过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(紫外微板法)

实验器材：紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、天平、100微升枪2支、10ml容量瓶、10 mL试管、具塞试管、5 mL枪一支、研钵试剂：（1）0.05mo l·L-1磷酸缓冲液（PH7.0）。

pH 0.05mol/L NaH2PO4(ml) 0.05mol/L Na2HPO4(ml)5.7 93.56.55.8 92.0 8.05.9 90.0 10.06.0 87.7 12.36.1 85.0 15.06.2 81.5 18.56.3 77.5 22.56.4 73.5 26.56.5 68.5 31.56.6 62.5 37.56.7 56.5 43.56.8 51.0 49.06.9 45.0 55.07.0 39.0 61.07.1 33.0 67.07.2 28.0 72.07.3 23.0 67.07.4 19.0 81.07.5 16.0 84.07.6 13.0 87.07.7 10.5 89.57.8 8.5 91.57.9 7.0 93.08.0 5.3 94.7（2）200 mmo l·L-1H2O2溶液，30% H2O2 45.44 mL溶于磷酸缓冲液，定容至1 L。

（3）50 mmo l·L-1Tris-HCl缓冲液（PH7.0）(Tris三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；缓血酸胺，C4H11NO3):250ml 0.2mol/L的Tris（含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L）+450mL 0.1mol/L的HCl(取83ml浓度为37.2%的盐酸定容至1L)，加水稀释至1L。

步骤：1、酶液提取：取0.5g新鲜植物样品，置于预冷研钵中，加2mL磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆。

2、将研磨好的匀浆转移至10mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次（每次1-2mL）,转移至容量瓶，定容至10 mL。

3、取提取液5 mL于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。

碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号过氧化氢酶检测试剂盒产品编号 产品名称包装 S0051过氧化氢酶检测试剂盒100次产品简介：过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶(Catalase)活性的试剂盒。

在过氧化氢相对比较充足的情况下，过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。

残余的过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-p- benzoquinonemonoimine)，最大吸收波长为520nm 。

用过氧化氢标准品，制作标准曲线，这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气，从而可以计算出样品中过氧化氢酶的酶活力。

过氧化氢酶分布非常广泛。

在肝脏、肾脏和红细胞中，过氧化氢酶的水平非常高，是清除能导致氧化损伤的过氧化氢的主要场所。

过氧化氢酶的活性也可以用紫外分光光度计测定A 240，但蛋白质或其它组份在A 240附近都有比较强的吸收，会对测定产生严重干扰。

因此，用紫外法测定过氧化氢酶的活性，比较适合纯化的过氧化氢酶。

本试剂盒通过检测A 520来测定过氧化物酶催化下由过氧化氢氧化生色底物产生的红色产物，受干扰的因素小，检测灵敏度高，可以检测出低达1U/ml 的过氧化氢酶。

本试剂盒可以检测全血、红细胞裂解产物、血清、组织匀浆产物、细胞裂解产物等生物样品中的过氧化氢酶的活性。

一个试剂盒共可以进行100次检测。

包装清单：产品编号 产品名称包装 S0051-1 过氧化氢酶检测缓冲液 60ml S0051-2 过氧化氢 (约1M) 5ml S0051-3 过氧化氢酶反应终止液50ml S0051-4 显色底物 20ml S0051-5 过氧化物酶 20µl —说明书1份保存条件：-20ºC 保存，一年有效。

过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明书一、测定原理：过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm 处测定其变化量，可计算出CAT 的活力。

试剂一(ml)二、试剂组成与配制：试剂一：液体100 ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂二：底物液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂三：显色粉剂×1瓶，4℃保存6个月。

加双蒸水至100 ml 溶解，4℃保存1个月。

（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）试剂四：液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。

天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。

三、组织样本的检测1、组织匀浆液的制备：准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测(最佳取样浓度摸索减附录)。

混匀，波长405nm ，光径0.5cm ，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

注：一般样本没有高脂等导致显著差异情况，对照管的样本更换成双蒸水，做1-2管对照即可。

如需做样本自身对照，则试剂盒所测定样本数量减至48样。

3.组织中CAT 活力的计算：（1）定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1umol 的H2O2的量为一个活力单位。

（2）计算公式：)ml /mgprot (601271)OD -OD ()mgprot /U (CAT *待测样本蛋白浓度取样量值测定值对照活力组织匀浆中÷⨯⨯⨯=注：*271为斜率的倒数（3）计算举例：取10%水稻叶片匀浆0.05ml 做CAT 检测，测得对照管吸光度为0.605，测定管吸光度为0.332，同时测得10%水稻叶片匀浆蛋白浓度为3.1303 mgprot/ml 。

则计算结果为：()/mgprot U 7351.101303.305.0601271332.0704.0)mgprot /U (CAT =÷⨯⨯⨯-=活力组织匀浆中注：1.测定血清和血浆时，如果样本不溶血，每批样本只需要随机挑2个样本做对照或者用双蒸水代替额样本做对照；如果样本溶血的话，必须每个样本都要做对照。

过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。

学习几种测定CAT活性的方法，理解其测定原理。

一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。

H202的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。

其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。

根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。

其反应为：H2O2十2KI十H2S04→I2十K2S04十2H20I2+2Na2S2O3→2NaI+NaS406二、材料、设备与试剂1．植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。

2．主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml 三角瓶。

3．试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。

(3)10％的钼酸铵溶液：称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。

(4)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl2防腐)。

(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。

一天后进行标定。

标定方法：精确称取分析纯K2Cr207约0．15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr3+离子的颜色)为止。

植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)简介：过氧化物酶(peroxisome，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

Leagene 植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)检测原理是以愈创木酚作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪470nm 处检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。

该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的过氧化物酶活性，尤其适用于检测水果中过氧化物酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：自备材料：1、蒸馏水2、研钵或匀浆器3、离心管或试管4、低温离心机5、水浴锅或恒温箱6、酶标板7、酶标仪操作步骤(仅供参考)：1、准备样品：①植物样品：取植物组织或水果中层果肉加入预冷的POD Lysis buffer 研磨或匀浆，离心，编号名称TE0423100T Storage试剂(A):POD Lysis buffer 500ml 4℃试剂(B):POD Assay buffer 10ml 4℃避光试剂(C):POD 氧化剂1mlRT 使用说明书1份留取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于过氧化物酶的检测。

③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用POD Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，-冻存，用于过氧化物酶的检测。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的过氧化物酶，可以使用POD Lysis buffer进行恰当的稀释。

过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒说明书微量法货号：BC0205规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系吉至工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体110mL×1瓶4℃保存试剂一液体30mL×1瓶4℃保存试剂二液体110μL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。

2、检测工作液的配制：A、使用96孔UV板，取试剂二25μL中加入5mL试剂一，充分混匀，作为工作液（约26T），现用现配；也可根据样本量按比例配制（提供一个15mL空瓶）。

B、使用微量石英比色皿，取试剂二25μL中加入6.5mL试剂一，充分混匀，作为工作液（约34T），现用现配；也可根据样本量按比例配制（提供一个15mL空瓶）。

产品说明：CAT(EC1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

H2O2在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔（UV板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌、细胞或组织样本的制备：a、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

b、组织：按照组织质量（g）：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

过氧化氢酶(CAT)试剂盒说明书一、测定原理：过氧化氢酶(CAT)分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其变化量，可计算出CAT的活力。

试剂一(ml)二、试剂组成与配制：试剂一：液体100 ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂二：底物液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂三：显色粉剂×1瓶，4℃保存6个月。

加双蒸水至100 ml溶解，4℃保存1个月。

（如果底部有不溶粉末沉淀，直接取上清使用，不影响测定结果）试剂四：液体10 ml×1瓶，4℃保存6个月。

天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。

三、组织样本的检测1、组织匀浆液的制备：准确称取组织重量，按重量(g)：体积(ml)=1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测(最佳取样浓度摸索减附录)。

2、操作表：混匀，波长405nm ，光径0.5cm ，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

注：一般样本没有高脂等导致显著差异情况，对照管的样本更换成双蒸水，做1-2管对照即可。

如需做样本自身对照，则试剂盒所测定样本数量减至48样。

3.组织中CAT 活力的计算：（1）定义：每毫克组织蛋白每秒种分解1umol 的H2O2的量为一个活力单位。

（2）计算公式： )ml /mgprot (601271)OD -OD ()mgprot /U (CAT *待测样本蛋白浓度取样量值测定值对照活力组织匀浆中÷⨯⨯⨯=注：*271为斜率的倒数 （3）计算举例：取10%水稻叶片匀浆0.05ml 做CAT 检测，测得对照管吸光度为0.605，测定管吸光度为0.332，同时测得10%水稻叶片匀浆蛋白浓度为3.1303 mgprot/ml 。

则计算结果为：()/mgprotU 7351.101303.305.0601271332.0704.0)mgprot /U (CAT =÷⨯⨯⨯-=活力组织匀浆中注：1.测定血清和血浆时，如果样本不溶血，每批样本只需要随机挑2个样本做对照或者用双蒸水代替额样本做对照；如果样本溶血的话，必须每个样本都要做对照。

土壤过氧化氢酶（Solid-Catalase，S-CAT）试剂盒使用说明微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定货号：BC0105规格：100管/48样产品内容：试剂一：液体×1瓶，4℃保存；临用前加入29.7mL蒸馏水充分溶解后待用；用不完的试剂4℃保存；试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

产品说明：S-CAT是土壤微生物代谢的重要酶类，在H2O2清除系统中具有重要作用。

H2O2在240nm下有特征吸收峰，通过测定与土壤反应后溶液在此波长下吸光度的变化，即可反应S-CAT活性的高低。

需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）和蒸馏水操作步骤：一、样品处理：新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。

二、测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。

2、加样表试剂名称测定管无基质管无土管风干土样（g）0.030.03试剂一（μL）260260双蒸水（μL）26025℃振荡培养20min试剂二（μL）101010混匀8000g，25℃离心5min，取全部上清试剂三（μL）303030混匀，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，240nm处记录各管吸光值A。

注意：每个测定管要设一个无基质管，无土管只要做一管。

三、S-CAT活性计算：A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下单位的定义：每天每g风干土样催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

计算公式：S-CAT（μmol/d/g）＝[(A无土管-A测定管+A无基质管)×V反总÷（ε×d）×106]÷W÷T=16.5×（A无土管-A测定管+A无基质管）V反总：反应体系总体积，3×10-4L；ε：过氧化氢摩尔消光系数，4.36×104L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；T：反应时间，20min=1/72d；W：样本质量，0.03g。

果蔬CAT过氧化氢酶测定方法过氧化氢酶是一种存在于许多生物体中的酶，能够将过氧化氢转化为水和氧气。

它在果蔬中的测定方法主要是通过检测其催化过氧化氢分解反应的速率来确定其活性水平。

下面将详细介绍果蔬CAT过氧化氢酶测定方法。

CAT活性的测定方法有许多种，比较常用的方法主要包括荧光法、吸收光谱法和高效液相色谱法。

这里将重点介绍吸收光谱法和高效液相色谱法。

吸收光谱法是通过测定CAT在特定波长的吸光度变化来计算其活性。

具体步骤如下：1.制备样品：将需要测定CAT活性的果蔬样品如苹果、西红柿等取样，剥去外皮并搅碎成泥状。

加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。

2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。

3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。

4.准备试剂：制备过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液，分别用于添加到样品中。

5.反应：将等量的样品、过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液混合，开始反应。

在特定波长下，间隔一段时间后，测量吸光度的变化。

6.计算活性：通过吸光度的变化计算出CAT的活性值，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。

高效液相色谱法也被广泛应用于CAT活性的测定。

具体步骤如下：1.制备样品：同样，将需要测定CAT活性的果蔬样品剥去外皮并搅碎成泥状。

加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。

2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。

3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。

4.蛋白质沉淀：将样品中的蛋白质沉淀出来，去除其他有干扰的物质。

5.准备色谱柱：将样品中的蛋白质溶液加入高效液相色谱仪的色谱柱中。

6.诱导反应：添加过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液到色谱柱中，开始诱导CAT的催化反应。

7.分离与检测：在高效液相色谱仪中，通过色谱柱对样品中的CAT和其他物质进行分离，并实时监测其峰值的变化。

8.计算活性：通过峰面积的计算，可以计算出CAT的活性，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。