嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结

G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

6个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到一个具体试验：3x1024孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

细胞筛选一嘌呤霉素(一) 确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。

一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。

1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞。

（筛选的目的是杀灭未转染的细胞）2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105 个/ml 的细胞悬液。

3. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。

（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。

） 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。

（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。

（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。

） 5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。

如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。

6. 在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。

在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。

最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。

(二) 转染细胞 1. 第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。

2. 第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。

将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。

去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。

嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素是一种广泛用于细胞生物学研究的抗生素，它通过特异性地抑制蛋白
质合成而对细胞产生影响。

嘌呤霉素筛选细胞原理主要是利用其对细胞的影响来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株，从而为进一步研究细胞的生物学特性提供重要的工具和方法。

嘌呤霉素的作用机制是通过与细胞内的核糖体结合，阻止蛋白质的合成。

在细
胞中，核糖体是蛋白质合成的重要场所，而嘌呤霉素的结合会引起核糖体的功能受损，从而影响细胞的正常生物学活动。

因此，对嘌呤霉素敏感的细胞在其作用下会出现生长受抑制甚至死亡的现象，而对嘌呤霉素耐药的细胞则能够继续生长并繁殖。

在进行嘌呤霉素筛选细胞的实验中，首先需要将待筛选的细胞种植在含有嘌呤
霉素的培养基中，然后观察细胞的生长情况。

对于对嘌呤霉素敏感的细胞，其生长将受到明显的抑制，甚至会出现细胞死亡的现象；而对于对嘌呤霉素耐药的细胞，则会继续生长并形成细胞克隆。

通过这种方式，可以筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株，为后续的细胞生物学研究提供了重要的实验材料。

嘌呤霉素筛选细胞的原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义，同时也在药
物筛选和耐药机制研究中发挥着重要作用。

通过对细胞对嘌呤霉素的敏感性进行评估，可以为药物研发提供重要参考，同时也有助于深入了解细胞对抗生素的耐药机制，为临床治疗提供理论基础。

总的来说，嘌呤霉素筛选细胞的原理是基于其对细胞的特异性影响，通过观察
细胞在其作用下的生长情况来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株。

这一原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义，同时也在药物研发和耐药机制研究中发挥着重要作用，为进一步的科学研究和临床治疗提供了重要的实验基础和理论支持。

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。

细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。

嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。

（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。

）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。

）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。

孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。

在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。

嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。

注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。

在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。

调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。

细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。

嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。

（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。

）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。

）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。

孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。

在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。

嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。

注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。

在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。

调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

G418挑选稳固表达细胞系经验总结我做了稳固转染，从G418 浓度确立到最后的单克隆化判定。

有自己的领会也有其他战友碰到的状况 ,和大家分享.没有总结好的地方，大家增补。

挑选从前确立 G418浓度：1、因为每种细胞对 G418的敏感性不同，并且不同的厂家生产的 G418 有效成分的比重不同，一般 1g 的粉剂中有效的 G418含量大概为 0.722g 。

2、G418是新霉素的近似物，二者都是经过克制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

可是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo 就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜遇到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其余抗生素。

3、集合度对 G418挑选结果的影响很大，一般挑选时集合度不宜超出50%4，G418的活性不尽同样，所以在挑选从前，必定要确立G418的最正确挑选浓度。

详细如下：将细胞稀释到1000 个细胞 /ml ，在 100ug/ml~1mg/ml 的 G418浓度范围内进行挑选，选择出在 10~14 天内使细胞所有死亡的最低G418浓度来进行下一步的挑选试验。

一个详细试验： 3x106个细胞电转后，分别接种 1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到 24 孔板中，48h 后加药挑选，此时 1/300 细胞孔内大概 50%集合度。

理论上 1/4000 孔内应有 4%的集合度。

挑选 9 天后，察看 1/4000 孔内有两三个克隆，按比率 1/300 孔内应当有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和保持浓度1，因为基因转染到细胞内以后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以挑选不可以太早；但是也不可以太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所吞没，最后致使挑选不出阳性克隆，一般要在转染24 小时以后才开始加 G418挑选。

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结一、引言简述稳定表达细胞系的重要性和应用领域阐明嘌呤霉素筛选法的原理和优势二、研究背景介绍稳定表达细胞系在生物制药、基因功能研究等领域的作用阐述嘌呤霉素筛选法在细胞系构建中的应用背景三、实验材料与方法详细列出实验所需的细胞株、质粒、嘌呤霉素等材料描述实验的基本流程，包括细胞转染、筛选、扩增等步骤四、嘌呤霉素筛选原理解释嘌呤霉素的作用机制和如何用于筛选稳定表达细胞阐述筛选过程中细胞的选择压力和适应性变化五、实验操作步骤详细描述实验的具体操作步骤，包括细胞培养、转染、筛选等提供实验操作中的注意事项和常见问题解决方案六、筛选效率与稳定性分析通过实验数据展示筛选效率，包括细胞存活率、表达水平等分析细胞系的稳定性，包括长期培养后的表达水平变化七、优化策略与改进措施根据实验结果提出优化筛选条件的建议描述改进措施，如提高转染效率、调整筛选压力等八、实验结果展示实验中获得的稳定表达细胞系的数据和图像分析实验结果，包括成功构建的细胞系数量、表达效率等九、案例研究选取几个典型的案例，详细描述筛选过程和结果分析案例成功或失败的原因，提供经验教训十、问题与挑战列出在筛选过程中遇到的主要问题和挑战分析问题产生的原因，提出解决方案十一、经验总结总结在嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系过程中积累的经验强调实验操作的准确性、条件控制的重要性十二、未来展望根据当前研究趋势，预测稳定表达细胞系构建的未来发展方向提出未来研究中可能采用的新方法和技术十三、结语强调稳定表达细胞系在生物医学研究中的应用价值表达对参与实验的团队成员的感谢十四、参考文献列出实验过程中参考的文献资料十五、附录附上实验操作的详细步骤、实验数据、图表等。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因（2）SHG-44—重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44—vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western—blot）。

（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG—44-vect、SHG-44—重组pcDNA3→单细胞悬液→70％酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。

②细胞生长曲线测定：SHG—44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。

③软琼脂克隆形成率分析:SHG—44、SHG-44—vect、SHG—44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3％低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。

三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA 混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。

用于转染的核酸应高度纯化。

为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。

但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。

2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行.但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分.3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率,但所用培养基必须37℃预温.4、脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入,尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。

常见问题和解答:Q：我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。

A：也不一定。

依据实验目的与要求而定。

如果克隆效率较低的细胞，套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞，就不能保证是单克隆。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418 浓度：1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同，一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为。

2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。

neo 就是编码3 ‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418 。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4 ，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418 的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000 个细胞/ml ，在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范围内进行筛选，选择出在10~14 天内使细胞全部死亡的最低G418 浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x10 6个细胞电转后，分别接种1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300 细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000 孔内应有4% 的汇合度。

筛选9 天后，观察1/4000 孔内有两三个克隆，按比例1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染之后才开24 小时始加G418 筛选。

嘌呤霉素（Puromycin）筛选稳定细胞株的步骤及方法Puromycin 是来源于Streptomyces alboniger 的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选能够表达pac 基因（puror）的细胞。

pac 基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果该基因表达，就会对嘌呤霉素产生抗性，这一特性目前普遍应用于筛选表达pac 基因的哺乳动物稳定细胞株。

目前，很多商业化的慢病毒载体都携带pac 基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，可以利用嘌呤霉素的筛选，得到特定基因稳定表达的细胞株。

嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac 基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。

Puromycin 不仅能用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。

Puromycin 的作用特点是快速作用于细胞，一般2 天内可以杀死99%的不表达pac 基因的细胞。

本产品浓度为10mg/ml，已过滤除菌，可以直接用于细胞培养。

使用说明：一、推荐工作浓度：推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/ml，但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。

二、嘌呤霉素剂量反应曲线的确定( 以shRNA ）转染或者慢病毒感染为例）：：嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。

为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株，确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。

对于初次使用的细胞，一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。

1、第一天：24 孔板中以5~8×10 4 cells/孔的密度接种细胞，接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。

细胞培养箱内培养过夜。

2、第二天：在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基，该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml 等)，更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。

对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。

例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。

用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。

对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。

不同批次的药物活性有一定差异。

因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。

筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。

第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。

2、用G418筛选处理5-10天。

每2天观察细胞一次。

每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。

直到得到最佳浓度。

3、用嘌呤霉素处理4-7天。

每2天跟换新的有抗生素的培养基。

嘌呤霉素筛选原理嘌呤霉素（puromycin）是一种广泛应用于生物学实验室的抗生素，主要用于筛选高效表达外源基因的细胞。

嘌呤霉素通过其独特的机制选择性杀死转染外源基因的细胞，从而筛选出成功表达目标基因的细胞。

下面将详细介绍嘌呤霉素筛选原理。

嘌呤霉素是一种氨基糖苷类抗生素，由Streptomyces alboniger产生。

其结构与核苷酸有一定的相似性，因此可以与核酸结合。

嘌呤霉素的分子结构中包含有嘌呤环和氨基糖苷环两个部分。

嘌呤环可以与核酸中的同源嘌呤碱基形成氢键，而氨基糖苷环则可以与RNA中的A位点形成酯键。

嘌呤霉素的筛选原理主要利用了细胞中的转运机制以及它对细胞翻译的作用。

当目标基因通过适当载体引入到细胞中后，该载体通常带有一个与嘌呤霉素敏感基因连在一起的表达序列。

这个敏感基因通常是某种转录因子，其缺失将导致细胞死亡。

当细胞中成功表达目标基因时，其编码的蛋白质与嘌呤霉素的作用机制相互配合，从而导致细胞的死亡。

具体来说，目标基因的编码蛋白质与细胞内的核糖体结合时，嘌呤霉素的氨基糖苷环与目标基因的A位点形成酯键，导致核糖体解聚，细胞翻译过程终止，从而导致细胞死亡。

然而，嘌呤霉素对细菌、真核生物和原核生物都具有一定的毒性。

为了更好地筛选出真正成功表达目标基因的细胞，通常在培养基中添加一定浓度的嘌呤霉素。

这样一来，只有那些真正成功表达目标基因的细胞才能够在相对高浓度的嘌呤霉素下存活，而其他未表达目标基因的细胞则会因为对嘌呤霉素的敏感性而死亡。

通过嘌呤霉素的筛选原理，可以有效地检测和筛选出成功表达目标基因的细胞，为进一步的实验和研究提供了基础。

另外，嘌呤霉素还可以作为选择性筛选工具，用于分离和培养特定表达基因的细胞系，为生物医学研究和基因工程领域提供了有力的支持。

总结起来，嘌呤霉素筛选原理是通过其结构与核酸的结合，干扰细胞翻译过程，从而选择性杀死未成功表达目标基因的细胞。

该筛选方法提供了一种快速、简便、有效的方法，可以帮助科研人员筛选出成功表达目标基因的细胞，为生命科学研究提供了重要的手段。

嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素是一种广泛用于筛选细胞的抗生素，其作用原理是通过抑制细胞内蛋白质合成来阻止细胞生长。

这种抗生素能够与细胞内的30S亚基结合，从而干扰核糖体的功能，阻止tRNA 与mRNA的结合，进而抑制蛋白质的合成。

嘌呤霉素的结构类似于天然核苷酸腺苷，能够与30S亚基上的16S rRNA发生特异性相互作用。

这种相互作用导致核糖体的构象发生变化，阻止A位和P位之间的正确配对，从而阻碍了多肽链的延伸。

此外，嘌呤霉素还可以诱导mRNA的解聚，导致阅读框架错位，进一步干扰蛋白质的合成。

嘌呤霉素选择性地抑制细菌的蛋白质合成，而对哺乳动物细胞的影响较小。

这是因为细菌和哺乳动物细胞的核糖体结构存在差异，使得嘌呤霉素更容易与细菌的核糖体结合。

这种选择性作用使得嘌呤霉素成为一种常用的细胞筛选工具，尤其适用于筛选抗生素耐药基因以及研究蛋白质合成等相关领域。

综上所述，嘌呤霉素通过干扰细菌细胞内的蛋白质合成过程，阻止细胞的生长和分裂。

其选择性靶向细菌核糖体，使其成为一种常用的细胞筛选工具。

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：尽管在全球范围内努力控制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）的感染，但该病毒持续在全世界的养猪业中引起经济问题。

本研究以PRRSV 全长感染性克隆pJXwn06为模板,利用PCR 方法扩增ORF2基因序列，并克隆至慢病毒载体中，获得重组质粒pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2。

通过慢病毒包装系统获得重组的慢病毒颗粒，并将其转导至Marc-145细胞，用含有嘌呤霉素的培养基进行筛选，初筛后的细胞采用有限稀释法进行克隆，最终获得细胞系，并通过PCR 、Western blot 试验验证了细胞系中GP2蛋白的稳定表达。

本实验成功建立了稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc-145细胞系，为研究GP2蛋白免疫学特性和结构功能奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP2蛋白；细胞系中图分类号：S852.651文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）03-0020-05Construction of a Marc-145 Cell Line Stably Expressing PRRSV GP2 Protein收稿日期：2021-02-03基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目（2020MS03047）作者简介：乌东高娃，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：温永俊，E-mail：******************稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc-145细胞系的构建乌东高娃1，温永胜2，郭 昊1，刘春羽1，赵洪哲，王凤雪1，温永俊1（1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018；2.内蒙古元山生物科技有限公司，呼和浩特010018）2023,31(3):20-24Abstract: Despite global efforts to control the infection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), the virus continues to cause economic problems in the swine industry worldwide. In this study, the PRRSV full-length infectious clone pJXwn06 was used as a template, and the ORF2 gene sequence was amplified by PCR and cloned into a lentiviral vector to obtain the recombinant plasmid pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2. Recombinant lentiviral particles were obtained through the Lentivirus packaging system and were transduced to Marc-145 cells. Then, the cells with the particles were screened with puromycin-containing medium and cloned by the limiting dilution method to fi nally obtain the cell line. As a result, the stable expression of GP2 protein in the cell line was confi rmed by PCR and Western blot. In this experiment, a Marc-145 cell line stably expressing PRRSV GP2 protein was successfully established, which laid a foundation for the study of the immunological characteristics, structure and function of the GP2 protein.Key words: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; GP2 protein; cell lineWUDONG Gaowa 1, WEN Yongsheng 2, GUO Hao 1, LIU Chunyu 1, ZHAO Hongzhe 1,WANG Fengxue 1, WEN Yongjun 1(1. College of V eterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Inner Mongolia Yuanshan BiologicalT echnology Co., Ltd., Hohhot 010018, China)· 21 ·乌东高娃等：稳定表达PRRSV GP2蛋白的Marc-145细胞系的构建第31卷第3期猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，也是全球最重要的动物病原体之一[1-2]。

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。

细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。

嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。

（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。

）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。

）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。

孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。

在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。

嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。

注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。

在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。

调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。

储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。

Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样ＰH会变化很大，至少要用PBＳ。

我是配在HEPＥS溶液中的,具体方法如下：1ｇ包装的G４18瓶子中，加入1０ml HＥPES 溶液，浓度为１00 mｇ/mｌ完全溶解后,0.2２uｍ过滤,－20度保存。

HEPEＳ缓冲液配方如下：90ml水中，0.8 g ＮaCl, 0.037g KCl, 0.0１3５gNa2HPO４.2Ｈ2O, ０．1 g葡萄糖,0．５g HＥＰES，溶解,NaOＨ调PH至7．05,定容至１00ｍｌ。

Gｏod ansｗｅｒ:推荐用HEPES。

特别是当细胞对G41８不敏感,Ｇ４18使用浓度高时，如果用水、PＢS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。

1mｏl/L HEPE Ｓ的简单配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddＨ２Ｏ,用１0moｌ／Ｌ的NaO Ｈ调节ｐH至7.５-8.0，定容至５0ml,０.2２um小滤器过滤。

ＨＥPES最终使用浓度15-20mM。

Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G4１8直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过Ｇ41８杀伤曲线,30０ｕg\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1０00uｇ＼mｌ来筛选,不知是否可行？会不会有什么问题?Ａ: G41８筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至100０cｅll/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0，,１０0, 200,3０0，400,５０0,600,７00，800,9００, 1000，１1.0０ng/ml等１2个级别，培养10-１４天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-8００左右,筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。

我用过Zeｏcｉn，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。