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基因工程5-重组子筛选(中国药科大学生物工程所有课件)

基因工程5-重组子筛选(中国药科大学生物工程所有课件)

二抗 二抗上联着一种酶
（碱性磷酸酶、过 氧化物酶、脲酶 等）。
显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反 应转变成有色物质（或发光）。 比色：在特殊的分光光度仪 （酶标仪）上比色，打印出 结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
四、原位杂交
1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中 的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待检核 酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交
探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目 的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
（1）菌落印记原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
2. ELISA检测的一般步骤
固定样品:将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后就被固 定在孔底。 一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的 抗体。
孔底
一抗
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 二抗结合：抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
无质粒的 受体菌
-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
（2)Southern blotting

重组体筛选和鉴定PPT课件

重组体筛选和鉴定PPT课件
通过在培养基中添加抗生素或 其他抗性标记物，筛选出含有 目的基因的重组细胞或菌落。
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。

重组子筛选与鉴定PPT文档共105页

重组子筛选与鉴定PPT文档共105页
重组子筛选与鉴定
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一பைடு நூலகம்熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克

重组体的筛选和鉴定81页PPT

重组体的筛选和鉴定81页PPT

谢谢！
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
重组体的筛选和鉴定
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
ห้องสมุดไป่ตู้
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。

第三节重组子的筛选与鉴定-西安电子科技大学个人主页系统.ppt

第三节重组子的筛选与鉴定-西安电子科技大学个人主页系统.ppt
只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交， 在底片上曝光显示。
三、核酸分子杂交检测法
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 1.
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法 2 用（或）探针检测样品。
主要检测插入片断是 否被转录。
三、核酸分子杂交检测法
(二)核酸杂交检测方法
3. 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
从转化后的 菌体克隆中分离 质粒，电泳、比 较其分子量。
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法 1. 原理 根据已知的外源序列的限制性酶切图谱，
选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳 结果（带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用其
二、物理检测法
(二)酶切电泳筛选法
A或B
二、物理检测法
A
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 待测基因
125I标记的二抗
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法
2. 放射性抗体检测法过程
四、免疫化学检测法
(一)放射性抗体检测法 3. 双位点检测法
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
节重组子的筛选与鉴定
一、遗传学检测法 二、物理检测法
第三节 重组子的筛选与鉴定
相关概念 转化子
导入外源基因分子后能稳定存在的受体细胞； 重组子
含有重组分子的转化子； 筛选和选择
经过各种方法将外源分子导入受体细胞后，获得所需的阳性重组子的过程； 筛选

重组子的筛选与鉴定.ppt

重组子的筛选与鉴定.ppt
• 指编码的产物能够使转化或转染的细胞在有选择 剂或营养缺乏的情况下很好生长或表现出其他可 视特征的基因。
• 构建载体时，目的基因与选择标记基因在载体上 的空间关系有两种： 1、独立存在。用于区分转化细胞与未转化细胞 2、目的基因插入选择标记基因编码区或其基因调 控部分。用于区分空载体转化细胞与重组载体转 化细胞
例
• 如pBR322质粒含有TC r、Amp r两个抗药性基因，外源基 因插入失活TC r后，会有三种不同表现的细胞:
• 未转化的受体细胞— TC sAmp s • 含载体的转化菌落－ Ampr Tcr • 含重组体的阳性菌落—Ampr Tcs
空载体转化菌落
空载体转化菌落及 重组载体转化菌落
筛选具体做法
2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选
——cI筛选法
• 原理：cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠 杆菌进入溶原化状态； cI基因的插入失活使感染了λ噬菌 体的大肠杆菌由溶原状态进入溶菌状态。 重组噬菌斑：无色透明 非重组噬菌斑：浑浊 未转化菌：正常菌落
Polylinker插入不影响lacZ′基因表达
2、博来霉素抗性基因：zeocin
3、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因：gpt
黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）
基因（ecogpt）选择系统
• 由大肠杆菌Ecogpt 基因编码的黄嘌呤-鸟嘌呤磷
酸核糖基转移酶（XGPRT）是一种核苷酸代谢酶， 能够把黄嘌呤转变为黄苷酸（XMP），并最终形 成鸟苷酸（GMP）。
1、用转化反应液涂布含氨苄的LB平板，长出转化子— Ampr ；
2、用无菌牙签将Ampr的转化子逐一挑在Tc平板上（或用 无菌丝绒布、无菌滤纸影印），比较两块板上的菌落生 长情况，从Amp板上挑选出Tc板上不长的菌落即为重组 子。

基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx

基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx

此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜
先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制 嘧啶呈 现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含 有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平 为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择 转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是 由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄 主细胞新的抗性表型所致。
6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子
把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主 要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体 包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区； 二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75~105%的长度时，才能在培养平板上 形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不 会包装成பைடு நூலகம்的噬菌体颗粒的。
对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探
针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。

重组克隆的筛选与鉴定.ppt

重组克隆的筛选与鉴定.ppt
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性， 来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素， 又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重 组子细胞。
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③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
6
图 pBR322的结构图
42
2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
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3. 分子杂交法
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第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。

重组体的筛选与鉴定优秀课件

重组体的筛选与鉴定优秀课件
法
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
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ori
yes
yes
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Replica plating: one plate
to another using absorbent pad or Velvet (绒布).
transfer of colonies
+ampicillin
+ ampicillin + tetracycline
噬菌斑，从而达到初步筛选的作用。
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二、应用限制性内切酶酶切分析筛选
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培 养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用 相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入 片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切 酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片 段和载体的大小。
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2
不同检测方法可以归类于以下三个层次： 1. 载体遗传标记检测 2. 克隆DNA序列检测 3. 外源基因表达产物检测
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3
一、根据遗传表型筛选
1．抗生素平板筛选 2．互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选
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4
1．抗生素平板筛选
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有 抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗 卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载 体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的 插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子 的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长 成菌落。
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3．插入表达筛选
有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负 调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的 筛选标志基因才能表达，如pTR262质粒其Tetr基因 上 游 存 在 CI 基 因 的 负 调 控 序 列 ， CI 基 因 可 以 抑 制 Tetr 基 因 的 表 达 ， 当 外 源 DNA 片 段 插 入 CI 基 因 的 HindⅢ或Bgl I位点时，Tetr基因阻碍解除而表达， 阳性重组子为Tetr表型，而质粒本身为Tet - 表型， 故转化细菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片 段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落。
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因此当载体带有LacZ调节序列和编码半乳糖苷酸 N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列 缺陷、其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编 码的片段本身都没有活性，但它们互相协助则可在 大肠杆菌内形成一个具有酶活性的蛋白质。故在诱 导物IPTG存在下，细菌在含生色底物5-溴-4-氯-3吲哚--D-半乳糖苷(X-gal)培养基的平板上可形成 蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时， 可使-半乳糖苷酶的氨基末端失活，从而不能进行 互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。
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但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未 酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成 的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是 阳性重组子的初步筛选。
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同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含 有两个抗药性基因的载体中，通过插入失活其中一 个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选 阳性重组子。如pBR322质粒含有Tetr、Ampr双抗 药性，插入失活Tetr后，Tet r 、Ampr为含载体的阴 性菌落，Tet - 、Ampr表型的菌落为阳性，Tet - 、 Amp - 的表型不能生长，对未转化的受体细胞，该 方法筛选出阳性重组子的几率较高(Tetr：四环素抗 性；Ampr：氨苄毒霉素抗性，Tet - ：对四环素敏感； Amp - ：对氨苄青霉素敏感)
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Screening by insertional inactivation of a resistance gene
Ampr Tcr
pBR322
BX B
ori Ampr
B Ampr
X
Tcr
ori
B
Ampicillin resistant? yes
Tetracycline resistant? No 优选文档
these colonies have bacteria with recombinant plasmid
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2．互补筛选
利用-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒 常采用互补筛选。-半乳糖苷酶 (-galactosidase) 是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用 的-半乳糖酶基因来自大肠杆菌的Lac操纵子，它们 使载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码 -半乳糖苷酶N末端146个氨基酶的序列。用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨基末端片段 的合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶缺 陷型进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程 称-互补。
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4．噬菌斑筛选
对于以λ噬菌体载体系统，外源DNA插入λ噬菌 体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型 λDNA长度的78％～105％范围内，才能在体外 包装成具有感染活力的噬菌体颗粒，感染细菌后， 形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA片段插入的载 体不能包装成噬菌体颗粒，不能感染细胞并形成
第六章 阳性重组子的筛选和鉴定（检）
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必 须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化 子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重 组子。
• 转化子
• 重组子
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• 目的重组子
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阳性重组子的筛选和鉴定（检）
一、根据遗传表型筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 五、菌落原位杂交技术
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所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外 源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基 因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区 分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。 但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。
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三、核酸探针筛选
为了进一步确定DNA插入片段的正确性，在内切 酶消化重组子凝胶电泳分离后，通过Southern印 迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性核 素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针， 进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所 需的靶基因片段。