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光合细菌的研究和应用专业：土木工程姓名：景宝学号200803129 指导老师:温建新摘要：光合细菌作为一种厌氧菌,本身含有多种营养物质和生理活性物质,具有进行光合作用、发酵以及固氮、产氢等功能，既有理论意义又具有实用价值，特别是它在废水处理、生物产氢、生物制药、水产养殖和农牧业的生产中的广泛应用，使其成为现代生物技术研究的热点之一。
关键词：光合细菌厌氧研究进展生长环境应用英文名：Photosynthetic Bacteria Abbr. name: PSB 光合细菌(简称PSB)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。
光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。
光合细菌的适宜水温为15℃—400℃，最适水温为28℃—360℃。
在水产养殖中，能够降解水体中的亚硝酸盐、硫化物等有毒物质，实现充当饵料、净化水质、预防疾病、作为饲料添加剂等功能，光合细菌适应性强，能忍耐高深度的有机废水和较强的分解转化能力，对酚、氰等毒物有一定有忍受和分解能力等特点，它的诸多特性，使其在无公害水产养殖中具有巨大的应用价值。
光合细菌在有光照缺氧的环境中能进行光合作用，利用光能进行光合作用，利用光能同化二氧化碳，与绿色植物不同的是,它们的光合作用是不产氧的。
光合细菌细胞内只有一个光系统，即PSI，光合作用的原始供氢体不是水，而是H2S （或一些有机物），这样它进行光合作用的结果是产生了H2，分解有机物，同时还能固定空气的分子氮生氨。
光合细菌在自身的同化代谢过程中，又完成了产氢、固氮、分解有机物三个自然界物质循环中极为重要的化学过程。
这些独特的生理特性使它们在生态系统中的地位显得极为重要。
藻类与光台细菌的生长协同作用。
当污水中有藻类生长以后，藻类很快占有优势，吸收了大量的光源，而从抑制了光台细茁的生长．ＣＤ物质去除少或没有去除。
在热杀死藻类后的污水中接种光合细菌，丽Ｏ就可以实现高效快速培养光台细菌的目的，同时培养液中的光台细菌纯度大，经济利用价值高；从而实现了污水的资源化处理：培养物，杂菌含量高，经济价值小。
由于光合细菌利用大分子有机物比较困难，脱氨氮能力小。
本研究讨论了藻类与光合细菌的生长协同作用。
当污水中有藻类生长以后，藻类很快占有优势，吸收了大量的光源，从而抑制了光合细菌的生长，-./ 物质去除少或没有去除。
在热杀死藻类后的污水中接种光合细菌，就可以而实现高效快速培养光合细菌的目的，同时培养液中的光合细菌纯度大，经济利用价值高；从而实现了污水的资源化处理。
"* "* ! 分批培养由于藻类在生活污水中有较大的生长速率，可以抑制光合细菌的生长。
为了避开藻类对光和细菌的影响，本研究采用优先培5* . 6 !.5 个。
在藻类优先充分培养，在杀藻类后可能由于藻类的死亡分解产生了较多的生长因子，提供给光合细菌良好的生长环境，使得到的培养物有较大的光合细菌的纯度，有机物质转化较为充分7 有利于资源化的利用。
用藻类预生长可以提高光合细菌的生长速率，获得大量的可供养殖业利用的活性光合细菌；可以较好地实现生活污水的转化净化；较其他的反应器更能够节约能源，达到污水的资源化利用。
由于人类活动的影响, 可能在短期内会使大量含氮含磷等植物性营养物质进入水体, 从而引起藻类和浮游生物的迅速繁殖, 使水体溶解氧下降、透明度下降、质恶化、水鱼贝及其他水生生物大量死亡。
细菌不仅可以分解有机物, 而且可以作为浮游动物的食物。
细菌在藻类不足或可食性藻类短缺时, 起到稳定维持浮游动物食物网的作用, 防止因食物不足而引起浮游动物生物量下降的情况。
目前比较流行的有以下2种。
( 1) 投加PSB(光合细菌)。
光合细菌的应用方法光合细菌在水产养殖中的应用技术1、净化水质由于高密度水产养殖的水体中含有大量的鱼类粪便和残饵，以及鱼药的残留物，它们腐败后产生的氨态氮、硫化氢和一些有害物质，直接污染水体和底泥。
轻度污染可造成鱼类生活不适，饵料系数增高，生长缓慢，积累到一定程度后，可使水体底部缺氧的情况下，PSB能有效地将氨态氮、硫化氢等有害物质吸收，组成菌体本身，从而提高水体中溶氧含量，调节pH。
水体的富营养化亦可滋生大量的病原微生物，使鱼类感染发病。
施用PSB后，还能抑制其它病原菌的生长，从而达到净化水质，使鱼类健康生长的目的。
2、维护水体微生态平衡水产养殖场的水体中存在着各种各样的微生物，有些是有益的，有些是有害的；也有些是处于中间状态的叫“条件致病微生物”，即正常情况下，这类微生物不致病，遇水质污染，鱼类免疫功能下降时，它们便大量繁殖危害鱼类。
通常人们采用消毒杀菌剂来控制，但随着施用次数的增加，病原微生物的耐药性也相应地增强，为了达到预防和治疗的效果，每次施用的剂量不得不逐渐加大，这不仅增加了用药成本，而且还污染了水体，造成水产品质量下降，甚至不能食用。
如何控制病原微生物的生长繁殖，又不使其不产生抗药性，不污染水体呢？答案是现成的，用光合细菌预防鱼病，完全可克服消毒杀菌剂的缺点，它不仅可降解或清除水体中包括鱼药在内的有害化学物质，占绝对优势的光合细菌还可与病原微生物争夺营养、空间，使其无法进行大量生长繁殖，同时还不存在病原微生物耐药性问题，从而不易形成致病的环境条件，鱼类也就不易发病。
鱼类的病害防治原则是：防重于治。
只有在日常的渔业生产中，维持水体中微生态系统平衡，使有益微生物始终占绝对优势，尽量不给病原微生物有大量生长繁殖的机会，才是健康养殖的出路之一，如果平时不能有效地预防，到了出现症状再去治疗，包括鱼药成本在内的重大生产损失将是不可避免的。
3、培养蜉蝣动物作饵料PSB的菌体细胞营养很丰富，这正好是蜉蝣动物的优质饵料，实践证明，水体中的PSB越多，蜉蝣动物生长也就越旺盛，以蜉蝣动物为食的鱼类增产效果也就越明显4、作为饲料添加剂PSB的菌体细胞营养丰富，并含有大量的生理活性物质，可直接拌入饲料中投喂，除增加营养，降低饲料系数外，还可起到刺激动物免疫系统，增强消化和抗病能力，促进生长的作用。
光合细菌的培养及应用方法光合细菌(简称PSB)是地球上最早出现具有原始光能合成体系的原核生物，是一大类在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，广泛存在于地球生物圈的各处。
光合细菌在水产养殖上的应用主要有以下五个方面：作为养殖水质净化剂；作为饲料添加剂；用于鱼、虾、贝幼体的培育；作为动物性生物饵料的饵料；防治鱼病。
一、培养工具的消毒方法1．加热消毒法：利用高温杀死微生物的方法。
（1）直接灼烧：此法可直接把微生物烧死，灭菌彻底，但只适用于小型金属或玻璃工具的消毒。
（2）煮沸消毒：一般煮沸5～10分钟，适用于小型容器、工具的消毒。
（3）烘干箱消毒：亦称为恒温干燥箱消毒法。
2．化学药品消毒法：适用在批量培养中，大型容器、工具、玻璃钢水槽和水泥池中。
（1）酒精：浓度为70％的酒精常用于中、小型容器的消毒。
用纱布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹，10分钟后，用消毒水冲洗两次即可。
（2）高锰酸钾：按300ppm配成高锰酸钾溶液，把洗刷洁净的容器、工具放在溶液中浸泡5分钟，取出，再用消毒水冲洗2次～3次即可。
二、光合细菌的培养条件1、营养条件光合细菌细胞体构成元素主要有：碳、氢、氧、氮、磷、钾、钠、镁、钙、硫和一些微量元素等，它们也是所有生物细胞构成的主要物质。
一般情况下，比重：水占80％-90％、无机盐1％-1.5％、蛋白质7％-10％、脂肪1％-2％、糖类和其它有机物1％-1.5％。
其中干细胞含碳45％-55％、氢5％-10％、氧20％-30％、氮5％-13％、磷3％-5％、其它矿物元素3％-5％。
光合细菌的细胞膜具有半透性，能选择性地让营养成分按一定需要进细胞内，在酶的作用下合成自己的细胞组分并促进分裂新的个体。
营养元素的全面合理的搭配,是培养高产光合细菌的关键。
根据这一要求,郑州@@@@生物材料公司选用多种光合细菌生长必需的原料，科学配方，经特殊加工而成的"光合细菌发生剂（培养基）"，基本符合光合细菌生长繁殖所需的营养要求，无毒无副作用，使用安全，固状结晶体便于包装和运输，而且有2年的保质期。
光合细菌在农作物中的应用实验摘要：本试验研究了以沼泽红假单胞菌为主的光合细菌水剂（30亿菌数/毫升）作为菌肥在大棚蔬菜、甜瓜，大田花生、小麦等农作物上进行根施和叶面喷施的效果。
实验结果表明施用光合细菌后普遍实现增产，按作物不同增产幅度在2%至24%之间。
试验植株生长健壮，具有较强抗病能力，农产品质量也有所改善。
以上结果表明光合细菌为菌肥表现了很高的提高经济效益的潜力，具有很大应用潜力和推广价值。
关键词：光合细菌；菌肥；农作物；大棚作物；花生；小麦光合细菌（photosynthetic bacteria）是自然界古老的微生物之一，属红螺菌目细菌，能够进行不产氧的光合作用。
光合细菌不仅含有丰富的蛋白质、维生素、钙、磷、铁等多种微量元素，还富含多种生理活性物质，如辅酶Q10、类胡萝卜素、生物素等促长和抗病活性因子[1]。
光合细菌作为饲料添加剂在畜牧业[2]、水产养殖[3,4]上都有广泛的应用，对家畜的免疫和抗病能力有明显的提高作用[5,6]，而且对水质和土质也有改善作用。
光合细菌作为水产养殖的饲料添加剂已经通过农业部审核[7]，在实际的生产养殖中得到了一定的推广应用。
但关于光合细菌在农作物生产中的作用所见报道还不多，特别是在大棚作物中的研究还很少。
本文报道了我们进行的光合细菌在大棚甜瓜、彩椒和西红柿，大田花生、小麦种植中的试验及其良好的效果。
一．材料和方法1．材料光合细菌制剂为每ml菌液中含有30亿以上的总菌数，其中的主要菌为沼泽红假单胞菌。
2．实验地点河北省石家庄市和保定市的几个市县。
大棚甜瓜、彩椒、西红柿在河北省深泽县。
大田花生在四个地区进行试验：定州市北町村、定州市丁村、无极县东宋村和新乐市大流村，均为沙河沿岸种植花生比较集中的地区，土质为沙壤土，地势平坦。
小麦试验在深泽县深泽镇北袁庄村，土质为壤土，肥力中等，地势平坦。
3．试验设置和田间操作：“伊丽莎白”甜瓜试验在6个塑料大棚内进行。
试验区采用灌根与叶面喷肥（合计5kg原液/亩）相结合的方法，即在定植期用原液灌根每株6ml，座瓜期和膨瓜期各用50倍清水稀释液进行叶面喷雾。
应用与环境生物学报 2008，14 ( 5 ): 699~704Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2008-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2008.00699光合细菌PCR检测技术的建立与应用*关大伟** 李 俊 沈德龙 曹凤明 李 力 姜 昕(中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081)Identification and Quantification of Photosynthetic Bacteria by PCR Method *GUAN Dawei **, LI Jun, SHEN Delong, CAO Fengming, LI Li & JIANG Xin(Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China)Abstract The identification and quantification technique with species-specific PCR and real time PCR were developed for the most common photosynthetic bacterial (PSB) strains of Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides to solve the defects of conventional methods, including time-consuming, laborious and inaccurate. Using the strains of R. palustris and R. sphaeroides as targets, the species-specific primers were designed according to the particular sequence of 16S rDNA and gyrB , respectively. To ensure the identification accuracy, the MgCl 2 concentrations and annealing temperatures were optimized for the species-specific PCR method, and the test results for microbial fertilizers showed that the identification accuracy was 100%, and the minimal detection thresholds of the PCR assay were all 100 pg DNA for R. palustris and R. sphaeroide, indicating that the developed species-specific PCR method was accurate, reliable and sensitive, and more simple and rapid than the conventional methods. In the study of the real time PCR of quantitative determination for PSB inoculant , the universal primers were designed according to the 16S rDNA sequence differing the most common PSB strains from other bacteria and the real time PCR method was set up. Using the number of the known samples, the DNA was continuously diluted, the standard curve was made with the developed real time PCR method and the correlation factor reached 0.998. With the standard curve ，10 PSB samples were measured by the real time PCR. The quantitative results showed the population by the real time PCR was higher than that by the MPN method, and the positive correlation between them was very high (r =0.98, P <0.01). These results indicated the quantitative method by the real time PCR was applicable for the quantification of PSB microbial fertilizers. Fig 5, Tab 4, Ref 14Keywords detection of microbial fertilizer; photosynthetic bacterium; specific PCR; real time PCR CLC S144 : Q78摘 要 针对光合细菌传统的菌种鉴定方法和MPN 定量方法存在费时、费力和准确性差的问题，本研究建立了光合细菌特异PCR 鉴定技术和实时荧光PCR 定量的检测技术. 以微生物肥料产品常用的光合细菌沼泽红假单胞菌和类球红细菌作为研究对象，分别依据16S rDNA 序列和gyrB 序列设计出具有种水平特异性的引物，优化并确定了PCR 反应条件，其灵敏度达到100 pg/µL ，对6个光合细菌产品鉴定的符合率为100%，结果表明建立的PCR 鉴定技术具有特异性、灵敏性和实用性. 再根据16S rDNA 的保守序列设计了常用光合细菌通用引物，用其对系列稀释的已知菌含量样品的DNA 模板进行荧光定量PCR ，制作标准曲线. 对10个光合细菌样品进行荧光定量PCR 法测定，根据与标准曲线比较得出样品中的光合细菌含量，其结果与MPN 法的相关系数为0.98，两者具有良好的相关性，结果表明建立的荧光定量PCR 法可用于光合细菌的定量检测，并具有高特异性和快速等优点. 表5 图4 参14关键词 微生物肥料检测；光合细菌；特异PCR ；荧光定量PCR CLC S144 : Q78收稿日期: 2007-08-13 接受日期: 2007-12-19*中央公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目(No. 2007-06) Supported by the Special Funds of Central-level Public Welfare Scientific Research Institutes for Basic Operations**通讯作者 Corresponding author (E-mail: dwguan@)光合细菌(Photosynthetic bacteria ，简称PSB)是地球上最早出现的一大类能以光作为能源，以CO 2和有机物作为光合作用碳源，以有机物、氢气或硫化物为供氢体而营养繁殖的原核生物的总称；广泛分布在海洋、河川、沼泽、水沟、活性污泥、土壤、极地、温泉和高盐水体等各种生境中. 光合细菌因具有复杂多样的代谢功能、丰富的营养和生理活性物质等特性，在种植业、养殖业以及环境废水处理等方面得到了广泛应用. 以光合细菌为菌种生产的微生物肥料产品在水稻、蔬菜、果树和烟草等作物上都取得了较好效果，研究表明，光合细菌具有改善土壤的结构和营养状况[1]、提高土壤肥力[2~4]、增强作物抗病防病能力、提高作物的光合作用能力[2]、提高作物品质[3]等功效.光合细菌的多功能性已引起了微生物肥料行业的重视，光合细菌的产品种类和数量近年来迅速增加. 产品质量是确保光合细菌产品使用效果的关键，而特异、快速和灵敏的质量检测技术是重要的保障环节. 目前使用的传统光合细菌菌种鉴定是以形态特征和各项生理生化方法为主，定量测定多采用MPN 法(最大或然数法). 这些方法操作烦琐，70014 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol7015 期关大伟等：光合细菌PCR检测技术的建立与应用酸钠、乙醇、甘露醇和酒石酸盐利用等实验[7]. 产品DNA 提取同1.4，PCR 方法同2.2.1，PCR 产物序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成.1.7 光合细菌定量测定研究1.7.1 PCR 对光合细菌通用引物通用性和特异性验证 以4种光合细菌(沼泽红假单胞菌、荚膜红细菌、类球红细菌和嗜酸红假单胞)、施氏假单胞菌、大肠杆菌和芽孢菌的基因组DNA 为模板，利用设计的通用引物进行普通PCR 扩增，验证引物的通用性和特异性. PCR 反应条件为：反应体系(20 μL)：10×buffer 2 μL ，dNTPS (10 mmol/L) 1.6 μL ，引物F (10 μmol/L) 1.0 μL ，引物R (10 μmol/L) 0.5 μL ，Taq E (2.5 U/μL) 0.2 μL ，模板DNA 1 μL ，补足ddH 2O 20 μL. 反应程序：95 ℃ 5 min ，95 ℃ 40 s ，60 ℃ 40 s ，72 ℃ 30 s ，30个循环，72℃ 10 min.1.7.2 荧光定量PCR 反应条件 反应体系(25 μL)：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL ，引物F (10 μmol/L) 0.4 μL ，引物R (10 μmol/L) 0.2 μL ，ROX Reference Dye (50×) 0.5 μL ，DNA 模板2.5 μL ，补足ddH 2O 25 μL.反应程序：95 ℃ 5 min ，95 ℃ 10 s ，60 ℃ 2 s ， 72 ℃ 31 s ，40个循环.1.7.3 荧光定量PCR 标准曲线的制作 标准品DNA 提取：9 000 r/min 离心4 min 收集菌体，与l mL 灭菌的PBS 混合，9 000 r/min 离心3 min ，沉淀用PBS 洗涤2次，水洗1次，用100 μL 水重悬沉淀，加入TritonX-100 100 mL ，沸水浴5 min ，迅速在冰水中冷却，取2.5 μL 作模板.标准品菌含量的测定：菌液作10倍递增稀释，选取3个合适稀释度的光合细菌菌液0.1 mL 均匀涂布于光合细菌底层固体培养基平板上(配方见1.3，再加入琼脂20 g)，置45~50 ℃下烘去水分后，加入冷却至50 ℃的上层固体培养基15 mL ，置28~30 ℃，800~1 000 lx 光照下培养5~6 d ，测定菌含量.标准曲线制作：取标准品1 mL 用上面方法提取DNA 后，用1×TE buffer 分别稀释成5个梯度，每个梯度3个重复，然后分别进行实时荧光PCR ，反应条件同1.7.2. 根据菌含量与C t 值的线性关系建立标准曲线.1.7.4 荧光定量PCR 方法与MPN 法的测定结果比较 选取10个沼泽红假单胞菌样品用荧光定量PCR 反应进行定量. DNA 模板提取方法同1.7.3，荧光定量PCR 条件同1.7.2，同时使用MPN 法[8]对样品进行检测，对两种方法得出的数据进行比较.2 结果与分析2.1 引物的设计根据沼泽红假单胞菌16S rDNA 和类球红细菌gyrB 的特异序列分别设计出具有种水平的特异性引物，用于这两种菌的特异性鉴定. 同时又根据常用光合细菌16S rDNA 的序列设计了通用引物，用于光合细菌的菌含量定量测定. 设计得到的引物序列和目的产物预期大小列于表2.2.2 光合细菌PCR 鉴定技术研究2.2.1 特异PCR 反应条件的确立 分别在退火温度为55~65 ℃和Mg 2+为0.5~1.5 μL 的条件下，应用沼泽红假单胞菌和类球红细菌特异引物对各自模式菌株R. palustris 1.2180T 和R. sphaeroides 1.2182T 基因组DNA 进行PCR 扩增，结果在不同退火温度和Mg 2+浓度条件下，模式菌株都产生了目的产物，因此初步选择特异性高的退火温度65 ℃和Mg 2+浓度0.5 μL 为特异PCR 的反应条件. 在此条件下，分别对各自种内的菌株进行PCR 扩增，参试的3株类球红细菌均产生目的条带(图1-A)，而R. palustris 1.2349基因组DNA 没有扩增产物，因此又以R. palustris 1.2349基因组DNA 为模板，调整退火温度和镁离子浓度，使其出现目标产物，最后确定退火温度60 ℃、Mg 2+加入量0.6 μL 作为沼泽红假单胞菌PCR 方法的反应条件，在此条件下5株沼泽红假单胞菌都扩增出了目的条带(图2-B). 根据以上结果，确定的特异PCR 反应条件为：反应体系(20 μL)：10×buffer2 μL ；dNTPs (10 mmol/L) 1.6 μL ；引物10 μmol/L 0.5 μL ；Taq E (2.5 U/μL) 0.2 μL ；模板DNA 2 μL ；Mg 2+ (25 mmol/L) 0.6 μL (沼泽红假单胞菌)，0.5 μL (类球红细菌)；补足ddH 2O 20 μL.反应程序：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 40 s ；沼泽红假单胞菌60 ℃ 40 s ，类球红细菌65 ℃ 40 s ； 72 ℃ 30 s ；30个循环；72 ℃ 10 min.2.2.2 特异PCR 鉴定方法的特异性验证 分别使用沼泽红假单胞菌和类球红细菌的特异引物，在2.2.1确定的PCR 反应条件下，对表1供试菌株PCR 扩增. 结果(图1)显示，目标菌株都产生了目的条带，而其他非目标菌株则没有目的条带产生. 这表明所设计的引物在本实验条件下，具有种水平上的特异性和通用性. PCR 产物经克隆测序，结果在BLAST 比对，与目的序列同源性都达到了100 %，进一步证实了PCR 的特异性.2.2.3 灵敏度测定 以起始浓度为1 µg/µL R. palustris 1.2180T 和R. sphaeroides 1.2182基因组DNA 的10倍系列稀释液为模板，进行PCR 扩增.结果(图略)显示，系列稀释101~104倍的表2 特异引物和通用引物信息Table 2 Information on primers引物种类Primer category引物序列Primer sequence引物来源Origin PCR 产物PCR product R. palustris F 5’-CTGGAAGTCTTGAGTATGGC 16S rDNA 203 bp R5’-AGTAAACCCACTAACGGCTG R. sphaeroidesF5’-GCCTCGGCCAAGACCAACC gyr B 250 bp R5’-GCTCGCCGGTGATGAAGATGGG Universal primer of PSBF5’-TGGTYTGAGAGGATGRYCA *16S rDNA384 bpR5’-CGAATTTCACCTCTACACTCG*Y 代表碱基C 和T, R 代表碱基A 和G Y represents C and T ; R represents A and G70214 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol模板浓度出现了目的产物. 因此，本研究条件下的最低模板浓度即灵敏度为100 pg/µL.2.2.4 PCR鉴定技术在光合细菌产品的应用应用PCR方法与传统方法检测了6个光合细菌样品，所得结果见表3. 在PCR方法鉴定的结果中，用沼泽红假单胞菌特异引物扩增样品DNA，6个样品都有扩增产物出现. 类球红细菌特异引物在3号和4号样品扩增到了条带. 传统分离培养方法测定结果为，1号样品未能分离到光合细菌，3号和4号样品分离到2种光合细菌，2号、5号和6号样品分离到1种光合细菌. 对分离到的菌种的菌落和菌体观察和生理生化实验结果表明，3号和4号样品所分离到的2个菌种分别符合沼泽红假单胞菌和类球红细菌特征；2号、5号和6号样品所分离的菌种符合沼泽红假单胞菌特征.对比两种方法的测定结果可知，除1号样品外，其余5个样品的菌种PCR鉴定结果与传统方法鉴定结果相吻合. 1号样品没有分离到光合细菌的原因可能是样品中另外一种菌(枯草芽孢杆菌)菌含量过多(6×109 CFU/mL)，干扰了光合细菌的分离. 这一结果说明PCR方法的灵敏度高于传统方法，具有很强的抗其他微生物干扰能力，可用来快速、准确地测定含有沼泽红细菌和类球红细菌的产品.2.3 荧光定量PCR研究结果2.3.1 通用引物特异性和通用性验证使用设计的通用引物对光合细菌4个种共10株和15株非光合细菌进行了PCR扩增，结果见图2-A，10株光合细菌都扩增出了目的产物，而对微生物肥料中经常使用的芽孢菌和常出现的大肠杆菌杂菌都则无条带产生(图2-B). 结果表明，该引物对光合细菌常图1 类球红细菌PCR方法(A)和沼泽红假单胞菌PCR方法(B)特异性检验结果Fig. 1 Specificity detection for R. sphaeroides and R. palustris by PCR1. P. polymyxa;2. B. brevis;3. B. japonicum;4. B. thuringiensis;5. B. mucilaginosus;6. B. laterosporus;7. E. coli;8. B. licheniformi s;9. B. pumilus; 10. B. megaterium; 11. P. azotofixans; 12. B. amyloliquefaciens; 13. P. stutzeri; 14. B. subtilis; 15. R.. acidophila; 16. R. capsulatus; 17. R. sphaeroides 1.2182; 18. R. sphaeroides 1.1737; 19. R. sphaeroides 1.2174; 20. R. palustris 1.2180; 21. R. palustris 1.2349; 22. R. palustris 1.2352; 23. R. palustris HN1; 24. R. palustris ACCC981; 25. 50 bp ladder表3 光合细菌产品PCR方法与传统方法检测结果Table 3 Comparison of the detection results between PCR and traditional methods for PSB products样品 SamplePCR法鉴定结果 Results of PCR传统方法鉴定 Results of traditional method R. palustris R. sphaeroides R. palustris R. sphaeroides1+－//2+－+－3++++4++++5+－+－6+－+－“＋”表示检测到该菌; “－”表示没有检测到该菌; “/”表示没有分离到光合细菌“＋” denotes the species determined; “－” denotes the species not determined; “/” denotes photosynthetic bacteria not isolated图2 通用引物在供试菌株中的PCR扩增结果Fig. 2 PCR detection for the bacteria in Table 1 by universal primerA: 1, 50 bp ladder; 2, CK-; 3, R. palustris 1.2180; 4, R. palustris1.2349; 5, R. palustris 1.2352; 6, R. palustris 981; 7, R. palustris HN1; 8, R. sphaeroides 1.2182; 9, R. sphaeroides 1.1737; 10, R. sphaeroides 1.2174; 11, R. acidophila HN2; 12, R. capsulatus 1.2359B: 1, 50 bp ladder; 2,CK+; 3, B. subtilis; 4, B. amyloliquefaciens; 5, B. licheniformis; 6, B. pumilus; 7, B. megaterium; 8, B. thuringiensis; 9, B. mucilaginosus; 10, B. edaphicus; 11, B. laterosporus; 12, P. azotofixans; 13, P. polymyxa; 14, P. cirulans; 15, B. brevis; 16, P. stutzeri; 17, E. coli7035 期关大伟等：光合细菌PCR检测技术的建立与应用用菌种有良好的通用性，又可避免常见的其他非光合细菌的干扰，可用于光合细菌的特异性检测.2.3.2 标准曲线的建立 以已知沼泽红假单胞菌菌含量4.9×108/mL 的样品基因组DNA 系列稀释液为模板，进行real time PCR 扩增，根据各稀释度的C t 值建立标准曲线. 扩增结果(图3)显示，不同浓度的模板均检测到荧光信号的增加，而且扩增产物的融解曲线具有唯一峰值(图略)，表明无二聚体产生，PCR 产物是唯一和特异的. 由表4可见，菌含量在4.9×104~4.9×107/mL 时，同一模板数的3个重复所对应的C t 值极为接近，重现性较好. 菌含量为4.9×103/mL 时，C t 值重复性较差；当菌含量为4.9×108/mL 时，扩增曲线C t 值大于4.9×107/mL (图略)，可能是由于模板浓度过高抑制了PCR 反应的进行.因此去掉4.9×108/mL 和4.9×103/mL 这两个点，以菌含量在4.9×104~4.9×107/mL 的模板制作标准曲线.以C t 值为纵坐标，每毫升菌含量的对数值为横坐标做标准曲线，得到菌含量的对数值与荧光PCR 反应C t 值的线性关系(图4)，二者的回归方程为：y ＝-4.12x +51.52，相关系数为0.998 3，具有较高的相关性，可用于光合细菌含量测定.2.3.3 实时荧光定量PCR 方法与MPN 法的测定结果比较 应用实时荧光定量PCR 方法对10个沼泽红假单胞菌光合细菌的基因组DNA 进行了扩增，结果显示10个产品都产生了扩增曲线，使用2.3.2中的标准曲线方程计算菌含量. 同时，又采用了最大或然数法(MPN)对这些样品进行了计数. 从两种测定方法的结果(表5)可以看出，采用实时荧光定量PCR 法所测得的光合细菌菌含量均高于MPN 所测的菌含量，两种方法所测样品菌含量具有一定相关性，通过计算得其相关系数为0.98 (P ＜0.01)，表明荧光定量PCR 方法能反映出不同光合细菌产品数量的差异.3 讨 论PCR 方法是近年发展起来的快速、灵敏的诊断技术，已在微生物检测方面广泛应用，但PCR 方法在光合细菌的检测鉴定方面尚未见报道. 本文通过GenBank 查找光合细菌的基因序列，经过比较筛选，选择16S rDNA 和gyrB 序列作为靶基因设计特异引物. 16S rDNA 编码基因内部结构由可变区和保守区组成，可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针，是较理想的细菌基因分类的靶序列，目前成为细菌鉴别和系统发育分析的金标准[9, 10]. gyrB 基因编码DNA 解旋酶(Gyrase)的B 亚单位，其显著特点是基因进化率快于核糖体基因，其平均碱基替换率是每100万年0.7%~0.8%，而16S rDNA 更是每5000万年1%[11]. 因此，gyrB 基因也非常适合亲缘关系相近细菌的鉴别和分类[12, 13]. 光合细菌在农业方面特别在种植业方面，使用的菌种多为紫色非硫细菌，其中沼泽红假单胞菌和类球红细菌应用最为广泛，本研究以它们为重点，通过设计和验证得到了种水平的特异性引物. 但对少数企业使用的深红红螺菌和嗜酸红假单胞等其他光合细菌菌种，由于未能收集到，或是菌株数量仅为1株(嗜酸红假单胞图3 光合细菌荧光定量PCR 标准曲线扩增图Fig. 3 Amplification of serial dilutions of the PSB 16S rDNA by real time PCR 曲线由左至右代表菌含量分别为4.9×107/mL 、4.9×106/mL 4.9×105/mL 、4.9×104/mL 、4.9×103/mLThe curves represent 4.9×107~4.9×103/mL from left to right, respectively表4 光合细菌标准曲线各菌含量所对应的C t 值Table 4 The Ct of the given PSB population菌含量 Bacterial population [n (cfu)/mL -1]4.9×107 4.9×106 4.9×105 4.9×104 4.9×103重复1 C t 值 C t of repeat 119.9423.6427.9832.1935.19重复2 C t 值 C t of repeat 220.0923.7427.7432.2934.75重复3 C t 值 C t of repeat 319.8523.9327.7432.4435.98平均值 Mean C t19.9623.7727.8232.3135.31图4 光合细菌荧光定量PCR 标准曲线Fig. 4 Standard curve for PSB by real time PCR表5 光合细菌样品MPN 法和荧光定量PCR 扩增定量结果Table 5 Quantitative detection by real time PCR and MPNmethod for PSB products样品Sample PCR 法所测菌含量Population of PSB quantifiedby PCR [n (cfu)/mL]MPN 法所测菌含量Population of PSB quantified by MPN [n (cfu)/mL]1 1.21×109 1.23×1082 1.9×109 3.4×10839.49×108 1.3×1084 1.31×1077.9×1065 2.92×107 2.0×1066 1.75×107 5.4×1067 6.06×1069.21×1058 4.29×105 2.3×1049 1.45×106 2.4×105101.48×1062.4×10570414 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol菌)，无法进行引物的特异性验证，因此没有把它们选为目标菌株.根据特异序列设计的引物从理论上讲与其他属、种、菌株的序列同源性达到100%的概率较低，但是在亲缘关系非常近的菌种之间有的仅存在一两个碱基的差异，此时PCR反应可能会产生假阳性的现象，需要通过优化反应条件提高PCR反应的特异性. 在PCR反应中，退火温度和Mg2+浓度是影响PCR特异性的重要因素，高退火温度和低Mg2+浓度可以提高PCR反应的特异性[14]，因此本实验使用模式菌株对这两个条件进行了优化，确定了高退火温度和低Mg2+浓度的反应条件，从而提高了PCR的特异性. 在此条件下，使用特异引物对7个属18个种共24株微生物肥料中常见光合细菌及其常用的复合菌种的PCR结果表明，本研究建立的PCR鉴定技术，对目的菌株具有较高的特异性和通用性.样品实际测试的结果表明，建立的PCR鉴定技术不仅快速，而且具有较强的特异性和较高的灵敏度，结果准确可靠，具有良好的应用价值.在光合细菌定量研究中，设计了紫色非硫光合细菌的通用引物，用来制作标准曲线和产品检测，这样就不需要对每一种紫色非硫光合细菌都制作光合曲线，使用一条标准曲线就可对不同菌种的样品进行测定，减少了工作量. 但由于该引物是根据16S rDNA设计的，16S rDNA是多拷贝基因，不同种细菌的16S rDNA拷贝数不同，因此使用通用引物所做的标准曲线只能够对使用单一光合细菌菌种的样品进行测定，而不能测定复合菌种的样品.从10个样品的实时荧光定量PCR法和MPN法的测定结果比对可知，实时荧光定量PCR法所测结果要高于MPN 法，其主要的两个原因是：一是MPN法本身的测定结果本身就偏低；二是实时荧光定量PCR法不能区分菌体的死活，造成了所测菌含量偏高.但两种方法所测样品菌含量具有较高的相关性，说明荧光定量 PCR方法能够反映出不同光合细菌产品数量的差异，表明利用荧光定量PCR对光合细菌定量是可行的.荧光定量 PCR技术简便、快捷，劳动量小，不受培养条件的限制，弥补了传统方法的不足，在光合细菌含量测定中具有良好的应用前景.References1 Li JF (李俊峰), Wang ML (王梦亮). The effect of photosynthetic bacteriaon agricultural ecosystem. J Shanxi Agric Sci (山西农业科学), 2002, 30(1): 52~562 Xiong Q (熊琦), Feng JA (冯安吉), Liu JB (刘继彪). Mechanism of PSB’senhancement on growth of spinach. Chin J Appl Environ Biol (应用与环境生物学报), 1995, 5 (Suppl): 194~1963 Wu XP (吴小平), Zheng YT (郑耀通), Cao RB (曹榕彬). Application ofphotosynthetic bacteria as organic fertilizer to soybean field. J Fujian Agric & For Univ Nat Sci Ed (福建农林大学学报自然科学版), 2003, 32 (1): 117~1194 Wang QJ (王秋菊), Cui ZHL (崔站利), Zhang SHL (张少良). Study ofapplying methods and mechanism of photosynthetic bacteria on paddy rice.Chin Agric Sci Bull (中国农学通报), 2006, 22 (1): 176~1785 Chen Q (陈强), Zhang XP (张小平), Li DY (李登煜). Isolation of DNAfrom the root nodule of legume plant. Microbiology (微生物学通报), 2002, 29 (6): 65~686 Sambrook J, Russell DW. Translated by Huang PT (黄培堂). MolecularCloning: A Laboratory Manual. 3rd ed.. Beijing (北京): Science Press (科学出版社), 20027 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册. 北京: 科学出版社, 2001.25, 29, 364~3698 Jiang X (姜昕), Cao FM (曹凤明), Fan H (樊蕙), Li L (李力), Han YF(韩永峰), Rao HD (饶汉东). NY 527-2002, Inoculant of Photosynthetic Bacterium. Beijing(北京): Standards Press of China (中国标准出版社), 20029 Christensen H, Nordentoft S, Olsen JE. Phylogenetic relationships ofSalmonella based on rRNA sequences. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48 (2): 605~61010 Wang RF, Cao WW, Cerniglia CE. Phylogenetic analysis and identificationof Shigella spp. by molecular probes. Mol Cell Probes, 1997, 11 (6): 427~43211 Zhou J, Thompson DK. Challenges in applying microarrays toenvironmental studies. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13 (3): 204~20712 Fukushima M, Kakinuma k, Kawaguchi R. Phylogenetic analysis ofSalmonella, Shigella and Escherchia coli strains on the basis of the gyrB gene sequence. Clin Microb, 2002, 40 (8): 2779~278513 Wang ZG (王振国), Liu HP (刘和平), Liu JH (刘金华). 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光合细菌在生态农业领域的应用及研究态势摘要：本文主要综述了光合细菌在生态农业领域的研究进展和应用价值。
光合细菌是一种非常重要的微生物资源，因为它具有生态、无污染、对生态环境负面影响小等诸多优点，因此在生态农业的可持续发展中具有重要地位。
它可以有效改善土壤理化环境，提高作物抗逆性与抗病性，在提高农产品品质与产量等方面也有成效。
此外，基于光合细菌而衍生出的有效生物菌群技术（Effective microorganisms，简称EM技术）也在农业领域发挥着越来越重要的作用。
关键词：农业科技；光合细菌；生态农业我国是农业大国，农业不仅仅是我国第一产业，更是我国的立国之本。
改革开放以来，我国的农业得到快速发展，农业科技水平不断提高，农产品产量持续增长，产品种类不断丰富。
然而与此同时，伴随着工业化的不断发展和人口的持续增长，工业生产和人们的生活排放也开始对农业种植环境造成污染，发展生态农业成为促进农业可持续发展的根本途径。
发展生态农业离不开农业科技水平的提高。
在这其中，关于光合细菌的研究成为近几年的热点。
光合细菌（Photosynthetic Bacteria，简称PSB）具有原始光能合成体系的原核生物的总称。
光合细菌在自然界中分布非常广泛，凡是光能所及之处，如海洋、江河、湖泊、池沼、土壤、水田、极地或温泉高盐水体等各种生境中均能发现它们的踪迹[1]。
光合细菌是微生物中一类可以利用太阳能生长繁殖的特殊类群，可以利用硫化氢、二氧化碳等进行光合作用，由于能够广泛应用于环境污染治理和可再生能源利用等多个方面，成为微生物学、农学、环境科学等多个领域的科学家研究的焦点[2]。
1 我国对于光合细菌的研究历史及现状我国对光合细菌的研究起步较早，早在1987年，陈世阳等[3]就对海洋光合细菌的培养及作为水产养殖饲料的应用进行了研究，其研究首次提出了光合细菌作为饵料生物的研究价值。
随后史家梁等[4]尝试使用光合细菌处理高浓度有机废水，取得了不错的效果。
光合细菌在农业上的应用和研究进展摘要：本文综述了近些年来光合细菌在农业上尤其是畜牧业、水产业、种植业上的一些最新研究进展和相关应用，并对这些研究提出自己的一些看法，旨在为以后的光合细菌相关研究和实验提供基础资料和可能思路。
关键字：光合细菌；农业；综述Abstract:This article summarizes some reseaches and related application about photosynthetic bacteria in the agriculture especially farming、aquaculture and crop farming，which aims to provide fundamental data and possibie thinking with future reseaches of photosynthetic bacteria. Key word:photosynthetic bacteria;agriculture;summarisation1.光合细菌概述光合细菌(简称PSB，又名光养细菌)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。
光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。
在生物学上，广义来说，能够进行光合作用的细菌便是光合细菌类；而以狭义的角度来看，光合细菌特指能在厌氧和光照条件下进行光合作用的且不产生氧气的细菌，虽两种含义范围不同，但涵盖在其中的都可称为光合细菌类。
目前，学术上的光合细菌一般都指后者即其狭义定义。
光合细菌具有鲜明、广泛的特点。
其是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物；另外，光合细菌是一类极具开发潜力的有益微生物：其个体小，繁殖快，适应性强，具有多种异养功能（如固氮、脱氮、固碳、硫化物氧化等），其菌体无毒无害，含有丰富的营养成分。
光合细菌的使用剂量、方法及注意事项光合细菌对各类养殖动物及农作物都有益。
表现在成活率高、个体大、免疫力强等方面。
特别是育苗阶段，效果更明显。
1、使用剂量（30亿级）以下使用单位换算(水)：1ppm=1克/百万克=1克/立方米水=0.67公斤/亩（水深1米）；（1）育苗鱼苗培育：一般施用浓度100-200ppm(水深1米每亩约用70-140公斤)。
常规鱼苗100 ppm，虾蟹苗150-200 ppm，贝苗180-200 ppm，使用周期为5-10天。
（2）成鱼首次施用10 ppm(水深1米每亩约用7公斤)，以后每次5 ppm(水深1米每亩约3-4公斤)，周期10-15天。
如常规鱼、虾、蟹、珠蚌、鳗等。
（3）饲料添加鱼苗5%，成鱼3%，禽畜3%-5%，现拌现喂，喂水添加3%。
（4）种植业水稻、小麦：每次每亩用5公斤叶面喷施。
水稻秧苗期、孕穗期各用一次；小麦冬肥、拔节期各用一次。
油菜：基肥每亩用15公斤浇根。
窜苔前每亩用15公斤叶面喷施。
瓜果类蔬菜：每次每亩用10公斤，幼苗期适量稀释浇根一次，现蕾期喷施一次。
叶菜类蔬菜：每次每亩用20公斤，生长期浇根或叶面喷施，7天用一次。
花卉：移载后每亩用40公斤浇根。
生长期每次每亩用20公斤喷施，每15天一次。
茶树：播种基肥每亩用80公斤。
冬肥每亩用40公斤浇根。
萌发期前每亩用20公斤浇根。
叶片生长期每亩用15公斤喷施，每15天一次。
果树：冬肥每亩40公斤浇根。
新叶长成后每亩20公斤叶面喷施。
（5）环保污水处理用量：200-1000ppm。
2、使用方法（1）将光合细菌菌液稀释20-30倍全池均匀泼洒。
（2）将菌液用沸石粉吸附或拌和细土以后撒入池中。
（3）将菌液拌和饲料后投喂。
（4）将菌液稀释10倍后，浸泡鱼种。
（5）拌种、浇根、叶面喷施。
3、注意事项（1）不可与消毒杀菌剂混合使用，水体消毒须1周后方可使用。
（2）使用前，将菌液光照10小时以上，使用效果更好。
（3）晴天水温25℃以上时使用效果较好。
光合细菌菌落计数培养基的研究摘要利用正交设计试验法研究了碳源、酵母膏、微量元素、磷酸盐、铁盐、琼脂等6个因子对光合细菌培养计数的影响,确定了各因素的最佳配比:NaHCO31.0 g,CH3COONa 3.0 g,酵母膏2.0 g,微量元素0 mL/L,K2HPO40.5 g,Fe-EDTA 0.005 g,琼脂8 g。
该组合加上NH4Cl 1.0 g,MgCl2#6H2O 0.2 g,NaCl 5.0 g,dH2O 1 000 mL,即得出光合细菌菌落计数培养基,称之为R 培养基。
该培养基对光合细菌的检测具有准确、快速、简便等优点。
关键词光合细菌;培养基;正交法Photosynthetic Bacteria (PSB) Colony-Counting MediumAbstract The effects of six factors carbon source, yeast extract, trace elements, phosphate, molysite and agar onphotosynthetic bacteria (PSB) colony-counting medium of were studied using orthogonal experiment and the opt-imum proportion of various factors of the medium was set: NaHCO31.0 g/L, CH3COONa 3.0 g/L, yeast extract2.0 g/L, trace elements 0 g/L, K2HPO40.5 g/L, Fe-EDTA 0.005 g/L, and agar 8 g/L. Addition of NH4Cl1.0 g/L, MgCl2#6H2O 0.2 g/L, NaCl 5.0 g/L to the above-mentioned combination and add water to 1 000 mLthus obtained the PSB colony-counting medium and named as R medium. This medium possesses the advantages ofaccurate, rapid and simple for PSB testing and determining.Keywords photosynthetic bacteria (PSB); medium; orthogonal experiment 光合细菌(Photosynthetic Bacteria,简称PSB)是一大类能进行不产氧光合作用的细菌,由于它具有能利用有机小分子作为碳源的生理特性,且菌体本身又无毒无害、营养丰富的特点,因之在水产养殖、废水处理等行业中得到了广泛应用,并在新能源开发、种植业、食品、化妆品、医药保健等行业显示出广阔的应用前景[1,2]。
