或摇动冻存管以加速融化过程。

待细胞冻存液完全融化后，用70%乙醇消毒细胞冻存管外壁。

2、 室温200g 离心 5 分钟收集细胞。

吸去上清。

3、 用1ml 培养基重悬细胞。

4、 将细胞接种到6mm 培养皿或25cm 培养瓶中，补加5ml培养基，37℃ 5%CO 2 培养。

常温运输细胞：1、 3000g 10min 室温离心收集细胞。

2、 用细胞培养基轻柔吹吸重悬细胞。

3、 接种到25cm 培养瓶或60mm 培养皿，补足培养基到5ml 。

4、 放到细胞培养箱，37℃ 5%CO2培养过夜。

5、 第二天观察细胞贴壁情况，换液去除未贴壁细胞，继续培养。

6、 细胞生长后及时消化传代，尽早冻存1~2支。

细胞传代：1、 传代前将细胞培养液、PBS 和胰蛋白酶温浴到37℃。

北京雷根生物技术有限公司
嘌呤霉素溶液(Puromycin,1mg/ml)
简介：
嘌呤霉素(Puromycin，PM )是一种蛋白质合成抑制剂，它具有与tRNA 分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA 同核糖体的A 位点结合，并掺入到生长的肽链中。

虽然嘌呤霉素能够同A 位点结合，但是不能参与随后的任何反应，因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。

嘌呤霉素分子量为544.43，CAS 号为53-79-2。

Leagene Puromycin solution 经过滤除菌，可用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、根据实验具体要求操作。

2、Puromycin solution(1mg/ml)其摩尔数为1.84mmol/L，而Puromycin 工作浓度一般为10～100μmol/L。

3、以工作浓度为100μmol/L 为例，即1mg/ml 稀释18.4倍，即每10ml 培养基中加入Puromycin solution(1mg/ml)544μl。

注意事项：
1、注意无菌操作，避免污染。

2、避免反复冻融，以免失效。

3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。

相关：编号
名称CA0069Storage
Puromycin solution(1mg/ml)
1ml -20℃避光使用说明书1份编号
名称CA0075
青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)TE0002碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(PNP 微板法)。

甲亢药物（硫唑嘌呤片）说明书【商品名】硫唑嘌呤片【通用名称】硫唑嘌呤片【批准文号】国药准字H31021422【产品英文名称】Azathioprine Tablets【生产企业】上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂【功效主治】1．急慢性白血病，对慢性粒细胞型白血病近期疗效较好，作用快，但缓解期短；2．后天性溶血性贫血，特发性血小板减少性紫癜，系统性红斑狼疮；3．慢性类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎（与自体免疫有关的肝炎）、原发性胆汁性肝硬变；4．甲状腺机能亢进，重症肌无力；5．其他：慢性非特异性溃疡性结肠炎、节段性肠炎、多发性神经根炎、狼疮性肾炎，增殖性肾炎，Wegener氏肉芽肿等。

【化学成分】本品化学名称为：6-[(1-甲基-4-硝基-1H-咪唑基-5-)硫代]-1H-嘌呤。

分子式：C9H7N7O2S分子量：277.27【药理作用】在体内几乎全部转变成6-巯基嘌呤而起作用。

由于其转变过程较慢，因而发挥作用缓慢。

它能抑制Friend白血病，抑制病毒对小鼠的感染，使脾脏肿大得到抑制，使脾脏及血浆内病毒滴度下降。

大鼠长期腹腔注射本品达4～5个月时出现体重下降、严重贫血和网织细胞增加。

家兔于妊娠早期给予本药，可引起畸胎，主要是肢体发育受到影响。

可通过对RNA代谢的干扰而具有免疫抑制作用。

若小剂量长期存在于培养基中，可抑制致敏的淋巴细胞在体外的杀伤细胞作用。

【药物相互作用】别嘌呤醇可抑制巯基嘌呤（后者是硫唑嘌呤的活性代谢物）代谢成无活性产物，结果使巯基嘌呤的毒性增加，当二者必须同时服用时，硫唑嘌呤的剂量应该大大地减低，硫唑嘌呤可降低6-巯嘌呤的灭活率，6-巯嘌呤的灭活通过下列方式：酶的S-甲基化，与酶无关的氧化，或是被黄嘌呤氧化酶转变成硫尿酸盐等。

硫唑嘌呤能与巯基化合物如谷胱甘肽起反应，在组织中缓缓释出6-巯嘌呤而起到前体药物的作用。

【不良反应】较巯嘌呤相似但毒性稍轻，可致骨髓抑制，肝功能损害，畸胎，亦可发生皮疹，偶见肌萎缩。