酶分子的改造与修饰
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酶分子的化学修饰
第五章
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
《酶分子的修饰》课件
糖基化修饰通常发生在酶的特定氨基酸残基上，形成N-连 接或O-连接的糖链。糖基化修饰在多种生物学过程中发挥 重要作用，如蛋白质分选和分泌。
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
04酶分子的化学修饰
酶
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
作业题：
1、名词解释：酶分子修饰 2、酶分子的化学修饰方法有哪些？ 3、酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修 饰反应有哪些？ 4、分析说明修饰酶的性质。
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，
作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质， 抑制剂的性质等。
（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心
的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子 等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性 1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂友乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、 2，4-二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和 苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、 甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。
（三）酶蛋白修饰反应的主要类型 酯化及相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 溴化氰裂解反应
第三节 酶蛋白肽链的大分子修饰
一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线 性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体 内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子 的抗原性，被广泛用于酶的修饰。 聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子 被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改 变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的 pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移 率下降等。 主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 嗪法、羰二亚胺法、重氮法。
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
作业题：
1、名词解释：酶分子修饰 2、酶分子的化学修饰方法有哪些？ 3、酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修 饰反应有哪些？ 4、分析说明修饰酶的性质。
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，
作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质， 抑制剂的性质等。
（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心
的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子 等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性 1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂友乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、 2，4-二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和 苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、 甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。
（三）酶蛋白修饰反应的主要类型 酯化及相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 溴化氰裂解反应
第三节 酶蛋白肽链的大分子修饰
一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线 性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体 内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子 的抗原性，被广泛用于酶的修饰。 聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子 被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改 变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的 pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移 率下降等。 主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 嗪法、羰二亚胺法、重氮法。
酶分子的化学修饰
7.4 酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
酶分子的化学修饰
概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的 空间结构发生精细的改变，从而改变酶的 特性与功能的方法。
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
酶分子的改造
酶分子的改造酶应用存在的问题：（1）不稳定、易变性：酶作用的最适PH条件一般在中性，PH值常偏离中性范围，使酶难于发挥作用；（2）具有抗原性：在临床应用上，由于绝大多数的酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注人会引起人体的过敏反应。
解决问题的方法：改变现有酶的特性：（1）通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构；（2）通过生物工程方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。
一、酶分子的修饰。
1、概念：酶分子修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，改造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。
2、酶分子修饰常见的方法。
◆部分水解酶蛋白的非活性主链。
◆利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰。
◆酶辅因子的置换。
3、酶进行化学修饰时的注意事项。
(1)修饰剂的要求：较大的分子质量，良好的生物相容性及水溶性，有较多的反应基团。
(2)酶性质的了解：酶的活性部位，侧链基团的化学性质，最适反应条件。
(3)反应条件的选择：在酶稳定的条件下进行。
二、酶的蛋白质工程。
1、概念：酶的蛋白质工程是指通过基因工程或随机诱变的方式改变编码酶蛋白分子的DNA 序列，从而达到改变酶的生理、生化特性的技术。
2、酶的蛋白质工程常用的方法。
（1）对于一些功能和特性仅仅有蛋白质一级结构中某些氨基酸残基的化学性质决定的酶，可通过基因工程技术直接改变或消除这些侧链来改变原有酶的有关功能或特性；（2）随机诱变编码酶蛋白的基因，然后进行定向的筛选和选择。
3、举例。
◆枯草杆菌蛋白酶：功能：分解蛋白质，可用于去掉衣服上的血渍缺点：在漂白剂的作用下失活（222位的甲硫氨酸易被氧化）。
改造：用丝氨酸或丙氨酸代替其222位的甲硫氨酸，抗氧化能力大大提高。
◆杂交酶：杂交酶是指由来自两种或两种以上酶的不同片段构建成的新型的酶。
利用高度同源的酶进行杂交，可以将它们各自的优势进行互补，使新获得的杂交酶的特性介于其亲本酶的特性之间。
酶分子改造的方法及应用
酶分子改造的方法及应用摘要：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，进入20世纪后，随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的更新，酶制剂的研究得到不断推进并实现了其商业化生产，但直接利用酶制剂时存在酶的稳定性差、使用效率低、不能在有机溶剂中反应等缺点。
通过酶的修饰可提高酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性，使之更适合生产和应用的要求。
近年来发展的蛋白质工程技术则使酶的定向改造成为可能。
随着生物技术的发展，酶工程将引起巨大的变革。
关键词：酶分子修饰蛋白质工程模拟酶引言：近年来，酶工程开始兴起，迅速发展，其研究成果也越来越广泛地运用于各个领域。
虽然如此，但是由于酶一离开其特定的环境条件就会变得不太稳定，不适合大批量生产的需求，因此，大规模应用酶和酶工艺的还不多。
在工业应用中，底物及产物带来的影响常常导致pH偏离酶作用的最适条件的中性范围，使酶难以发挥作用。
在临床应用上，绝大多数酶对人体而言都是外源蛋白质，具有抗原性，直接注入会引起人体的过敏反应。
所以人们希望能够通过各种人工方法改造酶，使其更能适应各方面的需要。
1.酶分子改造的方法1.1酶分子修饰酶分子修饰[1]（Modification of Enzyme Molecule）即通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程。
酶分子修饰在提高酶的活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、研究各种物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探讨酶分子的结构与功能之间的关系等方面具有重要意义。
1.1.1酶分子的主链修饰酶分子的主链修饰[2]就是利用酶分子主链（肽链或核苷酸链）的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
1.1.1.2主链的切断修饰[3]主链断裂后，引起酶活性中心的破坏，酶的催化功能丧失（用于探测酶活性中心的位置）。
酶活性中心的空间构象维持不变，酶的催化功能也可以保持不变或损失不多，但是抗原性有发生改变。
酶的化学修饰法
酶的化学修饰方法通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶分子的目的。
这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。
PEG化修饰聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。
1977 年 Abuchowski等[1]率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期大大延长, 且无免疫原性。
其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。
PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。
活化的方法如图1所示.图1聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物,其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。
姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示.Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示.[1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach mentof polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581.[2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352.[3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135.[4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese).(姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.)[5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.。
酶分子修饰
3. 巯基（—SH）修饰 巯基在酶蛋白中的来源是 Cys 的残基侧链，巯基的亲核性强， 往往是酶分子中最容易反应的侧链基团之一，在维持蛋白亚基之间 的相互作用和酶催化过程中起重要作用。 巯基容易被氧化成 —S—S—
常用的巯基修饰剂： 烷基化试剂；马来酰亚胺；有机汞试剂； 5-5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂）
三氯均三嗪 法
第三节
侧链基团修饰的作用
Hale Waihona Puke 侧链基团修饰采用一定的（化学）方法，使酶蛋白侧链基团发生改变，从而 改变酶催化特性的修饰方法。
用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和 功能的影响。 1. 荧光试剂修饰侧链，了解酶在水溶液中的构象； 2. 各基团对酶结构和活性的影响，研究必需基团的组成； 3. 对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底 物的束缚能力； 4. 利用侧链修饰测定某种基团在酶分子中的数量； 5. 改变酶的结构和催化性能。
侧链基团修饰
1. 氨基（—NH2）修饰
氨基修饰剂作用于侧链上的氨基，产生脱氨基作用或与氨基共价结 合，将氨基屏蔽。
氨基修饰剂：2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）、2,4-二硝基氟苯 （DNFB）、丹磺酰氯（DNS） 1.1氨基的烷基化
2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）
准确测定酶蛋白中赖氨酸的数量
1.修饰剂的选择 根据酶的分子结构和修饰剂的特性，选择水溶性大分子。 生物相容性好、抗原性弱、无毒。 右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）、肝素、蔗糖聚合物等 2.修饰剂的活化 使大分子中所含的基团在用前需活化后，活化后的基团才能在一 定条件下与酶分子某侧链基团反应。
3.修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以 一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间， 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶 分子进行修饰。 4.分离 不不同酶分子的修饰效果往往不同，需要通过凝胶层析等方 法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较 好修饰效果的修饰酶。
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第四章 酶分子的改造和修饰
易错PCR 技术
如：在非水相（二甲基甲酰铵, DMF）溶液中定向进化枯 草杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在 60%和85%的DMF中, 催化效率kcat/Ki分别是野生 酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行 两个循环的定向进化, 产生的突变体13M的kcat/Ki比 PC3高3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属 于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、耗 时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）.
第四章 酶分子的改造和修饰
定向进化的选择策略
1.易错PCR 技术 2. DNA改组
第四章 酶分子的改造和修饰
1.易错PCR 技术
定义：从单一基因出发，通过改变PCR反应条 件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错 误而引起基因突变。 过程：双链DNA变性（解链；85－95℃） 引物与单链DNA结合（退火；50－ 70℃ ） 引物延伸（半保留复制；70－75℃ ）
第四章 酶分子的改造和修饰
进化酶基因测序结果表明共发生了7个碱基突变，其中3 个点突变引起了氨基酸的改变：Asn217Lys， Thr233Arg，Val367Gly（缬氨酸、甘氨酸）。 Thr（苏氨酸）位于亚基间相互作用的界面上，距离 Lys3271．5nm以内，推测突变后的Arg与底物α— COOH的碳基氧作用，一方面进一步加强了酶与底物的 亲和力，另一方面更加稳定了负碳离子中间体．从而引起 了进化酶K m的下降和Kcat值的提高。
第四章 酶分子的改造和修饰
一、基本原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有
3’→ 5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向 目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法， 选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于 环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化 而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制 下进行的
另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时， 其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力， 其稳定性也就增加了。
第四章 酶分子的改造和修饰
五、大分子结合修饰
共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通 过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低 或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长 了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使 酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达 到原有酶活力的5.1倍
第四章 酶分子的改造和修饰
1.基因修饰技术
（1）定位突变技术
蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密 码决定的，只要改变其中的第一、第二 个（或两个）就可以改变氨基酸。 噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在 噬菌体质粒中其基因组为单链，侵入宿 主细胞以后，通过复制以双链形式存在。 将待研究的基因插入载体M13，制得单 链模板，人工合成引物，合成相应的互 补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。 经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别 复制，因此就得到两种类型，含错配碱 基的就为突变型。再转入合适的表达系 统合成突变型蛋白质。
第四章 酶分子的改造和修饰
DNA改组
该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的 机会, 导致更大的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体.
第四章 酶分子的改造和修饰
二、定向进化的用
1.提高酶分子的催化活力 2.提高酶分子的稳定性 3.适应人工环境中提高酶活力或稳定性 4.提高读物转移性和增加对新底物催化活力 5.对映体选择性的定向进化 6.变换催化反应的专一性
第四章 酶分子的改造和修饰
1.提高酶分子的催化活力
L天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马 酸和氨生成L-天冬氨酸。L-天冬氨酸在医药、食 品、化工等领域具有非常广泛的用途。由于天冬氨 酸酶的活性部位尚未完全确定，催化机理也需进一 步证实，在这种条件下通过酶的合理化设计来进一 步提高酶活力具有一定困难。为此，采用定向进化 的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。
条件：降低PCR中DNA复制的精确度 采用Taq DNA聚合酶 添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性） 替代Mg2＋（稳定非互补的碱基对） 调整4种底物的浓度使不平衡 （dATP/dTTP/dCTP/dGTP)
第四章 酶分子的改造和修饰
由于Taq DNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会 大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右； 加入dTTP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水 平，采用这种方法可以将错配率提高到最高达每5 个碱基对1个突变。 当然，错配率并不是越高越好，一般认为，理想 的突变频率为每个基因1.5~5个点突变。
酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。
定点修饰。
第四章 酶分子的改造和修饰
四、亲和标记修饰
亲和标记：指亲和试剂只与作用部位的特定 基团发生作用，而不与作用部位以外的同类 或其它基团发生作用。
亲和标记修饰：借助亲和作用对目的分子进 行标记的方法。先将能与蛋白质亲和的分子 (如底物、抗原等)与目的蛋白活性部位特异 性、非共价键、可逆性结合，再通过具体的 化学反应使亲和分子上的活性基团共价结合 到活性部位附近的氨基酸残基上。
第四章 酶分子的改造和修饰
亲和标记修饰
例如，对以芳香族氨基酸为特异的基质的胰凝乳 蛋白酶，用基质类似物的TPCK（L-1-甲苯磺酰 胺-2-苯乙基氯甲基酮）与之反应，则TPCK在苯 丙氨酸之侧链部分与胰凝乳蛋白酶进行特异的结 合，与氯化甲酮部分反应，这使在活性部分存在 的组氨酸残基有选择地烷基化。
天然SOD 右旋糖酐-SOD
Ficoll(低分子量)–SOD
Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
14
24 35
h
h h
140
240 350
第四章 酶分子的改造和修饰
第二节 酶分子定向进化p96
一、基本原理 二、定向进化的应用
第四章 酶分子的改造和修饰
酶分子定向进化
不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地 创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重 组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出 所需性质的突变酶。
第四章 酶分子的改造和修饰
1.基因修饰技术
(2)盒式突变技术
盒式突变1985年Wells提出的一种 基因修饰技术——盒式突变，一次可 以在一个位点上产生20种不同氨基酸 的突变体，可以对蛋白质分子中重要 氨基酸进行“饱和性”分析。 利用定位突变在拟改造的氨基酸密码 两侧造成两个原载体和基因上没有的 内切酶切点，用该内切酶消化基因， 再用合成的发生不同变化的双链DNA 片段替代被消化的部分。这样一次处 理就可以得到多种突变型基因。
于是采用盒式突变技术，每5 个氨基酸取代的质粒进行一 组实验，4 组实验就将其余19 种氨基酸分别取代Met 一222 ，得出最佳实验结果。
第四章 酶分子的改造和修饰
二、酶法有限水解
用适当的方法将酶蛋白肽链进行有限水解，既可保留或增 强酶的活性又可降低其抗原性，对蛋白酶的应用极为有利。 体内酶原的激活便是一种自发的有限水解修饰。在体外也 可使肽链水解，以达到修饰的目的。 例：胰蛋白酶原用蛋白酶修饰除去一个六肽，即可显示出 催化活力。
天冬氨酸酶用胰蛋白酶水解，切去C端十多个氨基酸的肽 段后，活力提高4.5倍。
除去一部分氨基酸或肽段，可使酶的空间构型发生某些细 微的变化从而提高酶的催化能力。
第四章 酶分子的改造和修饰
三、氨基酸置换修饰
酶的催化能力极其稳定性主要依赖于酶的空间结构，酶蛋 白的空间结构主要靠副键（二硫键、盐键、酯键、疏水键 和范德华力等）来维持，而各个副键的的形成是由不同的 氨基酸所带基团决定的。
第四章 酶分子的改造和修饰
五、大分子结合修饰
非共价修饰
使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶 的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通 过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部 水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能 通过调节酶的微环境来保护酶的活力。
如半胱氨酸残基上的巯基可形成二硫键，碱性氨基酸残基 上的氨基和酸性氨基酸的羟基可形成盐基等。
若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则可能引 起酶蛋白空间结构的某些改变。这种修饰方法成为氨基酸 置换修饰。
第四章 酶分子的改造和修饰
氨基酸置换 化学修饰：难度大，成本高，专一性差，而且要对
第四章 酶分子的改造和修饰
改变酶特性的方法
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天 然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而 达到改造酶的目的。
第四章 酶分子的改造和修饰
一、采用蛋白质工程技术修饰酶
1.基因修饰技术 （1）定位突变技术 （2）盒式突变技术 2.蛋白质工程修饰酶分子
第四章 酶分子的改造和修饰
酶分子体外定向进化原理