SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性鉴定

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定韩玮;苏力担卡扎·仇曼;何铁英;程坤;郝晓文;王松;陈启龙【摘要】目的：探索大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的分离、培养及鉴定方法。

方法采用贴壁分离方法，分离纯化3～4周龄 SD 大鼠的骨髓间充质干细胞，观察细胞生长状况，分别用免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记细胞核的方法鉴定 BMSCs 纯度及活性。

结果原代 BMSCs 呈圆形、大小均一，透光性可，24 h 后开始贴壁，2 d 后开始长出伪足，7～8 d 细胞融合达90％，纯化后 BMSCs 呈梭形，24 h 细胞贴壁率可达99％，前4代细胞传代周期为7 d，之后传代周期逐渐缩短。

第3代BMSCs 的表面标志物 CD29阳性表达率为98．9％，CD44阳性表达率为73．3％。

DAPI 标记的 BMSCs 胞核可见明亮蓝色荧光，标记率达100％。

结论贴壁分离法分离大鼠 BMSCs，可得到纯度较高、活力强的 BMSCs，第3代BMSCs 生物学性状稳定。

%Objective To explore the methods of separate,culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Methods By adherent separation method,bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and purified from 3-4 weeks old SD rat,then cell growth was observed,respectively by im-munofluorescence staining,flow cytometry and DAPI nuclear staining method for identification of BMSCs purity and activity.Results Primary BMSCs was round,uniform in size and light in transmission.After 24h begin to adherent,2 d began to grow following pseudopodia,90% of the cells were fused on 7-8 d, and purified BMSCs werefusiform.24 h cell adherent rate was 99% and before the 4th generation cell cycle was 7 days.After subculture,cycle graduallyshortened.The results of surface markers of the third gener-ation MSCs showed thatthe positive rate of CD29 was 98.9%,and the positive rate of CD44 was 73.3%. DAPI labeled BMSCs,the nucleus can see bright blue fluorescence,labeling rate of 100%.Conclusion Adherent separation of rat BMSCs have high purity and strong vitality of BMSCs,and the third generation of BMSCs shows stable biological character.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2016(039)009【总页数】4页(P1155-1158)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;大鼠【作者】韩玮;苏力担卡扎·仇曼;何铁英;程坤;郝晓文;王松;陈启龙【作者单位】新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院胰腺外科，乌鲁木齐 830054【正文语种】中文【中图分类】R33骨髓间充质干细胞(BMSCs)为非造血干细胞，存在于骨髓中，易于获得及分离培养，可诱导为多重细胞，分泌多重生长因子、酶及趋化因子，在组织器官的修复及促进组织器官生长过程中起到关键作用[1]。

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定作者：李兰兰陈玲肖马炬明来源：《中国现代医生》2014年第01期[摘要] 目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）体外分离培养方法。

方法采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，进行形态学观察，绘制生长曲线，流式细胞仪分析细胞周期、检测细胞表面抗原标志物，并进行成脂、成骨分化诱导。

结果获取的BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长。

生长曲线呈S形，细胞周期显示86.02% P3代细胞为G0/G1期，保持活跃的扩增能力。

BMSCs 高表达CD44、CD90、低表达CD34、CD45。

成脂诱导21 d后，可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。

成骨诱导21 d后，可见大量橘红色矿化结节形成。

结论全骨髓贴壁培养法可成功有效地分离培养BMSCs。

[关键词] 骨髓间充质干细胞；全骨髓贴壁法；鉴定[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）01-0007-04BMSCs具有高度增殖的能力、体外基因转移效率高以及多向分化潜能等优点[1-2]，使其成为组织工程、细胞替代治疗等领域的首选种子细胞。

但是骨髓中的间充质干细胞含量极低[3]，且其含量随年龄增长而逐渐减少[4]，需经体外分离、纯化、扩增为纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞才能满足组织工程需求。

实验旨在建立一套简便有效的BMSCs原代培养方法，为后续实验做好准备。

1 材料与方法1.1 实验动物清洁级雄性SD大鼠6只，4周龄，体质量100 g，由浙江省实验动物中心提供。

实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 时间及地点于2013年1～6月在中国人民解放军第一一七医院干细胞治疗中心完成。

1.3 实验主要试剂低糖DMEM培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、青/链霉素（吉诺生物），优质胎牛血清（Gibco），anti-CD45、anti-CD90（BD），anti-CD34（Santa Cruz），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen公司）。

分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。

但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。

研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。

1 材料与方法1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。

1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。

HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。

在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。

本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。

BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。

因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。

近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。

BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。

细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。

其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。

本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。

具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。

细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。

细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。

细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。

通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。

通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。

经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。

在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。

这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。

普通贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）及其生物特性研究作者：吴春朋张潜方宁刘金伟刘祖林章涛来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第03期【摘要】目的：建立从大鼠骨髓分离、培养间充质干细胞的标化流程，并探讨BMMSCs 生物学特性。

方法：无菌条件下剪取2～3周龄SD大鼠两侧完整股骨，采用D-PBS冲洗骨髓腔，含骨髓细胞的洗脱液经离心后收集细胞沉淀，用含10%FBS的LG-DMEM，于37ºC、5% CO2、饱和湿度环境下进行BMMSCs原代培养，每2 d换液1次，同时洗脱未贴壁的血细胞；当BMMSCs生长汇合度达60%～70%时，按2～5×105/ml细胞密度进行传代培养。

采用流式细胞术对第3代BMMSCs进行CD45、CD29和CD90表型分子检查。

结果：分离纯化的BMMSCs具有典型MSCs特征，高表达CD90和CD29，不表达CD45；结论：表明普通贴壁法成功分离培养了具有间充质干细胞表型特征的大鼠BMMSCs【关键词】间充质干细胞；大鼠【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0044-02引言研究表明，骨髓含有造血干细胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多种成体干细胞。

EPCs主要分化为血管内皮细胞，有助于血管疾病组织的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潜力的特点，研究表明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化为成骨、软骨、心肌、肌腱、上皮、内皮等几乎所有三胚层类型细胞的能力[1-3]，基于这个特性使BMMSCs成为了中药诱导、临床移植及一些分子生物学实验的种子细胞源。