2008_2012年山东省鸡传染_省略_管炎病毒遗传演化分析和致病性研究_胡北侠

我国鸡传染性支气管炎病毒的遗传变异和进化分析作者：李玉杰盛媛魏秀丽徐恩民吴静刘娜马秀丽来源：《家禽科学》2021年第06期摘要：本研究测定了2020年以来本实验室从不同地区分离的44个IBV毒株的S1基因序列，并与参考株序列进行比较分析。

结果发现分离的44个IBV毒株共占据5个分支。

其中：第一分支为QX型，包括25个分离株，QX型分离株又分为ClusterⅠ亚分支（7个）和ClusterⅡ亚分支（18个）;第二分支为4/91型，包括12个分离株;第三分支为LDT3型，包括3个分离株;第四分支为Mass型，包括2个分离株;第五分支为TW型，包括2个分离株。

从毒株遗传进化分析结果可以看出，QX型仍是我国IBV流行的主要基因型。

关键词：传染性支气管炎病毒;S1基因;遗传变异;进化变异中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2021）6-0005-05传染性支气管炎（IB）是鸡的一种急性、高度接触性的病毒性呼吸道疾病，在国内流行甚广。

传染性支气管炎病毒（IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属的成员之一，其基因组为单股线状正链RNA，含有3种主要结构蛋白，即纤突蛋白S、膜蛋白M和核蛋白N。

S1基因是IBV 基因组中最易发生变异的部位，其编码蛋白可诱导机体产生IBV特异的中和抗体和血凝抑制抗体，S1蛋白在进化上比M蛋白和N蛋白都表现活跃，因此可不断导致IBV新的血清型、亚型和变异株的产生，致使IBV疫苗免疫失败，给鸡传染性支气管炎的防制带来新的困难。

由于传染性支气管炎病毒血清型和变异株众多，各型之间无交叉反应或交叉反应差。

因此，对于传染性支气管炎的防控，首先需明确当地流行传染性支气管炎的血清型和变异株。

从分子水平揭示近年来IBV的变异情况以及不同毒株之间的进化关系，对我国今后开展传染性支气管炎的监测和综合防控具有重要的指导意义。

因此，本研究針对2020年以来从不同地区分离的44株IBV毒株进行S1基因序列测定，比较分析了分离毒株的遗传演化，明确流行的基因型与变异趋势，对疫苗选择和疾病防控具有参考价值。

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析的开题报告一、研究背景及意义鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，简称IB）是一种由禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的高度传染性呼吸道疾病，其主要临床表现为呼吸困难、鸡冠、眼睛和面部水肿、排泄物增多或减少等，对鸡的健康和养殖业的经济效益造成了很大的损失。

目前，虽然IBV可以通过疫苗预防和控制，但疫苗种类较多，不同毒株的疫苗保护效果不同，到目前为止，还没有一种完全有效的IBV疫苗，为了更好地预防和控制IBV感染，必须进一步深入研究IBV，对其分子特性和病理机理进行深入探究。

二、研究内容及目标本研究旨在通过分离IBV病毒，对其进行鉴定，并分析其S1基因序列，以期更深入地了解IBV的分子特性和病理机理，进而为研究和控制IBV感染提供科学依据和理论支持。

具体研究内容包括以下三个方面：1. 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定：本研究将从感染鸡的上呼吸道样本中提取IBV病毒，并通过细胞培养等方法进行纯化和鉴定，确定其毒株类型。

2. S1基因的PCR扩增和测序：本研究将采用PCR技术扩增IBV病毒S1基因序列，并进行测序，获取其S1基因序列。

3. S1基因序列分析：通过对IBV病毒S1基因序列进行分析，包括启动子、终止密码子、保守位点和可变位点等，在比较其与其他IBV序列差异的基础上，研究IBV病毒的分子特性和病理机理。

三、研究方法1. 实验材料：IBV感染鸡的上呼吸道样本、细胞培养液等。

2. 实验方法：（1）IBV病毒分离鉴定：将感染鸡的上呼吸道样本进行稀释后，接种于鸡胚蛋并进行细胞培养，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录PCR等方法对样本中IBV病毒进行鉴定。

（2）S1基因PCR扩增和测序：采用PCR技术，合成适合的引物，对IBV病毒中的S1基因进行扩增，经过聚合酶扩增反应、纯化等步骤后，得到S1基因的PCR产物，将其进行测序。

2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析的开题报告【题目】2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析【研究背景】传染性支气管炎是一种由传染性支气管炎病毒引起的家禽呼吸道疾病，能够导致家禽呼吸道炎症和肺部病变。

该疾病对家禽养殖业造成了重大威胁，尤其是在冬季和春季高发期间，其致死率和感染率较高，给养殖业造成了较大的经济损失。

为了更好地控制和管理传染性支气管炎，对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定和S1基因序列分析是非常必要的。

【研究目的】本研究旨在对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定，并通过S1基因序列分析，探究病毒的分布情况、遗传特征等方面的内容，为传染性支气管炎的防治和管理提供基础资料。

【研究内容】本研究将采用细胞培养和RT-PCR技术对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定，同时对其S1基因进行PCR扩增、克隆测序和分析，了解病毒的遗传特征、分布情况等方面的内容。

【研究方法】采用点滴法进行鸡传染性支气管炎病毒的分离培养，并通过RT-PCR技术对病毒进行鉴定。

使用PCR扩增技术对病毒S1基因进行扩增，克隆到载体上，然后进行测序。

通过序列比对和系统进化分析，探究鸡传染性支气管炎病毒的分布情况、遗传特征等方面的内容。

【预期结果】本研究将对2011-2012年鸡传染性支气管炎病毒进行分离鉴定和S1基因序列分析，明确病毒的分布情况和遗传特征，为传染性支气管炎的防治和管理提供基础数据和理论支持。

【研究意义】随着我国畜禽养殖技术的进步和养殖规模的扩大，传染性支气管炎对家禽养殖业的危害越来越大。

本研究将为传染性支气管炎的防治和管理提供基础资料和理论支持，探究病毒的分布、遗传特征等方面的内容，为科学防控这一疾病提供借鉴。

鸡传染性支气管炎病毒致病机理的研究进展余娟;刘兴友;王玲丽【摘要】鸡传染性支气管是由鸡传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病,由于病毒血清型较多,易于发生变异而难以免疫预防,成为养鸡业发展的重大阻力.文章就该病毒的致病机理方面的研究情况做一综述,为防制鸡传染性支气管炎提供科学依据.%Infectious bronchitis virus (IBV) is causative pathogen of infectious bronchitis (IB) , an acute, highly contagious respiratory disease in chickens, the infectious bronchitis virus has many serotypes and is easy to mutate, which has caused the difficulty for the disease's prevention, and impeded the development of poultry industry. This paper reviewed etiology, pathogenesis of the IBV in order to provide evidence for IB prevention and control.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(000)012【总页数】3页(P160-162)【关键词】传染性支气管炎病毒;病毒复制;致病机理【作者】余娟;刘兴友;王玲丽【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南郑州 450002;河南农业大学牧医工程学院,河南郑州 450002;河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.6鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病。

畜牧兽医学报 2023,54(6):2543-2554A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.032开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):中国禽传染性支气管炎病毒的遗传演化及时空传播分析范文胜1,刘思伽1,邱深本1,黄爱芳1,王 艳1,刘敏芳1,梅敏敏1,陈新亮1,韦 平2*,磨美兰2*(1.广东科贸职业学院动物科技学院,广州510430;2.广西大学动物科学技术学院,南宁530004)摘 要:对从G e n B a n k 数据库下载的所有传染性支气管炎病毒(i n f e c t i o u s b r o n c h i t i s v i r u s ,I B V )中国分离株之N 基因序列进行分析,旨在探索其遗传变异规律和时空传播情况㊂通过生物信息学软件M E G A 6.0㊁R D P 4.95㊁S i m -P l o t 3.5.1㊁B E A S T v 1.10.4㊁j m o d e l t e s t 2.1.7㊁T r a c e r v 1.7.1㊁T e m p E s t v 1.5.1㊁F i g T r e e v 1.4.3以及S pr e a D 3v 0.9.7等对分离株分别进行系统进化树㊁基因重组㊁毒株溯源㊁种群动态和时空传播分析㊂系统进化树分析显示,国内I B V 毒株分为6种基因型,以L X 4型为主;重组分析发现,1株四川分离株N 基因存在重组现象;贝叶斯最大分支置信树分析显示,中国I B V 最可能起源于20世纪30年代初的辽宁省㊂贝叶斯谱系地理学分析显示,I B V 毒株在国内存在多条传播路径并形成了3个流行中心:东北地区(黑龙江㊁辽宁和吉林)㊁华北和华东地区(河北㊁山东和江苏)以及华南地区(广东㊁广西),其中,山东最可能成为I B V 的毒株来源库㊂本研究揭示了中国I B V 的起源及其传播途径,N 基因存在基因重组现象,提示有必要加强分离株N 基因的分析,持续开展系统的分子流行病学研究㊂关键词:禽传染性支气管炎病毒;遗传变异;基因重组;起源;时空传播中图分类号:S 851.31 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2543-12收稿日期:2022-11-23基金项目:广东省普通高校特色创新类项目(2022K T S C X 268);广东科贸职业学院博士科研启动基金项目(G D KM 2022-95);广东科贸职业学院横向项目(G D KM -2022-A -49);广东省清远市清城区现代农业产业园项目作者简介:范文胜(1983-),男,广东清远人,博士,主要从事禽病与病原分子生物学研究,E -m a i l :2003424318@163.c o m*通信作者:韦 平,主要从事禽病与病原分子生物学研究,E -m a i l :p i n gw e i 8@126.c o m ;磨美兰,主要从事禽病与病原分子生物学研究,E -m a i l :m o m e i l a n @163.c o mG e n e t i c E v o l u t i o n a n d S p a t i o -t e m p o r a l T r a n s m i s s i o n A n a l ys i s o f t h e C h i n e s e I n f e c t i o u s B r o n c h i t i s V i r u sF A N W e n s h e n g 1,L I U S i j i a 1,Q I U S h e n b e n 1,HU A N G A i f a n g 1,WA N G Ya n 1,L I U M i n f a n g 1,M E I M i n m i n 1,C H E N X i n l i a n g 1,W E I P i n g 2*,MO M e i l a n 2*(1.C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,G u a n g d o n g P o l y t e c h n i c o f S c i e n c e a n d T r a d e ,G u a n g z h o u 510430,C h i n a ;2.C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,G u a n g x i U n i v e r s i t y ,N a n n i n g 530004,C h i n a )A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o e x p l o r e t h e r u l e s o f t h e g e n e t i c v a r i a t i o n a n d s p a t i o -t e m po -r a l t r a n s m i s s i o n o f t h e C h i n e s e I B V i s o l a t e s ,a l l t h e s e qu e n c e s o f N g e n e f r o m G e n B a n k d a t a b a s e w e r e d o w n l o a d e d .B i o i n f o r m a t i c s o f t w a r e i n c l u d i n g M EG A 6.0,R D P 4.95,S i m P l o t 3.5.1,B E A S T v 1.10.4,j m o d e l t e s t 2.1.7,T r a c e r v 1.7.1,T e m p E s t v 1.5.1,F i gT r e e v 1.4.3a n d S p r e a D 3v 0.9.7w e r e r e s p e c t i v e l y u s e d t o a n a l y z e t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f p h y l o ge n e t i c t r e e ,r e c o m -b i n a t i o n e v e n t s ,o r i g i n ,p o p u l a t i o n d y n a m i c s a n d s p a t i o -t e m po r a l t r a n s m i s s i o n o f t h e I B V i s o -畜牧兽医学报54卷l a t e s.T h e p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s s h o w e d t h a t a t o t a l o f s i x g e n o t y p e s w e r e i d e n t i f i e d,a n d t h e L X4-t y p e w a s t h e p r e d o m i n a n t g e n o t y p e.T h e r e c o m b i n a t i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t r e c o m b i n a t i o n e v e n t w a s f o u n d i n N g e n e i n o n e o f i s o l a t e f r o m S i c h u a n p r o v i n c e.T h e m a x i m u m c l a d e c r e d i b i-l i t y t r e e s h o w e d t h a t t h e C h i n e s e I B V s w e r e m o s t l i k e l y t o b e o r i g i n a t e d i n L i a o n i n g p r o v i n c e i n t h e e a r l y1930s.B a y e s i a n p h y l o g e o g r a p h i c a n a l y s e s i n d i c a t e d t h a t m u l t i p l e t r a n s m i s s i o n r o u t e s a n d t h r e e e p i c e n t e r s i n C h i n a w e r e f o u n d,i n c l u d i n g t h e N o r t h e a s t e r n R e g i o n(H e i l o n g j i a n g, L i a o n i n g,a n d J i l i n),t h e N o r t h e r n a n d E a s t e r n R e g i o n(H e b e i,S h a n d o n g a n d J i a n g s u)a n d t h e S o u t h e r n R e g i o n(G u a n g d o n g a n d G u a n g x i).S h a n d o n g h a s b e e n t h e s o u r c e o f s p r e a d s i n C h i n a. O u r s t u d y r e v e a l e d t h a t t h e I B V s'o r i g i n,t r a n s m i s s i o n r o u t e s a n d a r e c o m b i n a t i o n e v e n t o c c u r r e d i n N g e n e i n C h i n a,s u g g e s t i n g t h a t i t i s n e c e s s a r y t o c o n t i n u e t o c a r r y o u t t h e m o l e c u l a r e p i d e m i-o l o g y s t u d y a n d s t r e n g t h e n t h e a n a l y s i s o f t h e N g e n e o f I B V.K e y w o r d s:i n f e c t i o u s b r o n c h i t i s v i r u s;g e n e t i c v a r i a t i o n;r e c o m b i n a t i o n;o r i g i n;s p a t i a l t r a n s m i s-s i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:W E I P i n g,E-m a i l:p i n g w e i8@126.c o m;MO M e i l a n,E-m a i l:m o m e i-l a n@163.c o m禽传染性支气管炎(i n f e c t i o u s b r o n c h i t i s,I B)可引起养禽业严重的经济损失,禽传染性支气管炎病毒(i n f e c t i o u s b r o n c h i t i s v i r u s,I B V)属于套式病毒目冠状病毒科G a m m a-冠状病毒属的一员[1]㊂I B V为单股正链R N A病毒,全长约27.6k b,编码4种结构蛋白:刺突(S)蛋白㊁小膜(E)蛋白㊁膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白[2]㊂其中,S蛋白被蛋白酶切割成S1和S2两个亚蛋白[1]㊂由于S1蛋白含有决定血清型㊁病毒优势抗原位点等关键区域,大多数科研工作者均以S1蛋白作为靶对象进行研究[3-5]㊂然而,I B V的其它结构蛋白也具有重要的作用[6]㊂研究发现,N蛋白亦含有决定血清型的关键位点,其氨基酸的变异有可能导致I B V毒株血清型的改变[7]㊂此外,N蛋白是唯一位于膜内的蛋白,主要参与病毒R N A的合成㊁转录和翻译,在细胞免疫中起重要作用[8]㊂因此,为了更准确深入了解I B V毒株的遗传信息和分子变异机制,很有必要选择病毒相对保守的N基因作为研究对象进行分析㊂基因重组是I B V甚至其它动物冠状病毒进化和免疫逃避的重要手段[9]㊂研究发现,I B V由于其R N A病毒的特性,病毒在转录复制的过程中缺乏矫正机制,极容易发生基因的变异和重组[8,10]㊂目前,国内外很多研究只针对S1基因发生的重组进行分析,而I B V其它结构基因特别是N基因是否发生重组亦未可知㊂前期研究表明,国内I B V分离株已形成了有别于其它国家和地区独特的重组热点区域[2]㊂因此,基于N基因的重要性,很有必要进行国内所有I B V分离株N结构基因的重组分析,但目前国内相关研究还非常有限㊂中国是世界上主要的养禽大国,禽的地方品种丰富㊁饲养模式多样,不同的免疫程序㊁不同日龄群体混养㊁放养模式等无疑会加大I B防控的难度[11]㊂由于I B V频繁的碱基突变与基因重组容易导致新基因毒株的不断产生,并且不同时间㊁不同地区的I B V流行特点也不相同,因此持续的流行病学分析对I B防控具有重要意义[10]㊂目前,国内学者进行I B V流行病学分析一般具有地域限制,分离株数量㊁分离株跨度时间以及分析手段均有限㊂此外,至今国内关于I B V的时空动态及传播路径的研究很有限,非常有必要对全国范围内所有的I B V毒株进行长期㊁深入㊁系统的流行病学分析㊂鉴于此,本研究筛选具有完整毒株分离信息的1985 2022年国内所有I B V分离株(217株)N结构基因序列,分别进行系统进化树㊁基因重组㊁毒株溯源㊁谱系地理及种群动态历史等分析,旨在全面了解国内I B V N结构基因的遗传进化㊁起源及时空传播动态,为全国乃至世界范围内的I B V防控提供更有针对性的策略,也可以为其它动物冠状病毒甚至新型冠状病毒(S A R S-C o V-2)的防控提供参考㊂1材料和方法1.1中国分离株N基因序列来源及背景基于G e n B a n k数据库(h t t p s:ʊw w w.n c b i. n l m.n i h.g o v)选取截至2022年9月30日上传的所44526期范文胜等:中国禽传染性支气管炎病毒的遗传演化及时空传播分析有国内I B V分离株的全基因组序列,剔除分离年份或分离地点(省份)不明确的毒株,共获得217株I B V全基因组序列㊂国家地图为标准地图服务系统(h t t p:ʊb z d t.c h.m n r.g o v.c n/)的标准地图,将217株国内I B V分离株在地图上展示其具体分离信息(图1)㊂分析所用的I B V N结构基因序列均来源于全基因的截取(I B V分离株的G e n B a n k登录号㊁分离年份㊁分离地点等详细信息见图2)㊂32株I B V 参考株包括常用疫苗株㊁国际上主要血清型的毒株以及国内代表毒株[2]㊂每一个省份或直辖市(自治区)显示毒株数,从毒株最多(45,深红色)至毒株最少(0,白色)E a c h p r o v i n c e o r a u t o n o m o u s c i t y(z o n e)s h o w s t h e n u m b e r o f i s o l a t e s,f r o m m o s t c a s e s(45,d a r k r e d)t o n o c a s e(0, w h i t e)图1217株I B V分离株在中国的分布图F i g.1D i s t r i b u t i o n o f217I B V i s o l a t e s i n C h i n a1.2I B V N基因序列相似性分析和系统进化树构建将217株国内I B V分离株和32株参考株的N 结构基因序列应用在线生物软件M u l t i p l e A l i g n m e n t w i t h F a s t F o u r i e r T r a n s f o r m a t i o n(M A F F T),网址: h t t p s:ʊm a f f t.c b r c.-j p/a l i g n m e n t/s e r v e r/进行比对[12]㊂应用软件D N A S t a r7.1进行核苷酸序列相似性分析,应用软件M E G A6.0的邻接法(N e i g h-b o r-J o i n i n g,N J)进行系统进化树构建,设置b o o t-s t r a p值为1000[13]㊂1.3I B V N基因选择压力分析应用在线生物软件D a t a m o n k e y(h t t p:ʊw w w.d a t a m o n k e y.o r g/)的单一祖先计数方法S i n-g l e-l i k e l i h o o d a n c e s t o r c o u n t i n g(S L A C)㊁固定效应似然模型F i x e d e f f e c t s l i k e l i h o o d(F E L)以及混合效应进化模型方法M i x e d e f f e c t s m o d e l o f e v o l u-t i o n(M E M E)进行选择压力分析[6]㊂3种方法均检测到的氨基酸位点同为阳性或阴性证明有效㊂当d N(非同义置换率)/d S(同义置换率)>1时,为正向选择,反之则为净化选择㊂1.4I B V N基因重组分析应用重组分析软件R e c o m b i n a t i o n D e t e c t i o n P r o g r a m(R D P4.95)对N结构基因进行重组分析㊂R D P4.95软件的7种检测方法:R D P㊁G E N E-5452畜牧兽医学报54卷C O N V㊁B o o t s c a n㊁M a x C h i㊁C h i m e r a㊁S i S c a n及3S e q,至少4种检测方法可检测到重组断点且P值< 10-6证明检测结果可信[6]㊂应用另一重组分析软件S i m P l o t3.5.1进行进一步验证,两种重组软件分析结果相一致证明重组分析结果准确无误[6]㊂1.5I B V N基因分子进化速率分析将经过核苷酸序列比对后的217株I B V N结构基因序列,应用软件j M o d e l T e s t2.1.7进行基于88种模型的最佳模型筛选[14],筛选的最佳模型结果:G T R+G+I㊂应用软件T e m p E s t v1.5.1对217株I B V毒株的N结构基因序列进行R值相关系数矫正,筛选序列信息处于合理区间的数据进行进一步分析[15]㊂应用B E A S T v1.10.4版本进行贝叶斯树构建,选择严格分子钟(s t r i c t c l o c k)模型,采用基于蒙特卡洛马尔科夫链(M a r k o v C h a i n M o n t e C a r l o,M C M C)统计算法对N结构基因进行运算,以运算链的最终有效样本量(e f f e c t i v e s a m p l e s i z e, E S S)>200为标准进行调整,运算代次为2亿代次[2,16]㊂参数设置完毕后,运行B E A S T v1.10.4软件生成.x m l文件,应用T r a c e r v1.7.1进行各项参数分析,并确认N结构基因的分子进化速率值[17]㊂1.6I B V N基因进化起源及种群动态分析应用T r e e S t a r v1.10.4将上述运算结果生成T r e e s文件,剔除10%的抽样老化树枝,运行并生成最大分支置信树(m a x i m u m c l a d e c r e d i b i l i t y t r e e, M C C T r e e),通过F i g T r e e v1.4.3软件查看M C C 树,进行最近共同祖先(t h e m o s t r e c e n t c o mm o n a n c e s t o r,t M R C A)分析[15]㊂应用B E A S T v1.10.4软件进行N结构基因的贝叶斯天际线图(B a y e s i a n s k y l i n e p l o t s,B S P)分析,应用T r a c e r v1.7.1软件绘制贝叶斯天际线图[17]㊂1.7I B V N基因贝叶斯谱系地理学分析应用B E A S T v1.10.4软件的贝叶斯随机搜索变量选择(B a y e s i a n S t o c h a s t i c S e a r c h V a r i a b l e S e-l e c t i o n,B S S V S)模型对N结构基因的M C C树每个节点的可能地域进行评估[16]㊂将T r e e A n n o t a-t o r软件生成的文件导入S p r e a D3v0.9.7软件,采用贝叶斯因子(B a y e s F a c t o r,B F)以及后验概率值(p o s t e r i o r p r o b a b i l i t y,P P)对生成的传播路径进行验证,当B F>6且P P>5时证明可信[2,18]㊂在S p r e a D3v0.9.7软件中导出文件,将分析结果在地图上展示,以此模拟中国I B V的时空传播动态㊂2结果2.1I B V N基因序列的相似性分析和系统进化树构建相似性分析结果显示,217株国内I B V分离株N结构基因的核苷酸序列与参考株相似性为84.8%~100%㊂217株I B V分离株N基因与常用疫苗株H120㊁4/91㊁L D T3-A的核苷酸相似性分别为84.8%~100%㊁84.7%~100%㊁84.9%~ 100%;与上述疫苗株比较,N基因存在广泛的氨基酸突变㊂系统进化树分析结果显示,国内217株I B V分离株(除G X-C外)分属L X4(65.44%,142/ 217)㊁M a s s(15.67%,34/217)㊁4/91(8.29%,18/ 217)㊁C K/C H/L S C/99I(6.45%,14/217)㊁C o n n (2.31%,5/217)和T a i w a n(1.38%,3/217)共6种基因型(图2)㊂其中,L X4为优势基因型,M a s s 以及4/91分别为第二和第三大基因型(图3)㊂2.2I B V N基因选择压力分析选择压力分析结果显示,217株I B V N结构基因的d N/d S值:0.159(d N/d S<1),表明N基因处于净化选择压力,承受外界免疫压力下整体处于抑制状态以自身进化为主;但存在11个正向选择位点(表1)㊂2.3I B V N基因重组分析应用R D P4.95和S i m p l o t3.5.1两种重组分析软件对国内217株I B V N基因进行重组分析,两种重组分析软件的结果相一致证明结果可信㊂分析结果显示,2014年,在四川省分离的L X4型I B V分离株c k/C H/S C Y B/140913(G e n B a n k登录号: K U356856)发生了重组㊂该毒株N基因来源于2013年L X4型广西分离株c k/C H/L G X/130530 (主亲本)与2007年M a s s型黑龙江分离株c k/C H/ L H L J/07V I I(次亲本)之间的重组(图4)㊂其中, R D P4.95软件分析计算的R D P㊁G E N E C O N V㊁B o o t s c a n㊁M a x C h i㊁C h i m a e r a㊁3S e q的P值分别达到1.844ˑ10-19㊁1.150ˑ10-16㊁1.857ˑ10-19㊁2.560ˑ10-12㊁2.545ˑ10-12和1.248ˑ10-34㊂该分离株c k/C H/S C Y B/140913的重组区域为N基因的C-端部分(773 1230b p),重组区域和M a s s 型黑龙江分离株c k/C H/L H L J/07V I I相似性达到99.8%;其它区域的N基因序列与主亲本L X4型广西分离株c k/C H/L G X/130530的相似性则达到99.9%㊂64526期范文胜等:中国禽传染性支气管炎病毒的遗传演化及时空传播分析每种基因型I B V 以不同颜色标记㊂32株I B V 参考株以Ә标记㊂1985 1998年的1株I B V 分离株以标记㊂1999 2010年的69株I B V分离株以标记㊂2011 2014年的129株I B V 分离株以标记㊂2015 2022年18株I B V 分离株以标记E a c h t y p e o f I B V w a s h i g h l i g h t e d i n d i f f e r e n t c o l o r .T h e 32I B V r e f e r e n c e s t r a i n s w e r e m a r k e d w i t h f i l l e d Ә.O n e I B V s t r a i n i s o l a t e d d u r i n g 1985-1998w a s m a r k e d w i t h f i l l e d .S i x t y -n i n e I B V s t r a i n s i s o l a t e d d u r i n g 1999-2010w e r e m a r k e d w i t h f i l l e d .O n e h u n d r e d a n d t w e n t y -n i n e I B V s t r a i n s i s o l a t e d d u r i n g 2011-2014w e r e m a r k e d w i t h f i l l e d a n d e i g h t e e n I B V s t r a i n s i s o l a t e d d u r i n g 2015-2022w e r e m a r k e d w i t h f i l l e d 图2 217株I B V 分离株与32株I B V 参考株的N 基因遗传进化树分析F i g .2 P h y l o ge n e t i c t r e e s of t h e Ng e n e b e t w e e n 217I B V i s o l a t e s a n d 32I B V r e f e r e n c e s t r a i n s 2.4 I B V N 基因进化起源分析分子进化速率分析结果显示,I B V 毒株N 基因的分子进化速率为2.00ˑ10-3(95%置信区间:1.50ˑ10-3~2.55ˑ10-3)㊂最大分支置信树分析结果显示,国内I B V 分离株最可能起源(t M R C A )时间为1931.19年(95%置信区间:1896.99~1961.16);最可能起源地为辽宁省(图5)㊂居群动力学重构描述了I B V 的5个流行生长期(图6):20世纪50年代以前,I B V 毒株的遗传多样性较为平稳,未发现明显的基因变异(缓慢增长期);在1950 2000年毒株的遗传多样性上升趋势明显且在2000年达到高峰(快速增长期);20007452畜牧兽医学报54卷2006年毒株的遗传多样性趋于稳定(平稳期); 2006 2008年毒株的遗传多样性突然急剧下降(急速下降期);到了2008年末毒株的遗传多样性再次呈现上升趋势并趋于平稳(恒定增长期)㊂提示在1950 2006年I B V感染宿主的居群数量显著增多并呈现指数级增长,从而导致I B V遗传多样性大幅提高;但在2006 2008年I B V遗传变异频率突然下降,在2008年以后,开始处于稳定的遗传变异水平㊂2.5I B V时空动态传播分析结果基于国内I B V分离株N结构基因组序列应用s p r e a D3v0.9.7软件重塑I B V时空传播路径㊂通过贝叶斯因子(B F>6)对传播路径进行检验,图7及表2分析结果显示,中国I B V传播路径总体趋势为北方传播到南方㊂共形成5条主要的传播路径:1985 1998年只有1株I B V毒株(G X-C)分离到,且该毒株与其它基因型毒株同源性均很低,属于单独一群T h e r e w a s o n l y o n e I B V s t r a i n(G X-C)i s o l a t e d d u r i n g1985-1998,w h i c h s h o w e d c o n s i d e r a b l e l o w h o m o l o g y w i t h t h e a-b o v e o t h e r g e n o t y p e s a n d b e l o n g e d t o a s e p a r a t e g r o u p图3I B V分离株N基因在不同时间段基因型的占比F i g.3T h e p e r c e n t a g e s o f d i f f e r e n t g e n o t y p e s b a s e d o n t h e Ng e n e o f I B V i s o l a t e s i n d i f f e r e n t y e a r s表1217株I B V分离株N结构蛋白的选择压力T a b l e1T h e s e l e c t i o n p r o f i l e s o f N p r o t e i n o f217I B V i s o l a t e s模型M o d e l N蛋白N p r o t e i nS L A C F E L M E M E d N/d S值M e a n d N/d S0.159正向选择位点数量N u m b e r s o f p o s i t i v e s e l e c t i o n s i t e121313净化选择位点数量N u m b e r s o f p u r i f y i n g s e l e c t i o n s i t e191160177正向选择位点P o s i t i v e l y s e l e c t e d s i t e s(a a)4,6,7,46,235,322,342,346,350,356,370第一条传播路径为东北地区的辽宁㊁黑龙江传播到山东(B F>100);第二条传播路径为华东地区的山东传播到吉林㊁河北和江苏(B F>100);第三条传播路径为山东传播到安徽㊁江苏传播到山西(B F>30);第四条传播路径为华南地区的广西传播到广东(B F>100)㊁广西传播到云南(B F>10);第五条传播路径属于长距离传播,从东北地区的黑龙江传播到华南地区的广东㊁山东传播到广西㊁湖南以及吉林传播到甘肃(B F>10)㊂第六条传播路径属于短距离传播,从河北传播到北京(B F>10)㊂此外,山东传播到河北㊁山东传播到吉林以及山东传播到江苏的贝叶斯因子值均超过10000,推测山东省最可能成为I B V在中国各省区传播过程的毒株来源库㊂随后,以山东为中心快速散播到其它省份,由此导致了I B V在中国的流行(图7)㊂3讨论目前,中国已成为世界主要的家禽生产和消费大国[11]㊂尽管M a s s型(H120㊁H52㊁M a5㊁28/86㊁M41和W93)㊁4/91型(N N A)㊁L D T3-A㊁Q X L87等疫苗已在养殖场广泛使用,但I B问题依然困扰养殖场[2-4,6,10]㊂为了全面深入了解我国I B V N基因的遗传变异趋势以及时空传播动态,本研究对1985 2022年全国共217株I B V N结构基因序列进行了跨度37年的流行病学分析㊂系统进化树分析结果显示,I B V N结构基因分为6个基因型㊂其中,L X4型㊁M a s s型㊁4/91型分列优势基因型的第1~3位㊂V a l a s t r o等[19]基于I B V S1基因的系统进化树分析结果,将国际上I B V 分为6大类共32个谱系(基因型)㊂前期研究表明,基于S1基因分析结果国内I B V呈现L X4型(G I-19,约57%)占据优势地位,M a s s型(G I-1,约17%)次之,4/91型(G I-13,约11%)占据第3位,共分为7个谱系(基因型)的情况[2]㊂本研究结果与前期研究基于S1基因序列的分析结果相近而不完全相同㊂因此,基于N基因的系统进化树分析亦可真实反映I B V的基因型流行情况㊂此外,本研究结果显示I B V的N基因相对保守且处于净化选择压力下,但845294526期范文胜等:中国禽传染性支气管炎病毒的遗传演化及时空传播分析A.B o o t S c a n分析;B.S i m P l o t相似性分析;C.重组区域构建的进化树;D.非重组区域构建的进化树;Ә为重组毒株,һ为主亲本毒株,ʏ为次亲本毒株A.B o o t S c a n a n a l y s i s;B.S i m P l o t s i m i l a r i t y a n a l y s i s;C.P h y l o g e n e t i c t r e e f o r r e c o m b i n a n t r e g i o n s;D.P h y l o g e n e t i c t r e e f o r n o n-r e c o m b i n a n t r e g i o n s.Ә.P o t e n t i a l r e c o m b i n a n t,һ.P o t e n t i a l m a j o r p a r e n t,ʏ.P o t e n t i a l m i n o r p a r e n t图41株四川I B V分离株N基因的重组分析F i g.4R e c o m b i n a t i o n a n a l y s i s o f o n e S i c h u a n I B V i s o l a t e s i n N g e n e畜 牧 兽 医 学 报54卷图5 I B V 分离株的分子钟系统进化树F i g .5 T h e m a x i m u m c l a d e c r e d i b i l i t yt r e e o f I B V i s o l a t es 图6 I B V 分离株居群动力学分析结果F i g .6 P o p u l a t i o n g e n e t i c d yn a m i c s o f I B V i s o l a t e s 亦存在若干正向选择位点㊂正向选择位点对R N A病毒的结合活性至关重要[20]㊂N 基因的研究不仅有利于深入了解N 蛋白的相关功能,而且有助于重建冠状病毒的进化路径[21]㊂因此,本研究选择相对保守但具有重要生物学意义的N 基因进行相关生物信息学分析㊂I B V 容易发生基因重组,不仅可造成新变异株的出现而且可引起抗原位点的漂移和变换,导致免疫失败的发生[9,22-23]㊂重组分析结果显示,1株2014年分离的四川I B V 分离株c k /C H /S C Y B/140913在N 基因发生了重组(次亲本为M a s s 型毒株)㊂前期研究结果显示,该毒株在非结构蛋白区域和S 基因亦发生了基因重组,且次亲本亦为M a s s型毒株[2]㊂因此,M a s s 型毒株(众多商品活毒疫苗株)参与基因重组的现象需引起人们足够的重视㊂K u o 等[20-21]基于台湾分离株N 基因分析发现,台湾55215526期范文胜等:中国禽传染性支气管炎病毒的遗传演化及时空传播分析图7基于贝叶斯因子(B F)检验的I B V分离株区域传播分析图F i g.7M a p s h o w i n g t h e r e g i o n a l t r a n s m i s s i o n a n a l y s i s f o r I B V i s o l a t e s b a s e d o n B a y e s f a c t o r(B F)t e s t表2217株I B V分离株N基因的贝叶斯因子检验T a b l e2B a y e s F a c t o r t e s t f o r N g e n e o f217I B V i s o l a t e s a m o n g g e o g r a p h i c a l r e g i o n s起始B a y e s f a c t o r后验概率P o s t e r i o r p r o b a b i l i t y F r o m终点T o贝叶斯因子黑龙江H e i l o n g j i a n g山东S h a n d o n g77832.235821辽宁L i a o n i n g山东S h a n d o n g77832.235821山东S h a n d o n g河北H e b e i77832.235821山东S h a n d o n g吉林J i l i n38911.79390.999777802山东S h a n d o n g江苏J i a n g s u25938.313260.999666704广西G u a n g x i广东G u a n g d o n g802.19451390.989334518山东S h a n d o n g安徽A n h u i87.333334890.9098989江苏J i a n g s u山西S h a n x i43.629263150.834573936黑龙江H e i l o n g j i a n g广东G u a n g d o n g29.603022370.77391401山东S h a n d o n g湖南H u n a n24.962027270.742695256河北H e b e i北京B e i j i n g17.605222990.670592156山东S h a n d o n g广西G u a n g x i16.341021580.653927341广西G u a n g x i云南Y u n n a n11.644175010.573825131吉林J i l i n甘肃G a n s u11.008762650.560048883畜牧兽医学报54卷分离株N基因亦出现基因重组现象,重组不仅驱动了I B V种群进化导致新毒株种群的出现,而且增强了毒株的适应能力㊂因此,该四川分离株频繁的基因重组现象是否会导致其致病性的改变和免疫逃避现象的发生同样值得我们关注㊂目前,基于贝叶斯理论的分析技术已在S A R S-C o V-2等冠状病毒的溯源及时空传播方面应用广泛[24],但该技术在家禽的疾病防控及监测中暂未得到广泛的应用㊂贝叶斯最大分支置信树分析结果显示,国内I B V最可能起源于20世纪30年代初的辽宁省㊂因此,本研究与前期研究基于全基因组序列和S1基因序列的分析结果相比呈现溯源地相同㊁溯源时间相近而不完全一致的结果[2]㊂提示不同的结构基因片段可能具有不同的遗传进化史㊂研究表明,禽流感病毒的传播路径与家禽的贸易路线高度吻合[25]㊂有趣的是,本研究发现I B V的传播路径也与家禽的贸易路线高度吻合㊂基于I B V 的传播路径分析显示,国内I B V的传播表现出地理传播的连续性㊂研究表明,禽流感病毒的谱系传播与各省份的家禽贸易量以及候鸟迁徙密度呈正相关;与公路运输的距离呈负相关[25]㊂本研究结果显示,国内I B V的传播路径与活禽交易网络呈正相关,贸易越密集㊁病毒输入与输出越频繁㊁贝叶斯因子值越大㊁分析的传播路径越可信㊂因此,可以得出以下结论:国内I B V的传播主要是基于活禽的贸易和运输进行传播;而长距离传播路径(黑龙江传播到广东㊁山东传播到广西以及吉林传播到甘肃等)极有可能是通过候鸟的迁徙进行传播㊂结合前期研究[2]㊁本研究的贝叶斯分析结果和中国实际情况,推测国内I B V未来相当长一段时间内L X4型I B V将依然占据优势基因型地位,但其占比会逐渐缩小,而其它基因型(如T a i w a n型等)毒株占比将逐渐增加;此外,随着频繁的贸易往来L X4型I B V已呈现浪潮式向中东㊁欧洲以及非洲传播并将极有可能成为上述地区的优势基因型㊂本研究运用的贝叶斯谱系地理学分析方法有助于科研工作者准确了解国内I B V的时空传播动态,对I B V的防控具有重要的意义㊂当然,本研究也有一定的局限性,不同省份㊁不同时间段的I B V分离株数量并不均匀有可能限制了时空分析结果的准确性㊂研究表明,病毒遗传变异的发生㊁维持与病毒种群动态大小的变化息息相关[26]㊂种群动态分析结果表明,20世纪50年代以前,国内I B V遗传多样性较为平稳,但1950年以后遗传多样性显著上升,猜测可能与新中国成立后国民经济缓慢恢复,鸡群养殖量逐年上升有关㊂但在2006年以后病毒的遗传多样性急剧下降,可能与2005年在青海湖的候鸟暴发H5N1禽流感导致家禽养殖业遭受毁灭性打击,家禽养殖量急剧萎缩进而导致I B V感染宿主的居群数量逐渐减少有关[27]㊂有趣的是,2008年后I B V 的种群动态出现显著上升㊂病毒种群动态的变化与疫苗的免疫与否息息相关[28-29]㊂因此,2008年I B V 种群动态的上升,推测与现有疫苗不能有效防控在2008年后即成为优势基因型的L X4型I B V感染有关㊂2018年后政府相关部门批准了L X4型商品弱毒疫苗株Q X L87的上市,但该疫苗的免疫对鸡群的保护效果如何暂未可知,本研究团队将长期持续地进行I B V流行病学监测㊂4结论基于N基因的分析结果表明国内I B V处于L X4型占优㊁多基因型并存的现状㊂基因重组分析结果显示,1株I B V毒株的N基因出现基因重组现象㊂国内I B V最可能起源于20世纪30年代初期的辽宁省㊂I B V毒株在国内存在多条传播途径且山东省最可能成为国内I B V的毒株来源库㊂本研究结果有助于人们深入了解国内I B V流行毒株N基因的演化和时空传播动态,也为我国I B V流行毒株的防控提供了更有针对性的策略㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] C A V A N A G H D.C o r o n a v i r u s a v i a n i n f e c t i o u sb r o nc h i t i s v i r u s[J].V e t R e s,2007,38(2):281-297.[2] F A N W S,C H E N J M,Z HA N G Y,e t a l.P h y l o g e n e t i c a n d s p a t i o t e m p o r a l a n a l y s e s o f t h ec o m p l e t e g e n o m e s e q u e n c e s o f a v i a n c o r o n a v i r u si n f e c t i o u s b r o n c h i t i s v i r u s i n C h i n a d u r i n g1985-2020:r e v e a l i n g c o e x i s t e n c e o f m u l t i p l e t r a n s m i s s i o n c h a i n sa n d t h e o r i g i n o f L X4-t y p e v i r u s[J].F r o n tM i c r o b i o l,2022,13:693196.[3] L I A N J M,WA N G Z X,X U Z Y,e t a l.D i s t r i b u t i o na n d m o l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f a v i a n i n f e c t i o u sb r o nc h i t i s v i r u s i n s o u t h e r n C h i n a[J].P o u l t S c 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四省区鸡传染性支气管炎病毒M、N基因分子流行病学研究的开题报告一、研究背景鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起的一种急性呼吸道疾病，主要影响鸡的呼吸系统和生殖系统，导致鸡的生产能力下降，繁殖障碍等问题。

IBV是一种单链RNA病毒，其转录后的蛋白主要包括四种类型：S、M、E和N蛋白，其中S蛋白是决定IBV血清型的重要因素。

我国是养鸡业大国，IBV也是我国鸡场的常见病之一。

近年来，随着复制技术和PCR检测技术的发展，以及不同地区IBV的分离、基因序列的测定等工作的推进，人们发现IBV菌株的多样性和变异性越来越大，这使得IBV的病原学研究、防控和诊断等方面变得更加复杂和困难。

因此，研究IBV的分子流行病学具有重要意义。

二、研究内容本研究将采集来自四个省区（广东、江苏、湖南、山东）的IBV病毒样本，利用反转录PCR和测序技术对其M、N基因进行分子流行病学研究，并对其基因序列进行比较和分析，对IBV的遗传变异和基因演化进行探究。

具体研究内容如下：1.采集IBV样本：从四个省区的不同鸡场中采集IBV病毒样本，保持其完整性和纯度，同时记录相关信息，包括鸡的品种、年龄、养殖方式等。

2.反转录PCR：采用反转录PCR扩增IBV M、N基因，并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

3.测序分析：筛选扩增出的M、N基因阳性样本，利用测序技术获得其基因序列，并进行测序质量控制和测序结果分析。

4.比较分析：利用生物信息学工具，对IBV M、N基因的序列进行分析和比较，包括序列同源性、进化关系、基因多样性等方面的分析。

5.结果分析：根据分析结果，绘制序列同源性分析图、进化树等图表，得出IBV的M、N基因分子流行病学特征，对其基因演化和变异进行研究。

三、研究意义本研究将对我国IBV病毒的M、N基因分子流行病学进行系统探究，为IBV的防控和疫苗设计提供更加科学、准确的基础数据。

山东部分地区禽传染性支气管炎流行病学调查张春阳;兰邹然;李宏梅;刘坤;孔祥华;王贵升;姜子昕;王苗利【期刊名称】《中国家禽》【年(卷),期】2024(46)6【摘要】为了解近年来山东省流行的禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)S1基因遗传特性,试验于2020-2023年从山东14个地市的肉鸡养殖场及蛋鸡养殖场共收集462份病料(包含组织器官、泄殖腔拭子和咽拭子),采用RT-qPCR和RT-PCR对病料进行IBV检测。

结果显示:山东省2020-2023年肉鸡和蛋鸡养殖场IBV阳性检出率为27%(125/462),并在3年试验期间IBV感染率呈现逐年上升趋势,在初春、秋末及冬季感染率较高,以济南(49%)、泰安(33%)和东营(28.9%)地区IBV阳性检出率最高,肉鸡的IBV感染率略高于蛋鸡。

试验成功分离37株IBV分离株,其S1基因核苷酸同源性为74.8%~99.8%,分属GⅠ-22、GⅠ-13、GⅠ-7、GⅠ-1、GⅠ-28(LZ05型)和GⅠ-19(QX型)6种基因型,其中QX型为分离株优势基因型(83.7%,31/37)。

31株QX型IBV分离株S1基因在第68、116、208、261、333和369位的碱基突变、替换最为频繁。

研究提示:山东部分地区IBV感染率呈现逐年上升趋势,多发于寒冷季节且肉鸡发病较为严重,流行毒株仍以QX基因型为主,并且LZ05型首次在鲁中地区被检出。

【总页数】7页(P86-92)【作者】张春阳;兰邹然;李宏梅;刘坤;孔祥华;王贵升;姜子昕;王苗利【作者单位】山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心);山东农业大学动物科技学院;河北省邯郸市峰峰矿区动物疫病预防与控制中心【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.2010-2012年中国部分地区鸡传染性支气管炎流行病学调查2.山东省部分地区禽源致病性大肠杆菌的血清流行病学调查与耐药性检测3.2010—2011年河南省部分地区H9亚型禽流感、新城疫和鸡传染性支气管炎的流行病学调查4.山东、安徽部分地区2016年禽致病性大肠杆菌的分子流行病学调查5.江苏、山东部分地区禽致病性大肠杆菌流行病学调查因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。