微生物直接计数法及测微技术

微生物大小的测定及显微镜直接计数法微生物的大小测定与显微计数生32 程雨婧 2013012406一、实验目的1. 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。

2. 了解血细胞计数板的构造及计数原理。

3. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理1. 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。

镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。

用于校正目镜测微尺的长度.目镜测微尺的中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度(见图1),再以后作为测量微生物细胞的长度。

2. 球菌用直径表示大小;杆菌用宽和长来表示(μm)图一:测微尺的校正3. 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

计数区的刻度有两种:一种是计数区(大方格)分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

计数区由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，其面2积为lmm，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体3积为0.1mm。

使用血球计数板计数时，通常测定四或五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以16或25，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。

设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则: A441mL菌液中的总菌数= ×25×10×B=5×10×A?B (25个中格) 5图二:血细胞计数室构造三、实验器材1. 菌种:啤酒酵母2. 器材:普通光学显微镜、目镜测微尺镜头、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、试管、无菌水、血细胞计数板、计数器、吸管、生理盐水、移液器。

微生物显微技术及微生物计数法•在实验室中常用的有:普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

通常在我们观察细菌、放线菌以及真菌等相对较大的微生物时,可以采用普通光学显微镜。

普通光学显微镜通常能将物体放1500~2000倍。

八、微生物计数法•显微直接计数法：利用血细胞计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内。

•平板计数法：是平板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长。

（一）微生物直接计数法•利用血细胞计数板进行直接计数。

•计数前需对样品做适当稀释,然后将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血细胞计数板的计数室内,按照在显微镜下观察到的微生物数目代入计算公式运算后,即可得出单位体积微生物总数目。

•此法的优点是直观、快速。

•用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/mL)。

活跃运动的细菌应现用甲醛杀死或适度加热以停止其运动。

•显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨。

•菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。

•两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清。

•每个方格网共分九个大方格,中间的方格即为计数区。

•计数区分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格，即计数区都由400个小方格组成。

•每毫升菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N)×系数(Κ)×菌液稀释倍数(d)。

系数K=400×104血细胞计数板的便用(1)稀释菌液：根据待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释,目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4~5个酵母细胞为宜,一般稀释100倍即可。

(2)准备计数板：取清洁干燥的血细胞计数板(使用前可通过显微镜检验计数板上有无污物,若有,则需清洗后才能进行计数),在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。

微生物大小的测定及显微镜直接计数法微生物的大小测定与显微计数生32 程雨婧 2013012406一、实验目的1. 学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。

2. 了解血细胞计数板的构造及计数原理。

3. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

二、实验原理1. 显微测微尺可用于测量微生物细胞或孢子的大小，包括镜台测微尺和目镜测微尺两个部件。

镜台测微尺全长1mm，等分为100格，每格0.01mm。

用于校正目镜测微尺的长度.目镜测微尺的中央刻有50等分或100等分的小格.测量前应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大镜下,目镜测微尺每小格所代表的实际长度(见图1),再以后作为测量微生物细胞的长度。

2. 球菌用直径表示大小;杆菌用宽和长来表示(μm)图一:测微尺的校正3. 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

计数区的刻度有两种:一种是计数区(大方格)分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

计数区由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，其面2积为lmm，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体3积为0.1mm。

使用血球计数板计数时，通常测定四或五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以16或25，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。

设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，则: A441mL菌液中的总菌数= ×25×10×B=5×10×A?B (25个中格) 5图二:血细胞计数室构造三、实验器材1. 菌种:啤酒酵母2. 器材:普通光学显微镜、目镜测微尺镜头、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、试管、无菌水、血细胞计数板、计数器、吸管、生理盐水、移液器。

测定微生物总数的方法测定微生物总数是微生物学研究中的一项重要任务，它可以帮助我们了解微生物在环境中的分布和数量。

本文将介绍几种常用的测定微生物总数的方法。

一、直接计数法直接计数法是最直接、最常用的测定微生物总数的方法之一。

它通过使用显微镜观察样品中的微生物细胞数目来进行测定。

具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、土壤样等，制备适当的稀释液。

2. 取适量的稀释液滴于玻璃片上，用显微镜观察。

3. 在显微镜下，使用目镜和物镜进行放大观察，并使用计数室或计数网格进行计数。

4. 统计不同视野中的微生物数量，并计算平均值，从而得到微生物总数。

二、培养法培养法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品在培养基上培养并生长，然后观察和计数生长的菌落数来进行测定。

具体操作步骤如下：1. 取适量的样品，如空气、食品、药品等，制备适当的稀释液。

2. 取一定量的稀释液接种于含有富营养物的培养基上。

3. 将培养基培养在适当的温度和湿度条件下，使微生物生长繁殖。

4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。

5. 根据计数结果，计算微生物总数。

三、膜过滤法膜过滤法是一种常用的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品过滤到膜上，然后将膜放置在培养基上进行培养和生长，最后观察和计数生长的菌落数来进行测定。

具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。

2. 将稀释液通过膜过滤装置过滤到膜上。

3. 将膜放置在含有富营养物的培养基上进行培养和生长。

4. 观察培养基上生长的菌落，并进行计数。

5. 根据计数结果，计算微生物总数。

四、荧光显微镜法荧光显微镜法是一种高级的测定微生物总数的方法，它通过将微生物样品染色，并利用荧光显微镜观察和计数荧光染色的微生物细胞来进行测定。

具体操作步骤如下：1. 取一定量的样品，如水样、食品样等，制备适当的稀释液。

2. 取适量的稀释液滴于载玻片上，进行定性或定量染色。

微生物质量测定技术及应用研究微生物是生活中一个重要的组成部分。

在环境保护、农业生产、药品生产等领域中，微生物的数量测定是一个非常重要的前提条件。

传统的测定方法需要耗费大量时间和人力物力，并且具有较大的误差。

而微生物质量测定技术及其应用的出现，大大提高了微生物测定的效率和准确度。

一、微生物质量测定技术微生物质量测定技术主要包括直接计数、浓度测定、生长曲线测定等几种方法。

1.直接计数法直接计数法是一种常用的微生物质量测定方法。

该方法是在显微镜下进行观察，通常使用作用于细胞分子中，使其显得更明显的染料进行染色。

常见的染色方法有革兰氏染色和健太染色。

虽然直接计数法有效，但该方法需要耗费大量时间，同时需要特殊的技能和技术背景。

2.浓度测定法浓度测定法是通过分析细胞中某一对特定化合物的反应，来推算细胞数量的一种方法。

这种测量方法可以快速准确地测量细胞数量，但需要使用复杂的设备，如光度计和分光光度计。

3.生长曲线测定法生长曲线法是一个定量的技术，可以测量微生物群落的密度和生长速度，并根据这些数据推断微生物在特定环境条件下的生长速度和最大生长密度。

生长曲线法可以测量大量样本，但该技术需要消耗较多的时间和资源，且需要对基本的微生物生理学和环境生态学知识有了解。

二、微生物质量测定技术的应用1.环境监测在环境监测中，微生物质量测定技术可以快速准确地确定环境中某些特定微生物的数量，帮助确定环境质量状况。

例如，检测空气中霉菌的数量以确保室内空气质量的安全，检测污染源中各种微生物的浓度以判断污染程度。

2.食品生产在食品生产中，微生物质量测定技术可以帮助监测微生物污染，确保食品安全。

例如，监测肉类、水果和蔬菜中的微生物，以便确定污染来源和检测不合格样品。

3.药品生产在药品生产中，微生物质量测定技术可以用于检测微生物在药品生产过程中的污染情况，确保纯度和楼容。

例如检测细菌和霉菌的污染程度以确保生产过程中没有无菌裂解和其他生产活性物质的污染。

微生物大小测定和微生物的显微镜直接计数法一、实验目的1、了解显微测微尺的结构及掌握显微测微尺用于测量菌体大小的方法。

2、学习使用血细胞计数板计酵母菌细胞数的原理和方法。

二、实验原理（一）、显微测微尺的使用：可用于测量微生物细胞或孢子的大小，它包括镜台测微尺和目镜测微尺两部分。

镜台测微尺是一块特制的载玻片，其中央有一全长为1mm 的刻度标尺，等分成100小格，可用它校正目镜测微尺每小格的长度。

目镜测微尺是一块可放在目镜内的圆形玻片，每小格的长度随目镜、物镜放大倍数的大小而变动。

在测量之前，应预先用镜台测微尺来校正并计算出在某一放大倍数物镜下，目镜测微尺每小格所代表的实际长度，再以它作为测量微生物细胞的尺度。

标定公式为：目镜测微尺每格长度(um)=（两条重合线间镜台测微尺的格数/两条重合线间目镜测微尺的格数）*10；计算公式：微生物大小(um)=目镜测微尺格数* 目镜测微尺每格长度(um) （二）、显微镜直接计数法：其原理是将经过适当稀释的微生物细胞或孢子悬液，加至血细胞计数板的计数室中，在显微镜下逐格计数。

由于计数室的容积是固定的（0.1mm3）,故可将在显微镜下计得的菌体细胞数换算成单位体积试样中的含菌量。

此法是一种常用的微生物总菌计数法。

血细胞计数板上的计数室位于中央平台短槽两侧的2个短平台；其上各有一方格网，它被划分成9大格，中央大格为计数室。

该计数室又被划分为400个小格，其中包括25个中格，四周均有双线界限加以区分。

计数公式：1ml菌液中的总菌数 =（5个方格中的总菌数/5）× 25 ×10000 × 稀释倍数三、实验器材菌种：酵母菌仪器：显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，血细胞计数板等其它：载玻片，盖玻片，擦镜纸等四、实验步骤（一）、微生物大小测定：1、装目镜测微尺；2、放置镜台测微尺；3、目镜测微尺的格数标定：按照标定公式的要求，分别测出低倍镜和高倍镜下的目镜测微尺每格所代表的实际长度。

微生物数量的测定方法微生物数量的测定方法微生物是一类微小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。

它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、空气中，也存在于人体内外。

了解微生物的数量对于环境监测、食品安全、医学诊断等领域具有重要意义。

本文将介绍几种常用的微生物数量测定方法。

1. 直接计数法直接计数法是最直接、最常用的微生物数量测定方法之一。

它通过显微镜观察和计数来确定微生物的数量。

首先，将待测样品制备成适当的悬浮液，然后在显微镜下观察，并使用计数器进行计数。

这种方法适用于细菌和酵母等较大的微生物。

但是，由于显微镜观察需要较高的技术水平和时间，所以无法快速测量大量样品。

2. 培养法培养法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过培养微生物并计数生长的菌落来确定数量。

首先，将待测样品制备成适当的培养基，然后在恰当的温度和湿度条件下培养一段时间。

培养基中的微生物会形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。

这种方法适用于大部分微生物，但是它需要一定的培养时间，并且某些微生物可能无法在常规培养基上生长。

3. 膜过滤法膜过滤法是一种常用的微生物数量测定方法，它通过将待测样品过滤到膜上，并将膜培养在适当的培养基上来确定数量。

首先，将待测样品通过特定孔径的过滤器过滤，然后将过滤后的膜放置在培养基上培养。

培养基中的微生物会在膜上形成可见的菌落，通过计数菌落的数量来确定微生物的数量。

这种方法适用于水样、空气样等液态和气态样品。

4. 分子生物学方法分子生物学方法是一种新兴且快速发展的微生物数量测定方法。

它通过检测和分析微生物DNA或RNA来确定数量。

常用的分子生物学方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）等。

这些方法可以快速、准确地测定微生物的数量，并且可以检测到少量微生物。

但是，分子生物学方法需要一定的实验设备和技术，并且对样品预处理要求较高。

总结起来，微生物数量的测定方法有直接计数法、培养法、膜过滤法和分子生物学方法等。

土壤微生物生物量的测定方法1.直接计数法：直接计数法是通过显微镜观察土壤样品中微生物数量来测定土壤微生物生物量。

常用的直接计数法包括滴定法、薄层计数法和电镜计数法。

滴定法是将土壤样品溶解后，通过滴定法来计数微生物细胞的数量。

滴定法主要包括用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为参比菌，将细菌与土壤样品混合，经一系列稀释后进行滴定。

通过观察滴定液中菌落的数量，可以推算出原始土壤样品中微生物的生物量。

薄层计数法是将土壤样品制成薄层，然后在显微镜下进行计数。

这种方法可以直接观察微生物的形态特征，通过计算单位面积上微生物的数量来估算微生物生物量。

电镜计数法是利用电镜的高分辨率特性，观察土壤样品中微生物的形态和数量。

这种方法可以观察到更小的微生物和微生物的形态细节，但是操作复杂，成本较高。

2.间接测定法：间接测定法通过测定土壤中微生物活性代谢产物来估算微生物生物量。

常用的间接测定法包括ATP测定法、细胞膜脂肪酸测定法和氮素代谢产物测定法等。

ATP测定法是通过测定土壤中的三磷酸腺苷(ATP)含量来估算微生物生物量。

微生物的ATP含量与其生物量有一定的关系，因此可以通过测定ATP含量来间接估算土壤微生物生物量。

细胞膜脂肪酸测定法是通过测定土壤样品中微生物细胞膜中的脂肪酸含量来估算微生物生物量。

微生物细胞膜中的脂肪酸种类和含量与微生物群落的组成和数量有关，因此可以通过测定脂肪酸的含量来间接估算微生物生物量。

氮素代谢产物测定法是通过测定土壤样品中微生物氮素代谢产物的含量来估算微生物生物量。

微生物的氮素代谢活动与其生物量有关，因此可以通过测定氮素代谢产物的含量来间接估算微生物生物量。

3.分子生物学方法：分子生物学方法是利用PCR技术对土壤样品中微生物的DNA或RNA进行扩增和测定来估算微生物生物量。

常用的分子生物学方法包括引物扩增法、荧光原位杂交法和高通量测序法等。

引物扩增法是通过设计特定的引物对微生物的DNA或RNA进行扩增，并通过PCR反应的产物数量来估算微生物生物量。

微生物细胞大小测定及显微镜直接计数一、实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。

用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺（图示）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。

测量时，将其放在接目镜中的隔板上，此处正好与物镜放大的中间物像重迭，用于测量经显微镜放大后的细胞物象。

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺（图示）是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长10µm即0.01mm，是专门用来校正目镜测微尺的。

校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和稀释平板计数法。

直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。

菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼德罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。

两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载坡片上有4条槽所构成的3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图示），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，大方格用三线隔开，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，大方格之间用双线分开，而每个大方格又分成16个小方格。

微生物大小的测量和直接计数一、实验目的1、学习显微镜下测量微生物的大小的基本方法2、学习血球计数板计数法使用的原理与方法，并学习区别死活酵母的方法。

二、实验原理用于测量微生物细胞的大小的工具有接目测微尺和接物测微尺。

接目测微尺不是直接测量菌体，而是测量经显微镜放大后的细胞物像。

接目测微尺仅与目镜的放大倍数有关，接目测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例相同，只是代表相对长度，所以使用前必须用置于镜台上的接物测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格所代表的精确长度，然后用接目测微尺直接测被测对象的大小。

测定微生物数量的方法有很多，通常采用的有显微镜直接计数法、平板计数法、细胞和原生质体总量计测法等。

血球计数板其计数室的每个大方格均由400个小方格组成。

每个大方格体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3.使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每ml菌液（或每g样品）中微生物细胞的数量。

三、实验步骤1、接目测微尺的标定把接物测微尺置于载物台上，使刻度朝上，先用低倍镜观察，调焦，使接目测微尺与接物测微尺刻度平行，再使其重叠，两尺的“0”刻度完全重合，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间接目测微尺的格数和接物测微尺的格数。

接物测微尺刻度每格长10mm，计算接目测微尺每格所代表的长度：接目测微尺每格长度= 接物测微尺两个重合格之间的格数10 / 接目测微尺两重合格之间的格数2、微生物细胞大小的测定换上菌体标本片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜、油镜下转动接目测微尺，测出菌体的长、宽各占几格（不足一格的部分估读一位小数），测出的格数乘以接目测微尺每格的长度，即等于该菌的大小，一般测量菌的大小要在同一涂片上测定至少5个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。

3、微生物的直接计数将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的边缘滴入一滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去多余菌液，避免盖玻片上浮。