MARCKS磷酸化对冷刺激诱导人气道上皮细胞MUC5AC分泌的影响

正常的黏液分泌是气道防御的屏障，但对于支气管哮喘（简称哮喘）患者而言，黏液的过度分泌导致黏液纤毛清除系统功能失常和局部防御功能损害，从而引起呼吸道反复感染。

感染和黏液高分泌互为因果，加速了疾病的发展，加重了疾病的病残率和病死率［1-2］。

而冷空气Menthol enhances interleukin-13-induced synthesis and secretion of mucin 5AC in human bronchial epithelial cellsZHANG Mingyang,WANG Jing,LI MinchaoDepartment of Respiratory Medicine,Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China摘要：目的研究白细胞介素-13（IL-13）联合薄荷醇对人支气管上皮细胞（16HBE ）黏液蛋白（MUC ）5AC 合成及分泌的影响，并探索瞬时受体电位通道（TRP ）melastatin 8（TRPM8）和抗凋亡因子B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）在此环节中所起的作用。

方法将16HBE 细胞分为：对照组、IL-13组（培养基加入终浓度10ng/mL 的IL-13连续刺激）、薄荷醇组（于第6天加入1mmol/L 薄荷醇刺激）、IL-13+薄荷醇组（IL-13连续刺激6d 后加入1mmol/L 薄荷醇刺激），观察各组MUC5AC 表达量、胞内Ca 2+浓度和Bcl-2表达；予以Bcl-2抑制剂ABT-263、TRPM8离子通道特异性抑制剂BCTC 干预，观察两者对各组MUC5AC 的影响及BCTC 对胞内Ca 2+浓度、Bcl-2表达的影响。

CCK-8法检测细胞活力，流式细胞术检测各组细胞内Ca 2+荧光强度，实时荧光定量PCR 检测MUC5AC 及Bcl-2mRNA 水平，酶联免疫吸附法检测培养液中MUC5AC 含量。

气道黏液高分泌机制的研究进展陈玉梅;童瑾【摘要】气道黏液高分泌主要表现为气道黏液理化性质的改变,包括以MUC5AC 为主的黏液组分改变和由黏液腺细胞为主过渡到以杯状细胞为主的分泌黏液细胞的改变.香烟烟雾为主的吸入性有害物和细菌感染是诱导气道黏液高分泌的主要刺激物,而热休克蛋白、信号传导通路和黏蛋白MUC5AC表达的增加是气道黏液高分泌的主要机制.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2016(036)011【总页数】5页(P1573-1577)【关键词】气道黏液高分泌;慢性气道炎性反应;黏蛋白【作者】陈玉梅;童瑾【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010【正文语种】中文【中图分类】R562人体气道黏液是一种非均一、黏弹性的黏性胶，由气道上皮细胞、黏膜下腺体和肺泡上皮分泌组成，水分95%以上，其余由蛋白质(3%)、脂质(1%)和矿物质(1%)组成。

黏蛋白是气道黏液大分子的主要组成部分，由MUC基因编码的富含丝氨酸苏氨酸的高分子量糖蛋白构成[1]。

人类基因组中至今发现21种黏蛋白，根据其结构和功能可分为两个家族即分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白[2]。

MUC5AC作为气道黏液中最为重要的黏蛋白，表达于正常气道上皮的杯状细胞具有保护和润滑上皮、防御外来刺激物和阻止细菌在气道的植入及增殖等作用。

正常生理情况下，气道黏液是由黏膜下层的黏液腺、杯状细胞以及气道上皮细胞所分泌。

黏液腺细胞主要分布在有软骨支撑的大气道。

健康人群气道的杯状细胞数量较少，仅占浅表上皮的5%～25%，主要分布于气管、支气管和细支气管，少见于直径小于2 mm的远端细支气管。

但病理情况下，如吸烟、感染和氧化应激等多种引起慢性气道炎性反应时，杯状细胞较正常时增加可达30倍[3]。

2.1 香烟烟雾等吸入性有害物质对气道黏液高分泌的影响烟雾中的丙烯醛、乙醛等刺激物通过上呼吸道吸收使炎性反应细胞在气管、支气管壁和肺泡内大量聚集，中性粒细胞向气道转移。

麻黄碱对TNF-α诱导人支气管上皮细胞eotaxin表达的影响李中燕;邓俊;熊彬;熊瑛;王宋平【摘要】目的：观察麻黄碱对肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）诱导的人支气管上皮细胞（16HBE）中嗜酸性粒细胞趋化因子（eotax‐in）表达的影响，探讨中药麻黄治疗哮喘的机制。

方法将体外培养的16HBE细胞随机分为对照组、TNF‐α刺激组（TNF‐α20 ng／mL）、TNF‐α＋麻黄碱组（TNF‐α20 ng／mL＋麻黄碱300μg ／mL），每组细胞均设3个复孔培养18 h；荧光定量PCR检测各组细胞eotaxin mRNA的表达；免疫细胞化学染色法和Western blot检测各组细胞eotaxin蛋白的表达；双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组细胞培养上清液中eotaxin的浓度。

结果与对照组比较，TNF‐α刺激组上皮细胞eotaxin mRNA及蛋白表达、细胞培养上清液中eotaxin的浓度明显增高，差异均有统计学意义（P＜0．01）；与TNF‐α刺激组比较，TNF‐α＋麻黄碱组以上各项指标均明显降低，差异有统计学意义（P＜0．01）。

结论麻黄碱能抑制前炎症因子TNF‐α诱导的16HBE中eotaxin的表达及分泌，这可能是中药麻黄治疗哮喘的机制之一。

%Objective To observe the effect of ephedrine on the expression of eotaxin in human bronchial epithelial cells (16HBE) stimulated by tumor necrosis factor‐α(TNF‐α) and to explore the mechanism of Chinese medicine ephedra in treating asthma .Methods The in vitro cultured 16HBE were randomly divided into the control group ,TNF‐αstimulationgroup(TNF‐α20 ng/mL) and TNF‐αplus ephedrine group (TNF‐α20 ng/mL plus ephedrine 300 μg/mL) .Three complex holes in each gr oup were set to culture for 18 h ,the eotaxin mRNA expression was measured by real time fluorescent quantified PCR and protein level was detected byimmunocytochemical stain and Western blot .The eotaxin concentration in cells culture supernatant was quantified by ELISA .Results Compared with the the control group ,the expression level of eotaxin mRNA andprotein ,and the concentration of eotaxin in cell culture supernatant in the TNF‐α stimulation group were increased obviously ,there being statisticaly significant difference between them(P<0 .01);however ,all above these parameters in the TNF‐αplus ephedrine group showed decreased obvi‐ously as compared with the TNF‐αgroup ,the difference between them was statistically significant (P<0 .01) .Conclusion Eph ed‐rine can inhibit the expression and secretion of eotaxin in TNF‐α induced 16HBE inflammatory model ,which may be one of the mechanisms of Chinese medicine ephedra in treating asthma .【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2016(045)008【总页数】3页(P1016-1018)【关键词】麻黄碱;哮喘;支气管上皮细胞;嗜酸性粒细胞趋化因子【作者】李中燕;邓俊;熊彬;熊瑛;王宋平【作者单位】四川省达州市中心医院呼吸内科 635000;泸州医学院附属医院呼吸内一科，四川泸州646000;泸州医学院附属医院呼吸内一科，四川泸州646000;泸州医学院附属医院呼吸内一科，四川泸州646000;泸州医学院附属医院呼吸内一科，四川泸州646000【正文语种】中文【中图分类】R562.2中药麻黄是中医用于治疗咳喘病之要药，近年来人们对麻黄所含成分、药理作用进行了深入研究，其中麻黄碱是其平喘的主要成分，但其平喘机制尚未完全阐明[1-2]。

㊃综述㊃D O I :10.3760/c m a .j.i s s n .1673-436X.2014.04.018作者单位:646000泸州医学院附属医院呼吸内科通信作者:王荣丽,E m a i l :s c yb w r l @s i n a .c o m 黏蛋白MU C 5A C 与肺部疾病的研究进展杜丽君 王荣丽ʌ摘要ɔ 黏蛋白是由气道上皮杯状细胞和黏膜下层的黏液细胞分泌的一种高相对分子质量糖蛋白㊂MU C 5A C 作为气道黏液中最为重要的黏蛋白,起保护和润滑上皮作用,可防御外来具有生物活性的刺激物质,阻止细菌在气道植入和生长,参与上皮生长㊁更新和分化,细胞识别和信号传导等㊂众多研究表明,MU C 5A C 与肺部疾病如支气管哮喘㊁C O P D ㊁弥漫性泛细支气管炎㊁支气管扩张㊁肺癌㊁肺囊性纤维化等有着密切的关系㊂随着对其研究的深入,MU C 5A C 将有望成为新药作用的靶点,在肺部疾病的治疗方面发挥着重要作用㊂本文就MU C 5A C 的种类㊁结构㊁信号传导通路与肺部疾病的关系进行综述㊂ʌ关键词ɔ MU C 5A C ;哮喘;慢性阻塞性肺疾病;弥漫性泛细支气管炎;支气管扩张;肺癌;肺囊性纤维化R e s e a r c h p r o g r e s so f M U C 5A Ci nl u n g di s e a s e D uL i j u n ,W a n g R o n g l i .D e p a r t m e n t o f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e ,A f f i l i a t e dH o s p i t a l o f L u z h o u M e d i c a lC o l l e ge ,L u z h o u 646000,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :W a n g R o n g l i ,E m a i l :s c yb w r l @s i n a .c o m ʌA b s t r a c t ɔ M u c i n s a r e h i g h -m o l e c u l a r -w e i g h t g l y c o p r o t e i n s s e c r e t e d b y a i r w a y e p i t h e l i a l g o b l e t c e l l s a n d s u b m u c o s a lm u c o u sc e l l s .A s t h e m o s t i m p o r t a n t a i r w a y m u c i n p r o t e i n ,MU C 5A Cc a n p r e v e n t t h e g r o w t ha n di m p l a n t a t i o n o fb a c t e r i ai nt h ea i r w a y ,p a r t i c i p a t ei nt h ee p i t h e l i a l g r o w t h ,r e n e w a la n d d i f f e r e n t i a t i o n ,c e l lr e c o g n i t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o n .M a n y s t u d i e ss h o w t h a t MU C 5A C h a s g r e a t c o r r e l a t i o n w i t h l u n g d i s e a s e s s u c h a s a s t h m a ,c h r o n i c o b s t r u c t i v e p u l m o n a r y d i s e a s e ,d i f f u s e p a n b r o n c h i o l i t i s ,b r o n c h i e c t a s i s ,l u n g c a n c e r ,a n dc y s t i cf i b r o s i s .W i t ht h ed e e pe rr e s e a r c h ,MU C 5A Ci s e x p e c t e dt ob e c o m ean e w d r u g t a r g e t ,p l a y sa ni m p o r t a n t r o l e i nt h et r e a t m e n tof l u ng d i s e a s e s .Thi s a r t i c l e r e v i e w s t h et y p e s ,s t r u c t u r e ,s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y o f MU C 5A Ca n dt h er e l a t i o n s h i p of i t w i t h l u ng di s e a s e s .ʌK e y wo r d s ɔ MU C 5A C ;A s t h m a ;C h r o n i co b s t r u c t i v e p u l m o n a r y d i s e a s e ;D i f f u s e p a n b r o n c h i o l i t i s ;B r o n c h i e c t a s i s ;L u n g c a n c e r ;C ys t i c f i b r o s i s 黏蛋白是一种高相对分子质量糖蛋白,由气道上皮杯状细胞和黏膜下层的黏液细胞分泌㊂黏蛋白是呼吸道黏液的最主要成分,既有湿润吸入气体㊁防止支气管及肺泡上皮干燥的作用,又能保护呼吸道,防止有毒气体或微生物的侵入㊂目前已有21种黏蛋白在人类基因组中被识别,MU C 5A C 作为气道黏液中最为重要的黏蛋白,受到了广泛关注㊂目前鉴于黏液高分泌相关疾病的普遍性和危重性,人们逐渐开始关注黏蛋白,尤其是MU C 5A C m R N A 及蛋白表达情况,以研究黏液高分泌引起的疾病,如支气管哮喘㊁C O P D ㊁弥漫性泛支气管炎㊁支气管扩张㊁肺癌等㊂1 黏蛋白的种类和作用目前已有21种黏蛋白在人类基因组中被识别,就其特性可分为膜相关性黏蛋白和凝胶形成黏蛋白[1]㊂膜相关性黏蛋白MU C 1㊁MU C 4和MU C 16在肺部正常表达,位于上皮细胞顶端,为纤毛和胞外基质提供结构支持并参与信号传导;凝胶形成黏蛋白MU C 2㊁MU C 5A C ㊁MU C 5B 及MU C 19由杯状细胞和黏膜下腺的黏液细胞分泌㊂黏蛋白分子参与组成呼吸道黏液,起保护和润滑上皮作用,呼吸道内一定范围黏蛋白分泌增高,有一定积极作用:作为一个物理屏障,可防御外来具有生物活性的刺激物质(机械屏障作用);通过黏附于气道上皮,阻止细菌在气道植入和生长(生物屏障作用);活化气道管腔白细胞释放的细胞毒性物质(化学屏障作用),此外,黏蛋白还具有其他重要功能,如参与上皮生长㊁更新和分化㊁促进胎儿发育㊁上皮完整性的保持㊁肿瘤发生和㊃513㊃国际呼吸杂志2014年2月第34卷第4期 I n t JR e s p i r ,F e b r u a r y 2014,V o l .34,N o .4转移㊁细胞黏附㊁细胞识别和信号传导等㊂2M U C5A C的结构和分布MU C5A C位于染色体11p15.5,在MU C5A C 基因中,含8个氨基酸的串联重复区域和由130个氨基酸组成的富含10个重复半胱氨酸残基的多肽区域㊂在呼吸道黏蛋白基因,已克隆出启动子序列,在启动子序列中有激活的顺势元件,包括核因子κB㊁S P1㊁C R E B㊂启动子区是调节黏蛋白基因表达的关键所在㊂在黏蛋白基因转录的起始位置均含有特异性的T A T A盒㊂而MU C5A C的5ᶄ端还具有C A C C盒,是与S P1转录因子结合的位点,改变启动子区的结构则对黏蛋白基因的转录具有重要影响㊂MU C5A C存在于表面上皮细胞层,其m R N A 及蛋白主要位于杯状细胞,在气管和主支气管中表达较多,而在直径小于1mm的细支气管及肺泡上皮细胞中则没有表达㊂正常支气管黏膜的同一区域内,从表面上皮细胞到黏膜下腺,MU C5A C的表达逐渐减少[2]㊂3M U C5A C基因表达调控的信号传导通路有3条重要的信号通路调控着MU C5A C的产量:叉头转录因子A2(F o x A2)是MU C5A C表达抑制剂,将其敲除的小鼠突变株会引起自发的黏液化生及MU C5A C的过度表达,但F o x A2是顺式作用抑制剂还是反式作用抑制剂目前还不清楚;I L-13和信号传导与转录活化因子6均在急性炎症反应中诱发黏液化生和MU C5A C的表达;表皮生长因子受体也是诱导MU C5A C表达㊁引起黏液化生的又一个平行通路中的关键信号分子㊂低氧诱导因子-1作为小鼠MU C5A C启动子活性的顺式激活调控因子,可能是多种炎症输入的一种中心调控介质[3]㊂4M U C5A C与肺部疾病的关系4.1MU C5A C与支气管哮喘支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸粒细胞㊁肥大细胞㊁T细胞㊁中性粒细胞㊁气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性变态反应性炎症㊂气道黏液高分泌是哮喘的一个特征性病理生理改变,主要表现为痰液生成增多和杯状细胞增生明显㊂重症哮喘急性发作期,黏液栓形成是导致患者死亡的主要因素之一㊂小鼠钙激活氯离子通道-3㊁人钙激活氯离子通道-1㊁I L-4㊁I L-9和I L-13均参与了黏液的分泌[4]㊂此外,I L-1β㊁肿瘤坏死因子α(T N F-α)和环氧合酶2也可影响黏液高分泌,其中I L-9可能通过钙激活氯离子通道调控黏蛋白表达,I L-13上调信号转导与转录活化因子6磷酸化和抑制转录因子F o x A2上调MU C5A C表达,导致黏液高分泌㊁气道结构改变㊁气道重塑,而T N F-α则通过核因子κB,I L-1β通过环氧合酶2㊁表皮生长因子受体和F o x A2信号途径来调节黏液的分泌状态[5]㊂O r d oñe z等[6]分析痰液发现多数哮喘急性发作期患者I L-8水平明显升高,且I L-8升高水平与中性粒细胞数目显著正相关㊂哮喘患者气道黏液比较黏稠,容易产生凝胶状的黏液栓并可能阻塞气道㊂通过对死于哮喘的患者进行尸解发现,广泛闭塞的小中型气道中,黏液和细胞碎片MU C5A C 是黏液栓的最主要的大分子组成部分㊂因此,气道管腔阻塞的MU C5A C是导致致命性哮喘的主要原因,即使轻-中度的哮喘患者,其MU C5A C的分泌量也是显著增加的㊂黏液的过度分泌导致气道阻塞㊁肺功能下降㊁气道重塑和感染增加,是导致哮喘患者发病和死亡的一个重要因素㊂4.2 MU C5A C与C O P D C O P D以气道黏液高分泌㊁气流受限为特征,黏液高分泌㊁气流受限不完全可逆,呈进行性发展,从而导致气道壁的损害㊂大量研究证实,C O P D患者气道黏液高分泌主要由杯状细胞㊁黏膜下腺体的增生及肥大引起,黏液产生过多及排出障碍可阻塞呼吸道管腔,导致气流受限,加速肺功能下降进程,同时气道炎症使纤毛变短㊁倒伏㊁脱落,黏液清除功能下降,以及黏液生物物理性质改变,从而导致气道的持续感染㊁阻塞和重塑,形成恶性循环[7]㊂气道黏液高分泌是C O P D重要的临床病理特征㊂高分泌状态下的气道黏液不仅有量的改变,而且有质的改变,即黏度增大和酸性增强,这种黏液特性改变在黏蛋白分子结构上的反映即为黏蛋白糖基化程度和硫酸化程度的明显升高[8]㊂研究表明在C O P D患者急性加重期,由于感染等多种因素影响,气道上皮分泌MU C5A C显著增加[9]㊂与正常气道相比,MU C5A C在支气管上皮出现高表达, MU C5B在支气管内腔也出现高表达(正常时MU C5B应为低表达),同时MU C5A C与MU C5B 的比值有所降低[5]㊂C O P D的炎性表现是以巨噬细胞递呈的中性粒细胞浸润为主,中性粒细胞可通过分泌中性粒细胞弹性蛋白酶促使MU C5A C表达增加[10]㊂因此,在C O P D急性加重期,有效控制感染同时应用减少黏液分泌的药物有助于改善症状㊂4.3 MU C5A C与弥漫性泛细支气管炎(D P B)D P B是两肺弥漫性呼吸性细支气管慢性炎症性疾病,其临床特点是慢性咳嗽㊁咳痰㊁活动后呼吸困难,病理显示细支气管壁全层淋巴细胞和中性粒细胞浸润㊂D P B和许多其他气道慢性炎症性疾病一样,都是以气道黏液高分泌为临床特征,即通常所说的痰量增多㊂黏液大量分泌可导致呼吸道黏液栓形成㊁㊃613㊃国际呼吸杂志2014年2月第34卷第4期I n t JR e s p i r,F e b r u a r y2014,V o l.34,N o.4管腔狭窄阻塞和细菌定植,加重疾病过程甚至造成死亡㊂气道黏液过量分泌与D P B的发生㊁发展及转归有着密切关系㊂K i m等[11]研究发现,D P B患者MU C5A C基因表达增加,气道内黏液量增多㊂在D P B患者样本中,经过A B/P A S染色可见细支气管腔内黏液分泌旺盛,有大量黏液栓形成,黏蛋白MU C5A C合成增加;细支气管上皮杯状细胞化生,且杯状细胞胞浆稀薄㊂而对照组细支气管腔内无明显黏液分泌与MU C5A C蛋白合成;细支气管上皮散在分布少量杯状细胞,且胞浆丰满,内有致密颗粒㊂D P B患者细支气管上皮的杯状细胞发生脱颗粒,因而细胞形态瘦小,胞浆稀薄㊂黏液大量分泌至细支气管腔内形成黏液栓,导致管腔狭窄阻塞㊁呼吸道细菌定植,加重疾病过程甚至造成死亡㊂4.4MU C5A C与支气管扩张支气管扩张是指慢性炎症及细菌感染导致中等大小支气管出现异常扩张及管壁增厚㊁变形,其基本临床特点是慢性咳嗽,咳大量脓痰和/或反复咯血㊂铜绿假单胞菌㊁流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌等感染造成炎症细胞(如中性粒细胞㊁巨噬细胞和淋巴细胞等)聚集,释放炎性介质I L-8㊁I L-1β㊁T N F-α㊁髓过氧化物酶㊁中性粒细胞弹性蛋白酶和氧自由基等,黏蛋白表达增加,导致支气管堵塞,造成支气管肺组织的破坏㊂其中中性粒细胞弹性蛋白酶在支气管扩张发展中起重要作用,可促进感染迁延,放大炎症反应,降解细胞外基质,抑制炎症细胞凋亡㊂铜绿假单胞菌可引起气道杯状细胞增生和化生,并可通过抑制转录因子F o x A2途径使黏液高分泌,加速支气管扩张的发生发展[12]㊂在利用铜绿假单胞菌群体感受系统中的细胞外信号因子N-3-氧代十二碳烯酰-L-高丝氨酸内脂(3O-C12-H S L)诱导N C I-H292细胞在m R N A 和蛋白水平的研究中均表达了MU C5A C,且呈时间-剂量相关性,阿奇霉素可在被激活的3O-C12-H S L细胞上抑制MU C5A C表达,从而减少黏液高分泌[13]㊂最近有研究发现[14],莫西沙星能抑制铜绿假单胞菌诱导的黏蛋白MU C5A C表达,因此有望用于铜绿假单胞菌诱导的黏蛋白过度分泌的治疗㊂4.5 MU C5A C与肺癌随着世界人口老龄化,加上严重的空气污染,人们戒烟意识薄弱,肺癌的发病率和病死率居肺部疾病的首位,其发病机制复杂,因此肺癌的治疗也就成为了一大难题㊂MU C5A C与多种肿瘤相关,但是与肺癌的关系目前只有较少的文献报道㊂肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌2个主要类型,其中非小细胞肺癌约占80%,包括鳞状细胞癌(25%~35%)㊁腺癌(25%~35%)和大细胞癌(10%)㊂目前的研究多为MU C5A C与鳞癌和腺癌的关系㊂鳞状细胞癌来源于支气管上皮㊂在基底细胞和/或杯状细胞增生㊁化生时,黏蛋白基因表达的质与正常时无明显差别,但MU C5A C的表达量明显增高[15]㊂由于鳞癌的上皮细胞化生, MU C5A C表达更为广泛,并明显集中在与鳞癌细胞相邻的正常上皮[2]㊂MU C5A C在鳞癌中与小颗粒黏液细胞分化密切相关,推测鳞癌可能源于黏液细胞[16]㊂腺癌来源于黏液腺上皮㊂支气管腺癌的MU C5A C表达异常升高[17]㊂C o p i n等[18]对肺腺癌患者进行黏蛋白基因分析后认为,腺癌可分为黏液型细支气管肺泡癌㊁非黏液型细支气管肺泡癌和非细支气管肺泡癌㊂黏液型细支气管肺泡癌恒定表达染色体11p15.5上的黏蛋白基因(MU C2㊁MU C5A C㊁MU C5B和MU C6),具有杯状细胞表现特征,临床表现及预后与其他腺癌亚型不同;非黏液型细支气管肺泡癌和非细支气管肺泡癌恒定表达MU C1和MU C4,黏液分泌区域有MU C5A C和MU C5B表达㊂这一结果对肺癌的分型㊁治疗和预后都将产生一定的影响㊂目前,水通道蛋白A Q P5与肺腺癌的关系也备受关注㊂最近研究提示[19],在A Q P5高表达的肺腺癌细胞中,黏蛋白MU C5A C 和MU C5B的表达明显增加,A Q P5可促进黏蛋白MU C5A C和MU C5B表达,可能加快肺腺癌的增殖转移㊂A Q P5诱导黏蛋白表达增加可能在肺腺癌的转移中发挥重要作用㊂4.6MU C5A C与肺囊性纤维化囊性纤维化在美国白种人中是最常见的遗传病,它由单基因囊性纤维化跨膜传导调节因子突变引起,因氯化物不能通过上皮细胞而导致脱水性分泌及外分泌腺功能失调,使得黏液变得更黏稠,久之引起支气管变形重塑而形成㊂H C O3-是正常气道黏液分泌必不可少的条件,囊性纤维化跨膜通道调节因子受H C O3-的影响,在缺乏H C O3-时前列腺素E2或5-羟色胺刺激黏液释放,其量是H C O3-存在时的一半[20]㊂对囊性纤维化患者气管㊁支气管和周围肺组织的免疫组化分析结果表明,表皮内杯状细胞有MU C5A C 信号表达,腺体分泌导管内杯状细胞也有MU C5A C 阳性着色㊂通过与正常组织的免疫组化检测结果比较,MU C5A C的组织学分布与正常组织无明显差别,但由于杯状细胞的增生或化生,MU C5A C阳性细胞数量明显增加㊂5小结与展望随着对黏蛋白MU C5A C的调节机制㊁信号通㊃713㊃国际呼吸杂志2014年2月第34卷第4期I n t JR e s p i r,F e b r u a r y2014,V o l.34,N o.4路以及与气道高分泌疾病关系的研究,黏蛋白MU C5A C在各种生理㊁病理条件下的作用越发重要㊂目前针对气道黏液高分泌的治疗手段尚不够,临床治疗包括祛痰㊁抗感染㊁抗氧化㊁减少诱导黏蛋白合成的炎症信号分子等,总的临床疗效尚不佳㊂希望通过阻断其信号通路或调节基因表达进行药物靶向治疗,从而改善症状乃至有效地治疗疾病㊂参考文献[1] W i l l i a m sOW,S h a r a f k h a n e hA,K i m V,e t a l.A i r w a y m u c u s:F r o m p r o d u c t i o n t o s e c r e t i o n[J].A mJR e s p i rC e l lM o l B i o l,2006,34:527-536.[2] C o p i n M C,D e v i s m e L,B u i s i n e M P,e t a l.F r o m n o r m a lr e s p i r a t o r y m u c o s at oe p i d e r m o i dc a r c i n o m a:e x p r e s s i o n o fh u m a nm u c i n g e n e s[J].I n t JC a n c e r,2000,86:162-168.[3] E v a n sC M,K o oJ S.A i r w a y m u c u s:t h e g o o d,t h eb a d,t h es t i c k y[J].P h a r m a c o lT h e r,2009,121:332-348.[4]I z u h a r a K,O h t a S,S h i r a i s h i H,e ta l.T h e m e c h a n i s m o fm u c u s p r o d u c t i o n i nb r o n c h i a l a s t h m a[J].C u r rM e dC h e m,2009,16:2867-2875.[5] L a iH,R o g e r sD F.N e w p h a r m a c o t h e r a p y f o ra i r w a y m u c u sh y p e r s e c r e t i o 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气道疾病中粘液异常分泌的机制研究在气道疾病中，粘液异常分泌是一个常见且重要的病理改变。

它导致了患者咳嗽、咳痰、呼吸困难等不适感，并可能进一步加重气道阻塞和损伤。

因此，深入了解粘液异常分泌的机制对于气道疾病的预防和治疗具有重要意义。

一、黏蛋白超表达气道上皮细胞是粘液产生的主要来源。

在正常情况下，气道上皮细胞通过特定信号通路调控粘液生成和分泌。

然而，在某些气道疾病中，如慢性阻塞性肺疾病（COPD）和支原体感染等，黏蛋白的产生被持续激活，导致其在数量上过度表达。

对于黏蛋白超表达问题，许多机制被认为参与其中。

例如，NF-κB信号通路被发现与黏蛋白超表达密切相关。

当受到外界刺激时，如病原体感染、氧化应激和炎症因子的作用，NF-κB活性会增强，并进一步促进黏蛋白基因的转录。

此外，炎症细胞和免疫细胞也可以分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α），它们与前列腺素合成酶（COX-2）的活化有关，最终引起黏蛋白过度表达。

二、粘液脱水与易变黏度在粘液异常分泌的机制中，粘液的脱水是一个关键环节。

正常情况下，气道上皮细胞将合成的黏蛋白通过高度表达的离子通道和转运蛋白导入到上皮表面。

然而，在某些气道疾病中，这些通道和转运蛋白的功能会受到损害或调控异常。

粘液脱水使得其黏度降低、稠度减弱，从而无法有效地清除捕捉到的颗粒物质和外界刺激物。

造成这一现象的机制包括阴离子通道、钠转运、黏蛋白酯酶和碱性磷酸酶的异常活性等。

例如，在支气管哮喘患者中，氯离子通道的功能受损，影响了粘液物质的输送和脱水。

三、氧化应激与纤维化在某些情况下，粘液异常分泌也与氧化应激和纤维化相关。

实验证据表明，过度产生的活性氧物质（ROS）可以激活NF-κB信号通路，并进一步增强黏蛋白合成。

此外，ROS还可以促进基质金属蛋白酶（MMP）的活性，导致胶原降解和粘液廓清受阻。

在许多气道疾病中，如支气管扩张、支气管肺发育不良等，过度沉积的胶原蛋白和纤维素会导致气道结构改变和组织纤维化。

薄荷醇通过mTOR活化促进人支气管上皮细胞气道炎症相关因子的表达陈海博; 李敏超【期刊名称】《《南方医科大学学报》》【年(卷),期】2019(039)011【总页数】6页(P1344-1349)【关键词】人支气管上皮细胞; 薄荷醇; 瞬时受体电位蛋白-8; 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白; 气道炎症【作者】陈海博; 李敏超【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科重庆 400010【正文语种】中文慢性气道炎症性疾病包括慢性阻塞性肺病（COPD）和支气管哮喘，该类患者常常因受到冷空气刺激后出现病情的加重，随后出现咳嗽、支气管痉挛等呼吸道症状[1-2]，并伴随炎症因子浸润及气道黏液分泌等病理改变[3-4]。

如何控制上述患者受凉后病情进展是目前需要解决的问题。

瞬时受体电位蛋白-8（TRPM8）作为特异的冷敏感受体在人支气管上皮细胞中表达[3,5]，能被低温（低于25 ℃）及薄荷醇等凉性化合物激活，激活后可引起细胞内Ca2+浓度升高[3,6]，并进一步导致白细胞介素（IL）-4、IL-6、IL-8等多种炎症因子的产生[6-7]。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是细胞内重要的调控因子，细胞通过mTOR相关信号通路感受各种外界因素如氧气浓度、生长因子、应激水平等[8-10]，并通过对下游信号的调控来调节基因转录、蛋白质翻译以及细胞自噬等生理过程，维持机体和细胞的稳态平衡[11-13]。

近几年研究也发现mTOR相关信号通路在气道炎症性疾病中具有重要的调控作用[12,14]。

但目前研究中mTOR相关信号通路是否参与气道中TRPM8受体被激动后炎症因子表达的调控尚无相关报道。

本次实验中使用凉性化合物薄荷醇干预人支气管上皮细胞（BEAS-2B）来模拟人气道受冷刺激后的低温状态旨在探究薄荷醇干预后对mTOR活化、TRPM8蛋白表达、气道炎症相关因子IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达的影响，以及薄荷醇是否通过mTOR的活化诱导胞内Ca2+浓度升高，从而引起气道炎症相关因子表达变化。

罗格列酮对内毒素诱导气道MUC5AC表达的调控刘维佳;张湘燕;张程;冯端兴【摘要】目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR γ)激动剂罗格列酮对内毒素所致大鼠气道MUC5AC表达的影响及其机制.方法将36只雄性SD大鼠随机分为生理盐水对照组(A组)、罗格列酮对照组(B组)、脂多糖组(LPS组)(C组)、以及低、中、高剂量罗格列酮组(D组、E组和F组).采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-10浓度.免疫组化染色及实时荧光定量逆转录-PCR检测气道肺组织MUC5AC蛋白及mRNA表达.结果与生理盐水对照组比较,LPS组BALF中TNF-α、IL-1β和IL-10浓度,以及气道肺组织MUC5AC蛋白和mRNA表达增加(P<0.01);TNF-α、IL-1β与MUC5AC mRNA表达呈正相关(r分别为0.851,0.803,P<0.05);IL-10浓度与MUC5AC mRNA表达呈负相关(r为-0.812,P<0.05).给予低、中、高剂量罗格列酮干预后,D组、E组和F组BALF中TNF-α浓度及MUC5AC蛋白、mRNA表达均逐渐降低,IL-10水平逐渐升高,各组间差异有统计学意义(P均<0.05).结论罗格列酮对内毒素诱导的气道黏液高分泌有拮抗作用,其具体机制可能与调节炎症反应,下调气道MUC5AC转录有关.【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2010(034)001【总页数】4页(P3-6)【关键词】罗格列酮;气道;黏液高分泌;内毒素;黏蛋白5AC【作者】刘维佳;张湘燕;张程;冯端兴【作者单位】贵州省人民医院呼吸内科,贵阳550002;贵州省人民医院呼吸内科,贵阳550002;贵州省人民医院呼吸内科,贵阳550002;贵州省人民医院呼吸内科,贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R562在生理条件下，气道表面分泌少量黏液，以维持正常黏液的粘弹性和黏液纤毛清除功能，是呼吸道最重要的非特异性防御机制。

在远端气道，MUC5AC和MUC5B均由上皮表面的分泌细胞（Club细胞）产生［1］。

MUC5AC和MUC5B在维持健康的气道上皮细胞中具有不同的作用。

MUC5B是健康人类气道中的主要黏蛋白。

动物研究［6］表明，Muc5b对黏液纤毛清除功能（mucociliary clearance， MCC）和通过控制细菌感染和减轻炎症来维持气道健康至关重要。

在小鼠模型［6， 8］中muc5b基因缺失会导致气道金黄色葡萄球菌感染、黏液运输受损以及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞聚集。

相比之下，MUC5AC 在健康气道中的表达较低，但在人体应对病毒感染时可表达上调，充当病毒受体的诱饵，在炎症反应中发挥重要作用［1］。

2 MUC5AC、MUC5B在黏液阻塞性肺疾病发生发展中的作用机制2.1　MUC5AC、MUC5B在COPD发生发展中的作用机制　COPD是一种以气流持续受限为特征的气道阻塞性疾病，其发病机制主要包括气道炎症、氧化应激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、肺气肿和气道黏液分泌障碍［9］。

黏液产生过多是COPD的主要标志，并与肺功能下降及临床预后不良相关［10］。

MUC5AC和MUC5B是与COPD发病相关的主要黏蛋白［11］。

研究［11］发现，COPD患者痰液MUC5AC、MUC5B水平均升高，MUC5AC与MUC5B的比率增加，且这种增加同COPD严重程度及FEV1降低相关［1］。

因此，黏蛋白成分的改变可能在COPD发病机制中起重要作用。

传统研究认为COPD的黏液表型是由MUC5AC 驱动的，然而近年来的一系列研究表明，MUC5B在COPD的黏液表型中也发挥重要作用。

MUC5B是COPD患者痰液中的主要聚合黏蛋白，对呼吸道先天免疫和MCC至关重要。

降低MUC5B水平可能导致黏液阻塞气道、MCC损伤和增加感染风险［12］。

进一步研究证明，MUC5B可以促进COPD小鼠模型气道上皮细胞向杯状细胞分化、黏液产生以及炎症反应，并且MUC5B是通过干扰信号转导和转录激活因子6（Signal transducers and activators of transcrip⁃tion，STAT6）-上皮特异性ETS转录因子（SAM pointed domain-containing ETS transcription factor，SPDEF）通路或巨噬细胞的功能发挥作用的，而叉头转录因子A2（FoxA2）在该通路中充当负调节剂。

中南大学学报（医学版）J Cent South Univ (Med Sci)2019, 44(1) htt p://1皮层肌动结合蛋白不同位点磷酸化对人气道上皮细胞黏蛋白5AC 分泌的影响李琪1，周向东1，曾曼1，钟有清1，维克多.科罗索夫2，尤列.皮尔曼2 ( 1. 海南医学院第一附属医院呼吸内科，海口 570102；2. 俄罗斯医学科学院西伯利亚分院远东呼吸生理与病理研究中心，俄罗斯 布拉戈维申斯克 675000 )[摘要] 目的：了解皮层肌动结合蛋白(cortical actin-binding protein ，又称cortactin)在人气道上皮细胞黏蛋白(mucin ，MUC)5AC 分泌中的作用及不同磷酸化位点对其的影响。

方法：培养人气道上皮细胞HBE16，以皮层肌动结合蛋白不同磷酸化位点突变载体转染细胞，并分为空白对照组、剪应力刺激组、剪应力+增强绿色荧光蛋白质粒(enhanced green fluorescent protein plasmid ， pEGFP)-N1组、剪应力+pEGFP-N1-cortactin (Cort)组、剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y421A 组、剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y470A 组及剪应力+pEGFP-N1-Cort-Y486A 组，剪应力设定为4 dynes/cm 2。

采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)、real-time PCR 法测定转染前后各组细胞及培养上清中MUC5AC 蛋白和mRNA 水平，Western 印迹检测各组皮层肌动结合蛋白及磷酸化皮层肌动结合蛋白含量；异硫氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate ，FITC)标记的鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白(fi lamentous actin ，F-actin)的分布情况。

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2019.11.014㊃临床免疫学㊃Cortactin 在应力诱导的气道黏液分泌过程中的介导作用①吴海丰　李　琪　Juliy M Perelman ②　Victor P Kolosov ②　Andrei Shpakou ③　周向东(海南医学院第一附属医院呼吸内科,海口570102) 中图分类号　R56 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2019)11⁃1354⁃04①本文为国家自然科学基金项目(81660010,81611530713,81811530063)㊂②俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心,布拉戈维申斯克675000㊂③白俄罗斯国立杨卡㊃库帕拉大学运动与康复医学系,格罗德诺230023㊂作者简介:吴海丰,男,硕士,主要从事慢性气道炎症性疾病的发病机制及其防治的研究,E⁃mail:1453778496@㊂通讯作者及指导教师:李　琪,女,博士,副教授,主要从事慢性气道炎症性疾病的发病机制及其防治的研究,E⁃mail:lqlq198210@㊂[摘　要]　目的:探讨皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)对剪应力(SS)诱导的气道黏液高分泌的影响及其关键靶点㊂方法:体外培养气道上皮细胞Beas⁃2B,并随机分为6组:空白对照组㊁SS 组㊁SS+Wild⁃Cortactin 组㊁SS+pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU 组㊁SS+pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU 组㊁SS+pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU 组㊂用Western blot 法检测Cortactin 蛋白㊁p⁃Cortactin 蛋白表达水平,RT⁃PCR㊁ELISA 法分别检测MUC5AC 转录水平和MUC5AC 的分泌量㊂结果:转染Cortactin 各型重组表达载体后细胞Cortactin 蛋白明显增加,提示转染成功㊂转染Wild⁃Cortactin 后再予剪应力处理,细胞的p⁃Cortactin 蛋白㊁MUC5AC mRNA 及蛋白表达显著增加㊂而转染pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU 后,细胞p⁃Cortactin 蛋白㊁细胞培养上清液MUC5AC 的相对分泌量显著下降,但MUC5AC 的转录水平无明显影响㊂结论:在剪应力刺激诱导的气道上皮细胞MUC5AC 高分泌过程中,Cortactin 具有重要的介导作用,且Y466为其介导该过程的潜在关键作用靶点㊂[关键词]　皮层肌动蛋白结合肽;黏蛋白5AC;气道剪应力Mediated effect of Cortactin in airway mucin secretion induced by shear stressWU Hai⁃Feng ,LI Qi ,Juliy M Perelman ,Victor P Kolosov ,Andrei Shpakou ,ZHOU Xiang⁃Dong .Department of Respiratory Medicine ,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University ,Haikou 570102,China[Abstract ]　Objective :To explore the effects and pivotal site of Cortactin on secretion of mucin(MUC)5AC induced by theshear stress(SS)in airway epithelial cells.Methods :The airway epithelial cells(Beas⁃2B)were cultured in vitro,and divided into 6groups:Blank control group,SS group,SS +Wild⁃Cortactin group,SS +pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU group,SS +pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU group,SS +pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU group.The relative content of Cortactin and phosphorylated Cortactin (p⁃Cortactin)protein was detected with Western blot,the content of MUC5AC protein and transcription level of MUC5AC were observed by ELISA and RT⁃PCR respectively.Results :After transfecting recombinant expression vectors of Cortactin,the levels of Cortactin were increased significantly,Which confirm Beas⁃2B cells were transfected with each type of Cortactin successfully.After transfecting recombinant expression vectors of Wild⁃Cortactin,and then stimulated with shear stress(SS),the contents of p⁃Cortactin,MUC5AC mRNA and MUC5AC protein were evidently higher.Whereas transfecting pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU,the relative contents of p⁃Cortactin and MUC5AC protein were obviously decreased,however,there was no significant effect in the transcriptional level of MUC5AC mRNA.Conclusion :Cortactin plays a critical role in the process of MUC5AC hypersecretion induced by shear stress(SS)in airway epithelial cells,and the phosphorylationsite Y466of Cortactin may be a potential key target for the process.[Key words ]　Cortactin;MUC5AC;Shear stress(SS) 慢性气道炎性疾病常伴有气道阻塞,气道机械作用力亦有改变,其中剪应力的改变尤为突出,异常升高的应力可诱导气道黏液高分泌[1]㊂过量的黏稠液体不但影响气道上皮纤毛的正常摆动㊁削弱气道廓清能力㊁降低气道防御功能,还有助于病原微生物的寄殖,使呼吸道炎症趋于恶化㊂皮层肌动蛋白结合肽(Cortactin)是大多数极化上皮细胞皮层区域中的一种肌动蛋白交联蛋白[2],其在气道黏液出胞分泌过程中发挥关键作用[3],但目前Cortactin 参与该过程的确切机制尚未明了㊂故本实验以剪应力作为刺激因素,分别转染Cortactin定点突变体,比较剪应力作用后各组细胞中不同位点p⁃Cortactin蛋白水平及细胞培养上清液中MUC5AC含量的差别,推断出Cortactin介导MUC5AC分泌的关键位点,为慢性气道炎性疾病的治疗提供新的启示㊂1　材料与方法1.1　主要试剂与材料　气道上皮细胞Beas⁃2B(美国ATCC);10%小牛血清㊁0.25%胰蛋白酶(Hyclone 公司);各型Cortactin突变体及野生型Cortactin重组真核表达载体(重医刘春漪博士馈赠);MUC5AC 单克隆抗体(Chemico公司);鼠抗人Cortactin及p⁃Cortactin单克隆抗体㊁小鼠抗β⁃actin单克隆抗体(Abcam公司);Lipofectamine2000转染试剂盒㊁引物(上海生科公司);剪应力装置(重庆医科大学生命科学院实验室提供)㊂1.2　方法1.2.1　细胞的培养及处理　将Beas⁃2B细胞于含10%胎牛血清的DMEM培养液中孵育,当细胞融合约达80%时,用PBS冲洗2遍,并予细胞分组:空白对照组:仅予等体积的培养液继续培养,未予其他特殊处理㊂SS组:仅予剪应力刺激,30r/min,30min㊂SS+野生型Cortactin组:转染野生型Cortactin后予剪应力刺激30min㊂SS+pcDNA3⁃Cortactin421⁃MU组:转染pcDNA3⁃Cortactin421⁃MU后予剪应力刺激细胞30min㊂SS+pcDNA3⁃Cortactin466⁃MU组:转染pcDNA3⁃Cortactin466⁃MU后予剪应力刺激细胞30min㊂SS+ pcDNA3⁃Cortactin482⁃MU组:转染pcDNA3⁃Cortactin482⁃MU后予剪应力刺激细胞30min㊂将上述各组细胞置于37℃㊁5%CO2孵育箱继续孵育,24h后取细胞及其培养上清液行相关检测㊂1.2.2　细胞转染　将Beas⁃2B细胞密度调整至5×105/孔并接种于6孔板中,细胞融合度达80%左右时将各型表达载体转染细胞,按Lipofeetamine TM 2000说明书操作㊂转染后PBS液洗涤3次,加入含有10%FBS+DMEM的培养液,置于37℃㊁5%CO2湿度的培养箱继续孵育,每5h换液1次,24h后对各组细胞进行转染鉴定㊂1.2.3　剪应力处理　旋转装置的周期性变速过程等效于气道气体流动时产生的剪应力(SS)㊂该装置在周期性变速旋转过程中,细胞与表面液体将产生相对运动,即可产生剪应力㊂为模拟气道上皮细胞黏液高分泌的病理状态,我们将剪应力的大小设置在4~ 6dynes/cm2之间,即旋转参数为30r/min,30min㊂1.2.4　Western blot法检测各组细胞Cortactin㊁p⁃Cortactin水平　收集各组细胞,PBS液洗涤,加入细胞裂解液裂解后离心,12000r/min,4℃,20min,取上清液经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜后室温下封闭2h,分别加入鼠抗人Cortactin单克隆抗体(1∶1000)㊁鼠抗p⁃Cortactin单克隆抗体(1∶1000);室温孵育2h,分别加入山羊抗小鼠IgG⁃HRP,室温孵育2h㊂TBST液洗膜后于ECL溶液显色5min,结果与内参照β⁃actin产物条带相比较,两者的比值作为Cortactin㊁p⁃Cortactin的相对含量㊂1.2.5　RT⁃PCR法检测各组细胞MUC5AC mRNA 表达水平　Trizol法分别提取各组细胞总RNA,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,测定RNA在260nm和280nm的A值,样品A260/A280均介于1.8~2.0㊂两步法行RT⁃PCR㊂参照逆转录试剂盒说明操作㊂MUC5AC引物:上游5′⁃TCCGGCCTCATCTTCTCC⁃3′,下游5′⁃ACTTGGGCACTGGTGCTG⁃3′;GAPDH引物序列:上游5′⁃TAATCATGATATGGGAGAGTAGT⁃3′,下游5′⁃TGTATATGTCACTCCACATATAC⁃3′㊂PCR完成后,产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果经吸光度面积积分分析,以与GAPDH mRNA(管家基因)的比值作为相对值㊂1.2.6　ELISA法检测各组细胞分泌的MUC5AC蛋白相对含量　吸取各组样品50μl,包被于96孔酶标板,4℃下过夜,晾干,PBS液漂洗3次,2%BSA室温封闭1h㊂PBS再次洗板3次,加入1∶200的小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体45μl,用PBS(含0.05% Tween⁃20)稀释至50μl,室温孵育1h㊂PBS液再次洗板3次,加入45μl用HRP标记的羊抗小鼠二抗(1∶500),室温孵育1h㊂弃二抗,PBS液再次洗板3次,加入四甲基联苯胺过氧化物酶显色,反应结束后,测定各孔样品吸光度值(A450nm),与标准样品比较,所得比值即为各组MUC5AC蛋白的相对含量㊂1.3　统计学处理　所有实验数据均以x±s表示,用SPSS19.0统计软件包处理分析所得数据,组间差异比较采用t检验,P<0.05为差异具有统计学意义㊂2　结果2.1　Cortactin转染Beas⁃2B细胞转染结果　各组细胞内Cortactin蛋白的相对表达量用Western blot 法检测,分析发现空白对照组的Cortactin蛋白相对含量明显低于转染野生型Cortactin组㊁pcDNA3⁃Cor⁃tactin421⁃MU组㊁SS+pcDNA3⁃Cortactin466⁃MU组㊁SS+ pcDNA3⁃Cortactin482⁃MU组(P值均<0.01),说明转染成功(表1㊁图1)㊂表1　各组细胞Cortactin 的相对表达水平(x ±s ,n =6)Tab.1　Relative level of Cortactin in every group (x ±s ,n =6)GroupsCortactinControl 0.444±0.031Wild⁃Cortactin 0.729±0.0411)pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU 0.731±0.0361)pcDNA3⁃Cortactin466⁃MU0.718±0.0251)pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU0.745±0.0291)Note:1)P <0.01compared with controlgroup.图1　各组细胞Cortactin 的相对表达水平Fig.1　Relative level of Cortactin in each groupNote:1.Controlgroup;2.Wild⁃Cortactingroup;3.pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU group;4.pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU group;5.pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MUgroup.图2　各组细胞p⁃Cortactin 的表达水平Fig.2　Relative level of p⁃Cortactin in each groupNote:1.Control group;2.SS+wild⁃Cortactin group;3.SS+pcDNA3⁃Cor⁃tactin421⁃MU group;4.SS;5.SS +pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MUgroup;6.SS+pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU group.2.2　各组细胞p⁃Cortactin 水平表达情况　Western 印迹法检测各组细胞p⁃Cortactin 水平,单纯剪应力(SS)刺激下,p⁃Cortactin 表达量较空白对照组显著升高(P <0.01),说明气道剪应力可促进Cortactin 蛋白磷酸化;与单纯SS 刺激组相比,转染野生型Cortactin 后,再予SS 刺激,p⁃Cortactin 蛋白表达明显增加(P <0.01);与SS+野生型Cortactin 组相比,SS+pcDNA3⁃Cortactin⁃MU 组的p⁃Cortactin 蛋白水平显著下降(P <0.01),而SS+pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU 组和SS+pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU 组的p⁃Cortactin 蛋白水平则无明显变化(P >0.05),表明当酪氨酸磷酸化表2　各组细胞MUC5AC mRNA 的表达及蛋白的相对含量(x ±s ,n =6)Tab.2　Content of MUC5AC mRNA and protein in eachgroup (x ±s ,n =6)Groups p⁃Cortactin MUC5AC mRNAMUC5AC proteinControl group 0.125±0.0070.302±0.0410.218±0.037SS group0.333±0.0191)0.749±0.1641)0.611±0.0401)SS+Wild⁃Cortactin group0.527±0.0102)0.714±0.1250.692±0.0463)SS+pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU group 0.528±0.0160.727±0.0430.706±0.053SS+pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU group 0.122±0.0084)0.735±0.1220.201±0.0244)SS+pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU group0.532±0.0100.742±0.1180.689±0.048Note:Compared with control group,1)P <0.01;compared with SS group,2)P <0.01;comparedwith SS group,3)P <0.05;compared with SS+wild⁃Cortactin group 4)P <0.01.位点Y466突变后,Cortactin 磷酸化功能将随之降低(图2,表2)㊂2.3　转染Cortactin 对细胞MUC5AC 表达及分泌的影响　经RT⁃PCR 法和ELISA 法检测后发现,与空白对照组相比,SS 组的细胞MUC5AC mRNA 及蛋白的相对含量显著升高(P <0.01),说明了剪应力(SS)能诱Beas⁃2B 细胞MUC5AC 的过量表达和分泌㊂与单纯SS 刺激组相比,SS+野生型Cortactin 组的MUC5AC 蛋白相对含量明显升高(P <0.05),但MUC5AC mRNA 转录水平无明显变化(P >0.05),说明Cortactin 可促进MUC5AC 的胞外分泌,但对MUC5AC 基因的表达无明显影响㊂与SS +野生型Cortactin 组相比,SS +pcDNA3⁃Cortactin 421⁃MU 组㊁SS+pcDNA3⁃Cortactin 482⁃MU 组细胞培养上清液的MUC5AC 蛋白相对含量变化不明显,差异无统计学意义(P >0.05),而SS+pcDNA3⁃Cortactin 466⁃MU 组的MUC5AC 蛋白显著下调,差异有统计学意义(P <0.01),但各转染组间的MUC5AC mRNA 水平明显变化(P >0.05),见表2㊂3　讨论病原微生物的繁殖和炎症细胞的趋化是慢性气道炎性疾病的关键因素,而淤积的痰液则是病原体寄殖的良好培养基㊂过多的气道黏液不但无物理屏障作用,还会减弱气道上皮的清除功能,诱发炎症细胞的聚集和炎症因子的释放,而某些炎症因子又可诱导黏液的合成与分泌,加重原有的气道炎症[4]㊂慢性气道炎性疾病急性发病时黏液的产生常导致气道阻塞,加之原有的气道重构,故呼吸时气道所受机械作用力明显上升,其中以剪应力的改变尤为显著,是刺激气道黏液分泌常见的维持性因素㊂另外,临床中使用机械通气时,气道上皮受到明显的应力作用,过强的通气压力将诱发气道黏液分泌,蓄积的黏液增加气道阻塞,形成恶性循环㊂Cortactin作为酪氨酸蛋白激酶Src的作用底物而首次被发现,多研究表明,Cortactin是细胞肌动蛋白骨架组装和去组装过程中的重要调控者,在细胞伪足的形成㊁细胞迁移㊁膜流动性㊁胞吞等过程中担当重要角色[5⁃7]㊂近年来研究发现,Cortactin还参与气道黏液分泌[3]㊂Cortactin作为介导性因子,一方面介导MARCKS和F⁃actin的连接,将黏蛋白的分泌颗粒向质膜的方向极向迁移;另一方面通过调节细胞骨架蛋白的组装,增加了细胞膜的流动性及黏蛋白的出胞位点,促进MUC5AC囊泡的胞外分泌㊂本研究以剪应力为刺激因素,成功构建气道黏液高分泌模型㊂进一步实验研究证实,Cortactin可在剪应力的作用下发生磷酸化,p⁃Cortactin可促进气道MUC5AC分泌,而对MUC5AC基因的转录基本无影响㊂Cortactin参与细胞运动㊁细胞信号转导㊁胞吐及胞吞等活动与其磷酸化状态密切相关㊂Cortactin主要有4个功能区域,分别为N末端酸性结构域(NTA)㊁串联重复区域㊁C⁃端富含脯氨酸区域及SH3区域㊂其中C⁃端含有3个Src磷酸化位点 Y421㊁Y466㊁Y482[8⁃10]㊂研究表明,Cortactin磷酸化位点发生突变后,其对细胞骨架重塑的调控作用也随之丧失[11]㊂虽前期研究已阐明p⁃Cortactin能促进气道黏蛋白的出胞运动,但目前国内外关于Cortactin介导黏蛋白分泌的关键作用位点尚无报道㊂本实验研究发现,当转染定点突变体Cortactin466⁃MU后再予剪应力处理,细胞p⁃Cortactin及细胞培养上清液MUC5AC水平显著降低,但细胞MUC5ACmRNA含量无明显变化㊂故我们推断,在剪应力刺激诱导的MUC5AC高分泌过程中,Cortactin具有重要的调控功能,并且其酪氨酸磷酸化位点Y466为其介导该过程中的关键作用位点㊂即当酪氨酸磷酸化位点Y466发生磷酸化后,可诱导F⁃actin的聚合和收缩运动,促进黏蛋白的分泌出胞㊂本研究证实了Cortactin在参与剪应力诱导的气道MUC5AC分泌过程中的关键作用位点㊂启示抑制Cortactin的表达或功能可降低应力诱导的气道黏液高分泌,有利于气道物理屏障功能的维持,减轻气道炎症,为慢性气道炎性疾病的治疗提供新的干预靶点,同时还为临床中机械通气压力参数的选择提供了理论基础㊂参考文献:[1]　Even⁃Tzur N,Kloog Y,Wolf M,et al.Mucus secretion andcytoskeletal modifications in cultured nasal epithelial cells exposed to wall shear stresses[J].Biophys J,2008,95:2998⁃3008. [2]　MacGrath SM,Koleske AJ.Cortactin in cell migration and cancerat a glance[J].J Cell Sci,2012,125:1621⁃1626.[3]　王　鹏,周向东,尤列.皮尔曼,等.气道剪应力作用下黏蛋白5AC胞外极向分泌的主要介导分子[J].中华医学杂志, 2013,93(32):2587⁃2591.Wang P,Zhou XD,Perelman JM,et al.Main mediated molecules of airway shear stress⁃stimulated MUC5AC extracellular secretion [J].Chin Med J,2013,93(32):2587⁃2591.[4]　江德鹏,Kolosov VP,周向东,等.白介素13通过FOXA2调控气道上皮细胞黏液分泌[J].中国免疫学杂志,2011,27(2): 99⁃102.Jiang DP,Kolosov VP,Zhou XD,et al.IL⁃13regulates mucus secretion via FOXA2in vitro[J].Chin J Immunol,2011,27(2): 99⁃102.[5]　Evans JV,Ammer AG,Jett JE,et al.Src binds cortactin through anSH2domain cystine⁃mediated linkage[J].J Cell Sci,2012,125(24):6185⁃6197.[6]　McNiven MA,Kim I,Krueger EW,et al.Regulated interactionsbetween dynamin and the actin⁃binding protein cortactin modulate cell shape[J].J Cell Biol,2000,151(1):187⁃198. [7]　Shimada A,Niwa H,Tsujita K,et al.Curved EFC/F⁃BAR⁃domaindimers are joined end to end into a filament for membrane invagination in endocytosis[J].Cell,2007,129(4):761⁃772.[8]　Tarran R,Button B,Boucher RC.Regulation of normal andcysticfibrosis airway surface liquid volume by phasic shear stress [J].Annu Rev Physiol,2006,68(1):543⁃561.[9]　Boyle SN,Michaud GA,Schweitzer B,et al.A critical role forcortactin phosphorylation by abl⁃family kinases in PDGF⁃induceddorsal⁃wave formation[J].Curr Biol,2007,17(5):445⁃451.[10]　Tehrani S,Tomasevic N,Weed S,et al.Src phosphorylation ofcortactin enhances actin assembly[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(29):11933⁃11938.[11]　Siton O,Ideses Y,Albeck S,et al.Cortactin releases the brakes inactin⁃based motility by enhancing WASP⁃VCA detachment fromArp2/3branches[J].Curr Biol,2011,21:2092⁃2097.[收稿2018⁃06⁃08](编辑　张晓舟)。

黏着斑激酶在机械压力诱导的人气道上皮细胞黏液分泌中的作用李娜;李琪;尤列·皮尔曼;维克多·科罗索夫;周向东【摘要】目的探讨黏着斑激酶(FAK)在机械压力诱导的人气道黏蛋白(MUC)5 AC 分泌中的作用.方法气液相界面培养人支气管上皮NHBE细胞,用Transwell压力实验装置间断性施压于NHBE细胞,黏着斑激酶(FAK) siRNA转染NHBE细胞,Western blot法检测FAK和p-ERK1/2蛋白含量,实时荧光定量PCR检测MUC5AC mRNA表达,ELISA法检测MUC5AC蛋白相对含量.结果与空白对照组相比,机械压力能显著升高MUC5AC mRNA及蛋白含量及p-ERK1/2蛋白相对表达水平(均P＜0.01).FAK siRNA可显著降低机械压力所诱导的MUC5AC mRNA 及蛋白含量的升高及p-ERK1/2蛋白表达(P＜0.01),但与转染FAKsiRNA对照组相比,机械压力+转染FAKsiRNA组细胞表达MUC5AC mRNA及蛋白水平和p-ERK1/2蛋白相对水平仍然是增加的(P＜0.05),PD98059能显著抑制机械压力所诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达水平的升高(P＜0.01).FAK siRNA联合AG1478作用于NHBE细胞则可显著抑制机械压力诱导的MUC5AC mRNA和蛋白表达(P＜0.01).AG1478单独作用能有效降低由机械压力所诱导的上述指标的升高(P＜0.05),但与AG1478对照组相比差异仍具有显著性.结论机械压力诱导的MUC5AC高表达的信号传导通路为ERK依赖的,FAK为ERK的上游信号分子.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)005【总页数】6页(P589-594)【关键词】黏着斑激酶;机械压力;黏蛋白类;细胞外信号调节激酶【作者】李娜;李琪;尤列·皮尔曼;维克多·科罗索夫;周向东【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010;俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心,俄罗斯布拉戈维申斯克675000;俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理中心,俄罗斯布拉戈维申斯克675000;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010【正文语种】中文【中图分类】R363临床中多种慢性气道炎性反应疾病(如COPD、哮喘等)往往伴有支气管收缩及重塑产生的气道狭窄，由此引发气道内压力增高，气道壁上皮细胞受压增加[1]。

气道上皮细胞ATP释放在周期性压力所致气道黏液分泌中的作用苏晖晖;周向东【摘要】Objective To investigate the role of adenosine triphosphate ( ATP) release and intra-cellular calcium ion (Ca2 +) on cyclic pressure-induced mucin ( MUC) excretion in airway epithelial cells. Methods Human bronchial epithelial cell line 16HBE cultured in vitro were stimulated mechanically through tilting the culture dish, and the shear stress and compressive stress were provided by liquid surface tension, atmospheric pressure and liquid gravity. The airway epithelial cells were divided into control group, tilt group, tilt + Ca chelant BAPTA-AM group, tilt + Ca chelant EGTA group and tilt + P2Y receptor blocker RB-2 group. Cell survival rate was measured by MTT assay, expression of MUC5AC mRNA was detected by RT-PCR, expression of MUC5AC protein in culture supernatant was determined by ELISA, ATP release was examined by high performance liquid chromatography (HPLC), and intra-cellular Ca2+ concentration was observed by inverted fluorescence microscopy. Results Compared with control group, the expression of MUC5AC mRNA and protein in 16HBE cells and ATP content in the culture supernatant in tilt group were significantly higher (P <0. 05). The expression of MUC5AC protein and ATP content in tilt + BAPTA-AM group and tilt + RB-2 group were significantly lower than those in tilt group (P<0. 05). The expression of MUC5AC mRNA in tilt + EGTA group and tilt + RB-2 group was notsignificantly different from that in tilt group (P >0. 05). Conclusion Cyclic mechanical stimulation induces ATP release and MUC5AC excretion in airway epithelial cells in a Ca2+-dependent manner.%目的探讨气道上皮细胞三磷酸腺苷(ATP)的释放及胞内钙离子(Ca2+)在周期性压力波所致气道黏液分泌中的作用.方法体外培养人支气管上皮细胞株16HBE,通过节律性倾斜细胞培养板,利用液体的表面张力、大气压及液体重力所产生的牵张力(剪应力)及压力(压应力)给予细胞机械刺激.根据对培养细胞所施加条件不同分为对照组、单纯倾斜组、倾斜+Ca2+螯合剂BAPTA-AM组、倾斜+Ca2+螯合剂EGTA组和倾斜+P2Y受体阻断剂RB-2组.分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组细胞存活率,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,ELISA法检测细胞培养上清液中MUC5AC蛋白含量,高效液相色谱法(HPLC)检测培养液中ATP 释放量,倒置荧光显微镜观察细胞内Ca2浓度变化.结果与对照组相比,单纯倾斜组16HBE细胞MUC5AC mRNA和蛋白的表达量及细胞培养上清液中ATP的含量均明显升高(P＜0.05)；倾斜+BAPTA-AM组、倾斜+RB-2组ATP及MUC5AC 蛋白表达量均明显低于单纯倾斜组(P＜0.05)；倾斜+EGTA组和倾斜+ RB-2组MUC5AC mRNA表达量与单纯倾斜组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论节律性压力可刺激气道黏膜上皮MUC5AC分泌,其机制与依赖Ca2+的ATP释放密切相关；该机制中的Ca2+几乎全部由胞内存储钙提供.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(031)012【总页数】5页(P1667-1671)【关键词】三磷酸腺苷;钙离子;黏蛋白;周期性压力【作者】苏晖晖;周向东【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆400010【正文语种】中文【中图分类】R332.1;Q471人类正常气道上皮表面均覆盖有一薄液体层，即黏液层，由水、黏蛋白(mucin，MUC)、溶菌酶、乳铁蛋白及各种多肽组成。

机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白5AC表达的影响及其信号通路机制研究钟甜;尤列·皮尔曼;维克多·科罗索夫;周向东【摘要】Objective To investigate the effects of mechanical stretching on the expression of mucin( MUC)5AC in airway epithelial cells, and explore its mechanism of signaling pathway. Methods Mini-type multi-fuctional bio-impact machine was used to construct the model of mechanical stretching of airway epithelial cells. Three inhibitors of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway (JNK inhibitor, SP600125; p38 protein kinase inhibitor, SB203580; and ERK1/2 inhibitor, U0126) were administered at the concentration of 30 μmol/L, respectively. Besides, control group without mechanical stretching and single mechanical stretching group were established. Free calcium concentrations in cells before and after mechanical stretching were determined by flow cytometry and observed by laser confocal microscopy. The expression of MUC5AC mRNA and protein was detected by RT-PCR and ELISA, respectively. Results Mechanical stretching increased the concentration of free calcium and expression of MUC5AC mRNA and protein in cells (P ＜ 0. 01).U0126 and SB203580 decreased the expression of MUC5AC mRNA and protein (P ＜ 0.01). Conclusion Mechanical ventilation could increase the expression of MUC5AC in airway endothelial cells, the mechanism of which may be concerned with the increase of calcium concentration and ERK1/2 and p38 MAPK signaling pathway in cells.%目的观察机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白(MUC)表达的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨.方法采用多功能小型生物撞击机构建体外培养的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的三条主要通路抑制剂:JNK抑制剂(SP600125)、p38蛋白激酶抑制剂(SB203580)及ERK1/2抑制剂(U0126)(浓度均为30μmol/L),并设未进行机械牵张的对照组和单纯机械牵张组.采用流式细胞仪检测牵张前后胞内游离Ca<'2+>荧光强度的变化,激光共聚焦显微镜观察胞内游离Ca<'2+>"的分布情况,并分别采用RT-PCR和ELISA方法检测MUC5AC mRNA表达和蛋白分泌量.结果牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞胞内ca<'2+>浓度、MUC5AC mRNA和蛋白表达(均P<0.01).U0126和SB203580能抑制牵张所致MUC5AC mRNA和蛋白表达增加(均P<0.01).结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞黏蛋白表达,其机制可能与胞内Ca<'2+>浓度的升高以及ERK1/2、p38 MAPK信号通路有关.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2011(031)004【总页数】4页(P397-400)【关键词】机械牵张;游离钙离子;丝裂素活化蛋白激酶;黏蛋白5AC【作者】钟甜;尤列·皮尔曼;维克多·科罗索夫;周向东【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆,400010;俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心,布拉戈维申斯克,675000;俄罗斯医学科学院远东呼吸生理与病理研究中心,布拉戈维申斯克,675000;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆,400010【正文语种】中文【中图分类】R363.1;R563.8临床上对于危急重症的抢救常采用机械通气的方法，此类患者在机械通气施加后常出现气道黏液分泌增加，过量分泌的黏液在气道中滞留不仅加重了狭窄气道的阻塞，同时也为细菌在气道内的定植提供了良好的微环境[1]。

甲状腺素对人气道上皮细胞黏蛋白表达的调控吴小玲;周向东【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2009(19)2【摘要】目的研究甲状腺素对气道黏液分泌的影响及其调控机制.方法体外培养肺腺癌细胞株A349,给予甲状腺素刺激,用逆转录-多聚酶联反应法(KT-PCR)检测干预前后细胞中黏蛋白(MUC)5AC mRNA含量,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清中MUC5AC蛋白含量;用DNA重组技术,构建含荧光素酶报告基因和MUC5AC启动子不同长度片段的嵌合质粒,转染A549细胞,检测其荧光素酶的比活性.结果甲状腺素能够显著抑制MUC5AC基因转录和蛋白表达(t=5.35,P<0.05),并能使含有启动子序列-1330/+48bp、-1250/+48bp的嵌合质粒表达荧光素酶减少,与对照组相比差异有显著性(分别为t=3.08,P<0.05和t=5.00,P<0.05),但不能减少含有-1200/+48 bp和-1020/+48 bp的嵌合质粒荧光素酶表达(分别为t=0.82,P>0.05和t=0.40,P>0.05).结论甲状腺素能够抑制MUC5AC的基因转录和蛋白表达,MUC5AC基因5'上游-1.25/-1.20 kb区域存在参与甲状腺素调控该基因表达的调控元件.【总页数】4页(P168-171)【作者】吴小玲;周向东【作者单位】重庆医科大学附属第二医院,呼吸科,重庆,400010;重庆医科大学附属第二医院,呼吸科,重庆,400010【正文语种】中文【中图分类】R562【相关文献】1.TNF-α与香烟烟雾在诱导气道上皮细胞株黏蛋白表达的相互作用 [J], 李琪;周向东2.OGR1籍ERK信号通路参与酸性微环境致气道上皮细胞黏蛋白5AC表达 [J], 周万;周向东;尤列·皮尔曼;维克多·科罗索夫3.白藜芦醇抑制氧化应激减少人气道上皮细胞黏蛋白5AC表达 [J], 王博寒;史锁芳4.芪仙汤提取物缓解苯并芘诱导的人气道上皮细胞黏蛋白5AC高表达的机制研究[J], 孙亦鹏;史兆雯;倪振华;缪夏轶;林玉华;毕俊杰;王雄彪5.呼吸道合胞病毒感染对气道上皮细胞表皮生长因子受体、紧密连接相关蛋白及黏蛋白表达的影响 [J], 刘娟娟;张婷;米芋枚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

克拉霉素经NF-κB途径抑制肺炎支原体抗原诱导气道上皮细胞产生MUC5AC曾钧发;罗勇;桂培根【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2012(22)28【摘要】目的气道黏液过度分泌是多种慢性呼吸道疾病的重要特征.该研究旨在探讨肺炎支衣原(Mycoplasma pneumonia,Mp)抗原能否诱导气道上皮诱导产生MUC5AC黏蛋白,并探讨克拉霉素是否能影响其分泌.方法体外培养支气管上皮细胞,用不同浓度的Mp抗原刺激,免疫酶联吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测克拉霉素处理前后,支气管上皮细胞MUC5AC 的产生情况,并采用定量逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)法检测MUC5AC mRNA的表达.提取核蛋白,ELISA检测核因子κ B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活情况.结果肺炎支原体能以剂量依赖性方式诱导支气管上皮细胞产生MUC5AC和表达其mRNA,并能激活NF-κB.当提前用克拉霉素处理细胞后,能明显抑制MUC5AC的表达和NF-κB的活化.结论气道黏液过度分泌可能是Mp相关肺疾病的一种重要机制.克拉霉素在体外能抑制MUC5AC的产生,其机制可能与抑制NF-κB的激活有关.【总页数】5页(P30-34)【作者】曾钧发;罗勇;桂培根【作者单位】南华大学附属第二医院重症医学科,湖南衡阳421001;南华大学附属第二医院重症医学科,湖南衡阳421001;南华大学附属第二医院重症医学科,湖南衡阳421001【正文语种】中文【中图分类】R562.2【相关文献】1.支原体脂肽经EGFR/MMP-9诱导气道上皮细胞分泌MUC5AC [J], 文道林;余敏君;游晓星;李冉辉;陈列松;朱翠明;李媛媛;曾焱华2.泰利霉素经NF-κB途径抑制铜绿假单胞菌诱导MUC5AC表达 [J], 李波;罗金花;阳帆3.莫西沙星经ERK1/2通路抑制铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生MUC5AC [J], 谢莉;谭小武;曾赛丽;周洲;游晓星;何振华4.铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生MUC5AC的分子机制 [J], 李波;罗金花;阳帆5.早产儿气管抽吸物中白介素-1β导致气道上皮细胞通过NF-κB依赖性途径诱导白介素-8表达 [J], Shimotake T.K.;Izhar F.M.;Rumilla K.;M.B.Hershenson;虎小毅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

蛋白酶激活受体2在人中性粒细胞弹性蛋白酶诱发气道黏液速发式分泌中的作用及机制周佳;周向东;许瑞;唐小葵【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(000)006【摘要】Objective To investigate the role of protease‐activated receptor 2 (PAR2) in the neutrophil elastase (NE)‐in‐duced fast exocytosis of mucin 5AC (MUC5AC) in the airway and the possible mechanism.Methods The expression levels of PARs were detected in Calu‐3 cells in the control group and NE‐stimulated group by Western blotting.The wild‐type and PAR2 siRNA‐transfected Calu‐3 cells were treated by NE.The expre ssion level of MUC5AC in the supernatant was detected by ELISA.The concentration of intracellular calcium was measured by using fluorescence probe Fluo‐3AM and the expression level of protein kinase C (PKC) in the cytomembrane and cytoplasm by Western blotting.Cells were treated with NE in the wild‐type Calu‐3 cell group ,PAR2‐siRNA‐transfected group ,the calcium chelating (BAPTA‐AM )‐pre‐treated group and the PKC‐selec‐tive inhibitor (chelerythrine)‐treated group ,respectively.The concentration of MUC5AC was detected in the supernatant by ELISA and in the cytoplasm by immumofluorescence.Results Calu‐3 cells expressed PAR1 ,PAR2 and PAR3 with a predomi‐nant level of PAR2 and nearly negative expression of PAR4.The expression levels of PAR1 and PAR3 in NE‐stimulated Calu‐3cells were not significantly different from those in control group(P>0.05) ,whereas those of PAR2 were increased markedly in NE‐stimulated Calu‐3 cells when compared with control group (P<0.05).The level of MUC5AC and the concentration of in‐tracellular calcium were profoundly increased in the supernatant of NE‐stimulated wild‐type Calu‐3 cell group rather than in the PAR2‐siRNA‐transfected group when compared with the control group (P<0.05).PKC in Calu‐3 cells was translocated from the cytoplasm to the cell membrane after NE stimulation.The NE‐induced increase in the level of MUC5AC in the supernatant was weakened partly by PAR2 siRNA transfection ,the intracellular calcium chelating agent BAPTA‐AM and PKC‐selective in‐hibitor chelerythrine(P<0.05) .Conclusion NE stimulation can enhance the PAR2 expression and lead to fast exocytosis of&nbsp;M UC5AC via the activation of PAR2 ,increase of cytosolic calcium concentration ,and activation and translocation of PKC to the cell membrane.%目的：研究蛋白酶激活受体2（protease‐activated receptor 2，PAR2）在人中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase ，NE）诱发气道黏蛋白（mucin ，MUC）5AC速发式分泌中的作用及机制。

气道慢性炎症中黏蛋白5AC基因转录的调节李琪;周向东【期刊名称】《国际内科学杂志》【年(卷),期】2007(34)1【摘要】黏液高分泌是慢性气道炎症性疾病的重要病理特征之一,也是患者病情加剧恶化的重要因素.黏液中增加的黏蛋白主要以5AC为主,是气道黏液高分泌性疾病研究的主要黏蛋白表型.各种炎性介质、病原微生物及其产物、活性氧等能各自通过多种已知的信号转导通路,活化相关转录因子结合到黏蛋白5AC基因启动子上相应位点,促进转录,引起黏蛋白合成增加,其中以丝裂原活化蛋白途径及特殊蛋白-1的作用尤为突出.但目前对刺激因素到达膜受体前发生的一系列激活转换机制尚缺乏全面了解.另外糖皮质激素、维甲酸、甲状腺素等也通过核受体参与调控.各信号通路及转录因子之间还存在相互调节,构成复杂的信号转导网络.了解黏蛋白5AC基因的转录和表达的调控机制势必为深入研究气道黏液高分泌提供重要线索.【总页数】6页(P43-48)【作者】李琪;周向东【作者单位】重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆,400010;重庆医科大学附属第二医院呼吸内科,重庆,400010【正文语种】中文【中图分类】R974【相关文献】1.NF-κB3结合位点在人TNF-α基因转录调节作用中的研究 [J], 史须;李卓娅;龚非力;冯纬;徐勇;熊平2.基因转录调节系统中噪声和时间延迟诱导的相变行为研究 [J], 刘飞;贾正林;回忆3.细胞外信号调节蛋白激酶1/2抑制药对慢性阻塞性肺疾病小鼠气道高分泌黏蛋白5ac的作用机制 [J], 覃英娇;周向东;钟有清;王杰;刘峰4.呼吸道黏蛋白5AC基因转录表达的顺式调控元件分析 [J], 李升锦;周向东5.国家重大科学研究计划青年科学家专题“淋巴细胞发育中的基因转录后调节网络研究”项目启动 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

PM2.5导致气道黏液高分泌的分子机制研究发表时间：2017-03-29T13:46:17.767Z 来源：《医药前沿》2017年3月第7期作者：钟甜刘行仁(通讯作者) 郭璐滕鸿燕海英郎琴[导读] PM2.5导致气道黏液高分泌机制较复杂，可经氧化应激等多个途径引起肺组织损伤。

（四川省医学科学院四川省人民医院呼吸内科四川成都 610072）【摘要】目的：对PM2.5导致气道黏液高分泌的分子机制进行初步研究。

方法：取大鼠72只，随机分为对照组、空白对照组、PM2.5组（低剂量、中剂量、高剂量）、SP600125组6组，每组12只，对照组不处理，空白对照组给予生理盐水，PM2.5组按照剂量分别给予浓度10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg，SP600125组给予SP600125＋高浓度PM2.5。

结果：6组肺泡灌洗液黏蛋白5B(MUC5AC)、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、活性氧（ROS）水平与肺组织核转录因子（NF-kB）、表皮生长因子受体（EGFR）、钙激活氯离子通道（CLCAlRNA）磷酸化水平差异有统计学意义（P＜0.05），PM2.5低中高剂量存在递进关系，SP600125组MUC5AC、NE、ROS水平低于PM2.5高剂量组差异有统计学意意义（P＜0.05）。

结论：PM2.5导致气道黏液高分泌机制较复杂，可经氧化应激等多个途径引起肺组织损伤，且呈现剂量依赖，其对NE的影响可能为潜在的致病途径。

【关键词】PM2.5；空气污染；呼吸道疾病；气道黏液高分泌；机制【中图分类号】R114 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）07-0019-02【Abstract】Objective To study the molecular mechanism of PM2.5 induced primary airway mucus hypersecretion. Methods 72 rats were randomly divided into control group, blank control group, PM2.5 group (low dose, middle dose and high dose SP600125 group), 6 groups, 12 rats in each group, control group, control group received normal saline, PM2.5 group were given dose according to the concentration of 10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg SP600125, group SP600125 was treated with high concentration of PM2.5. Results 6 groups of bronchoalveolar lavage fluid 5B protein (MUC5AC) and neutrophil elastase (NE), reactive oxygen species (ROS) nuclear transcription factor levels and lung tissue (NF-kB), epidermal growth factor receptor (EGFR) and calcium activated chloride channel (CLCAlRNA) phosphorylation level difference was statistically significant (P < 0.05), high dose of PM2.5 in low there is a progressive relationship between PM2.5, lower than the high dose group of SP600125 group MUC5AC, NE, ROS levels had statistical significance (P < 0.05). Conclusion PM2.5 induced airway mucus hypersecretion mechanism is complex, the oxidative stress in a way cause lung injury, dose dependence, the effect on the NE may be potentially pathogenic pathways.【Key words】PM2.5; Air pollution; Respiratory disease; Airway mucus hypersecretion; MechanismPM2.5浓度每上升10μg/m3，肺癌死亡率将上升8%[1-2]。