下载文档原格式
原代培养：清洁级180-220g SD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜2~3遍，然后将血管切成约1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3~4小时后翻转，于37% 5%CO2的细胞培养箱中静置3天(静置期间不许震动或移动培养瓶, 以防刚贴壁的组织细胞块脱落)，然后每2天换液。
一般4~7天左右平滑肌细胞从组织块中爬出，2~3周出现致密细胞层。
待细胞快融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3-8代细胞做实验。
细胞传代：将原代细胞培养瓶中的培养液吸出, 加D-Hanks液到瓶中清洗细胞表面2次。
弃掉清洗液，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml, 将消化液均匀覆盖细胞表面，消化时间为2~4 min。
这时在倒置显微镜下观察, 可见细胞成片皱缩变圆，细胞边缘折光增强。
在细胞未脱落前倒去消化液，立即加入血清或含血清的培养基以终止消化。
然后用滴管将细胞从培养瓶壁上轻轻反复吹打下来。
然后根据细胞密度, 以1: 2~4分瓶培养。
每2~3天换液, 待细胞生长到接近融合时(一般为7~10天)再传代。
hpsusan2006 wrote:我们培养血管平滑肌采用的也是组织块法，尝试想用消化酶消化老养不成，但组织块法从组织块爬出细胞挺费时间，要好几个礼拜，一旦细胞传代后速度就快了，方法和上面说的差不多（北国木棉）但是我们胰酶浓度用的0.2％的，可供大家参考，还用双抗液用的浓度100U/ml。
下面是一张组织块周围爬出的细胞。
我现在的方法是组织块法，效果还是理想的。
就我的经验而言，一般5－7天细胞就可以从组织中爬出来了。
但是那些一开始取材时就游离出来的细胞倒是最快长成集落（一般3到4天）。
有几点我个人的经验：1.取材要熟练，尽量缩短时间，如果可以把从取材到铺瓶的时间缩短到15分钟以内，那么最终的成功率会比较高。
时间拖得越长，最终的细胞长出来的时间越是慢甚至最后会失败。
槲皮素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞的保护作用王志新;马钊;邓同兴;闫志勇;常成;张勤安;高晓群【期刊名称】《河南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(032)002【摘要】目的研究槲皮素对过氧化氢损伤的大鼠胸主动脉内皮细胞的保护作用.方法体外培养大鼠胸主动脉内皮细胞,用过氧化氢诱导血管内皮细胞损伤,观察槲皮素对大鼠胸主动脉内皮细胞存活率的影响,测定培养液中NO、MDA、SOD的水平.结果过氧化氢对血管内皮细胞具有损伤作用,20~80 μmol/L的槲皮素可浓度依赖性保护血管内皮细胞,升高细胞培养液中NO水平,降低MDA含量,提高SOD活力.结论槲皮素可保护过氧化氢损伤的血管内皮细胞,其保护作用与促进血管内皮细胞释放NO、抑制脂质过氧化以及抗氧化有关.【总页数】4页(P125-128)【作者】王志新;马钊;邓同兴;闫志勇;常成;张勤安;高晓群【作者单位】郑州大学基础医学院,人体解剖教研室,河南,郑州,450052;郑州大学基础医学院,人体解剖教研室,河南,郑州,450052;漯河医学高等专科学校,人体解剖教研室,河南,漯河,462002;郑州大学基础医学院,人体解剖教研室,河南,郑州,450052;郑州大学基础医学院,人体解剖教研室,河南,郑州,450052;郑州大学基础医学院,人体解剖教研室,河南,郑州,450052;郑州大学基础医学院,人体解剖教研室,河南,郑州,450052【正文语种】中文【中图分类】R932【相关文献】1.黑莓花色苷对过氧化氢诱导血管内皮细胞损伤的保护作用 [J], 张丽霞;周剑忠;黄开红;顾振新2.淫羊藿苷对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用 [J], 魏文华;胡欣;贺莉3.槲皮素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞周期及NO水平的影响 [J], 林蓉;刘俊田;李旭;陈葳;杨玉琮;程小丽4.榅桲总黄酮对过氧化氢诱导人脐静脉血管内皮细胞氧化损伤的保护作用研究 [J], 古再努尔·买买提;阿尔孜古丽·吐尔逊;阿迪力·阿不都热合曼;周文婷;邬利娅·伊明;艾尼瓦尔·吾买尔5.福建养殖仿刺参抗氧化多肽的酶解工艺优化及其对过氧化氢诱导的血管内皮细胞EA.hy926损伤的保护作用 [J], 潘南;吴靖娜;苏永昌;陈贝;苏捷;郑昇阳;刘智禹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。
方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。
结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。
结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。
大鼠血管内皮细胞培养研究血管内皮细胞是血管中重要的细胞类型，其在维护血管生理特性以及参与血管病理反应中都具有重要的作用。
大鼠作为实验动物，其血管内皮细胞的研究也是非常重要的。
在这篇文章中，我们将重点介绍大鼠血管内皮细胞的培养技术及其在血管生物学研究中的应用。
一、大鼠血管内皮细胞培养技术1.1 资源准备大鼠动脉、静脉组织、FBS、DMEM/F12、胰酶、胰酶抗性味粉、细胞凝集素、槲皮素、PBS、二氧化碳培养箱、显微镜、离心机、相位对比显微镜、细胞均质器等。
1.2 组织消化将新鲜的大鼠动脉或静脉取出，去除外膜及脂肪组织，用PBS缓冲液清洗数次。
接着，用胰酶液消化组织，割碎后转移到消化液中，37℃孵育1-2小时，直到组织消化完全。
1.3 筛选基质消化完全的组织过筛，筛子孔径为80目。
去掉筛子上的淋渣后，产出的细胞可以用显微镜观察并鉴定是否为血管内皮细胞。
1.4 细胞培养将产出细胞悬浮在完全培养基（DMEM/F12，10% FBS，100ug/mL嘌呤鸟嘌呤，100ug/mL青霉素和50ug/mL链霉素）中，在培养室内孵育。
按细胞密度不同，可选用不同的培养方法，比如单细胞悬浮培养、半贴壁培养和全贴壁培养等。
1.5 纯化细胞如果需要纯化大鼠血管内皮细胞，还需要使用血管壁内形成的凝集素贴壁分离技术，配合药物槲皮素进行消除非内皮细胞。
二、大鼠血管内皮细胞在血管生物学研究中的应用2.1 血管内皮损伤与修复在血管损伤修复研究中，常常会使用拉环法、加热法、切割法、放置血栓等手段产生不同程度的血管内皮损伤模型，进而观察、探究血管内皮细胞的响应和修复机制。
例如研究大鼠颈动脉内皮细胞在内膜损伤后的DNA修复机制是一个非常热门的研究课题。
2.2 血管疾病如高血压、动脉硬化、心血管疾病等，都与血管内皮细胞的损伤和功能异常有关。
通过培养大鼠血管内皮细胞，可以模拟这些血管疾病模型，如在培养基中将NO剂加入，从而模拟高血压或将脂质压入细胞内，模拟动脉硬化等，可以帮助我们更好的探究血管疾病的病理生理机制。
-596•安徽医科大学学报Ada Unwersitatis Medicinalis Anhut2621Apr；56(4)网络出版时间：2621-3-116：50网络出版地址：https：//k/ki.3W/kcms/dwPH34.1025.R.26216317.1521.html大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养刘倩，韩陈陈,罗婷婷，张雨，李浩，马场，魏伟摘要目的体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型。
方法无菌取大鼠股动脉血管，胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD30阳性细胞，并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-C法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力，以法、Mv/gW胶法检测其迁移和成管功能。
结果胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在2627-29-17接收基金项目：国家自然科学基金（编号：51562123、51330051、51273444）作者单位:安徽医科大学临床药理研究所，合肥230234作者简介:刘倩，女,硕士研究生；魏伟，男，博士，教授，博士生导师，责任作者,E-mVi：wwei@ahmu.efu.ch；马场，女，博士，副教授，责任作者，E-mail:mayane_ahmu@ 14~16d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上，细胞呈现典型铺路石状。
流式检测其纯度为3&34%,分选后利用CD30进行荧光染色鉴定，细胞均为CD30阳性；PGE3可显著上调CD30阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能。
结论该研究采 用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型。
关键词大鼠;股动脉;原代血管内皮细胞;分离培养;鉴定中图分类号R394.26；R322.120文献标志码A文章编号1000-1492（2620）04-0566-05 doi：r6.19465/p cnki.isspl000-0492.2621.04.hl7根据血管的结构、功能和运输方向差异,分为动脉、静脉和毛细血管。
大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养技术发表时间：2014-12-26T14:14:42.107Z 来源：《医药前沿》2014年第23期供稿作者：杨帆[导读] 原代培养5～7 d后，可见细胞从组织块边缘爬出，逐渐长成梭形或多角形。
杨帆(安徽医科大学第一附属医院儿科安徽合肥 230032)【摘要】目的建立有效、易行、成本低的血管内皮细胞培养方法。
方法取幼鼠胸主动脉，分别用酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法、瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞，消化、传代，观察细胞形态，VIII因子相关抗原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，确定建立动脉内皮细胞体外细胞模型的最有效、易行的培养技术。
结果瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞的细胞纯度和细胞活力都远较酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法高。
结论瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞可获取数量多、纯度高、活性好的细胞，是大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养最有效、易行的培养技术。
【关键词】大鼠主动脉内皮细胞培养【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）23-0038-01血管内皮细胞为覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞，不仅是血液和组织的屏障，还具有减少血管通透性、抗血栓、调节血管平滑肌功能、抑制壁细胞的游走和增殖的作用，内皮细胞功能的改变是血管性疾病的重要环节，因此建立有效的血管内皮细胞培养方法有助于众多与血管相关疾病的研究。
1 材料与方法1.1实验动物:体重100-130 g雄性4-5周龄SD大鼠，SPF级。
1.2瞬间热处理植环法原代培养大鼠内皮细胞1%明胶包被培养皿，4℃过夜后PBS冲洗培养皿，置培养箱2h备用。
取材前30 min，大鼠腹腔注射肝素钠800 u/kg。
处死大鼠，75%乙醇浸泡5分钟灭菌。
准备培养皿A，加入4℃PBS液，培养皿B加入预温过的培养液。
取胸主动脉并放入培养皿A中，去除血管外的脂肪、结缔组织、动脉分支，PBS冲洗血管。
以血管钳将血管两端结扎，置60℃无菌水中停留2S后取出至B皿。
将血管切成1 mm厚度的血管环，移至明胶包被过的培养皿，每皿20-25个血管环，血管轴垂直于培养皿底，置培养箱干培养2h后加入培养液3ml。
静置培养72h后，去除血管环，部分换液继续培养。
1.3传代培养原代细胞培养10-14d后，细胞汇合成单层。
PBS冲洗2次后加0.25% 胰蛋白酶室温消化约1 min。
当镜下见细胞连接松解时加等体积含胎牛血清的DMEM液终止消化，吹打细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL新的培养液，吹打混匀，(2-3)×105个/皿的密度接种到培养皿中，继续培养，每3d换液一次。
1.4内皮细胞鉴定—SP法VonWillebrand Factor/Ⅷ因子相关抗原位于内皮细胞胞浆是内皮细胞的可靠标记物[1]。
方法如下:内皮细胞接种于盖玻片，约24-48h待细胞爬满玻片，弃培养液，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗5 min×3次；0.2%TritonX-100，室温下渗透20 min；PBS洗5 min×3次；3%H2O2孵育15 min；羊血清室温阻断15 min，弃血清勿洗，加入鼠Ⅷ因子相关抗原抗体，4℃过夜；PBS洗3 min×3次；滴加二抗（羊抗兔），室温15 min；PBS洗3 min×3次；加S-P复合物，室温15 min；PBS洗3 min×3次，培养孔中滴加DAB显色剂，约5～30 min后ddH2O快速中止反应；自来水冲洗、脱水、透明、封片。
2 实验结果原代培养5～7 d后，可见细胞从组织块边缘爬出，逐渐长成梭形或多角形。
10-14 d后细胞生长融合，呈单层铺路石镶嵌状排列生长。
传代培养的细胞0.5 h开始贴壁，2 h后约90 %的细胞贴壁，3-4d细胞汇合成单层。
用免疫细胞化学S-P法检查Ⅷ因子相关抗原，镜下内皮细胞胞质呈棕黄色，即呈阳性反应，证明其为内皮细胞，非内皮细胞及空白对照组无此着色。
3 讨论血管内皮细胞的原代分离与培养是研究其分子生物学特性及相关疾病的重要前提，但其对生长环境营养要求高，易老化[2]，冻存后复苏难，故建立简单、有效、可重复的培养方法非常必要。
大鼠来源丰富，价格低廉，取材方便，探索大鼠主动脉内皮细胞的培养方法具有重要的意义。
目前较为常见的培养方法有酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法、瞬间热处理植环法等[3-5]。
本研究中发现:常用酶消化法有两种:1.在动脉腔内注入消化酶；2.将动脉内膜外翻，放入消化液中消化。
大鼠主动脉直径细，不易将内膜翻出，且分支多，不易结扎封闭管腔，酶难以在血管内有效保留进行消化。
此方法主要用于大血管内皮细胞的培养，操作复杂、技术要求较高，消化时间长短不易掌握。
机械刮取法:即在内膜外翻后借助剪刀或刀片刮取细胞。
常与酶消化法结合。
但大鼠动脉细，外翻过程中对内皮细胞损伤已较大，机械刮取后严重影响细胞活性，故培养效果不佳。
组织块贴壁法与平滑肌细胞培养方法相似[6]，将血管剪成1-2mm2小块，内膜向下贴壁于培养皿中，但易混杂平滑肌细胞降低细胞纯度；且将血管剖开剪碎的过程中易损伤细胞，较大的组织块在加培养液及移动培养皿过程中易漂浮，不易贴壁，而较小的组织块需更多的机械分割，对细胞的损伤作用大。
本研究最终选用的植环法具有相对简单、经济、细胞损伤少的优点。
操作所需时间少，所需步骤少，可减少内皮细胞受到的损伤；不仅可利用内皮细胞迁出比非内皮细胞快的特点[7]纯化细胞，瞬间热处理法能显著减少成纤维细胞及血管平滑肌细胞混入生长的几率，提高细胞纯度。
Diglio[8]等在动脉环培养血管形成实验中曾用70%乙醇固定血管外膜来纯化细胞。
本实验中发现，由于大鼠主动脉分支多，乙醇易与血管内膜面相接触，会影响到内皮细胞活性。
而瞬间热处理法使外膜细胞受抑制，血管内腔面没有直接暴露于热水中，且短时间内不致使热传导至血管内膜面，因此内皮细胞活性不受影响，而杂细胞的迁出率明显减低。
结论本研究通过将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行环块植入法获取血管内皮细胞，结果发现血管内皮细胞呈现接触性抑制的“鹅卵石”样特征，其标志物vWF 表达阳性，细胞纯度较高。
此方法的优势在于:1.提高了细胞纯度。
对动脉外膜做瞬间热处理后大大抑制了其他细胞如成纤维细胞等的混入。
2.减低对内皮细胞的损伤:本方法无需酶的消化，无需机械刮取，大大减低了原代取材中对内皮细胞的损伤。
3.降低污染几率:本方法操作简单，并能获取大量细胞，故有效避免多次试验操作中可能造成的污染。
参考文献[1]Mcguire P，Orkin R. Isolation of rat aortic endothelial cells by primary esplant technique and phenotypic modulation by defined substrata [J].Lab Invest，1987； 57: 94-105.[2]Gordon EL，Danielsson PE， Nguyen TS，et al. A comparison of primary cultures of rat cerebral microvascular endothelial cells to rat aortic endothelial cells [J]. In Vitro Cell Dev Biol，1991 Apr，27A (4): 312-326.[3]Krause P，Markus PM，Schwartz P，et al. Hepatocyte-supported serum-free culture of rat liver sinusoidal endothelial cells [J].J Hepatol，2000，32(5):718-726[4] Cai W，Liang L，Ji P，et al.Experimental study on culture method of human umbilical vein endothelial cells [J]. Chinese Journal of Respi-rative and Reconstau ctiner surgery，2011，25(2):139-143[5] Kajimoto K，Hossen MN，Hida K，et al. Isolation and culture of mic-rovascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adi-pose tissues[J].J Immunol Methods，2010，357(1-2):43-50[6]林京，张子力.改良植块贴壁法建立大鼠主动脉平滑肌细胞体外培养模型 [J]. 中国病理生理杂志，2006；22 (4) : 827—829.[7]Suh SH，Vennekens R，Manolopoulos V G，et al.Charac2 terisation of explanted endothelial cells f rom mouse aorta:elect rophysiology and Ca2+ signalling [J]. Pflügers Arc2 Eur J Physiol，1999，438: 612.[8]Diglio CA，Grammas P，Giacomelli F，et al. Angiogenesis in rat aorta ring explant culture[J]. Lab Invest，1989；60 (4).。
