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总大肠菌群分析检测实施细则总大肠菌群分析检测实施细则粪大肠菌群是细菌中的一部分，是指一群在37℃ 培养2h能发酵乳搪、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。
多管发酵法一、适用范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
二、实验室所用设备、器皿1、无菌区工作台2、恒温培养箱3、高压蒸汽灭菌器4、冰箱5、酒精灯6、天平7、电炉8、采样广口瓶 9、烧杯、玻璃棒 10、玻璃发酵管 11、试管架 12、移液管 13、锥形瓶二、培养基（1）乳糖蛋白膝培养液乳糖蛋白胨培养液蛋白胨 10克牛肉浸膏 3克乳糖 5克氯化钠 5克溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL 蒸馏水 1000 mL制法：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2——7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白陈培养液除蒸馏水外，其他成分量加倍（3）伊红美蓝培养基A 蛋白陈 10gB 乳糖 10gC 磷酸氢二钾 2gD 琼脂 20g~30gE 蒸馏水 l000mlF 伊红水溶液（20g/l) 20mlG 美蓝水溶液（5g/L) 13m制法：将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kPa (115℃ ，10lb）高压灭菌20min。
临用时加热融化琼脂，冷至50℃ ～55℃ ，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
（4）革兰氏染色液4.1结晶紫染色液成分： a 结晶紫 1g b 乙醇（95%，体积分数） 20mL c 草酸钱水溶液（10g/l）80mL制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸馁溶液混合。
注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
实验九水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。
二、实验材料1.样品：水样2. 培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料)，伊红美兰琼脂(EMB)平板，乳糖发酵管。
3. 其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。
由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠菌群在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。
如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量，则说明此水已被粪便污染，并有可能含有病原菌。
大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革染氏阴性、无芽孢的杆状细菌，并能在乳糖培养基中，经37℃24~48h培养能产酸产气。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。
检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析法，为我国大多数卫生单位和水厂所使用。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
四、方法与步骤1.采样：取100ml磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。
取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。
取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口内部。
在静水中取样时，先用右手揭去塞子，瓶口朝下浸入水下约30cm处，然后将瓶子反转过来，待水注满后，取出塞好瓶口。
如果水在流动，瓶口必须迎着水流，以免手上的细菌被水冲进瓶子。
2.水样放置过程中，内含的细菌数目和类型会发生变化，所以要求水样品应于6~10℃贮存，并不超过6h。
3.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，10ml接种量采用双料发酵管，而lml及lml以下接种量采用单料管。
水中细菌菌落总数和大肠菌群的测定摘要：水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水中细菌菌落总数可作为判断被检水样被有机物污染程度的指标。
细菌数量越多，则水中有机质含量越高。
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。
由于水中的细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖。
因此采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基培养出的细菌总数仅是一种近似值。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
本实验采用多管发酵法，它是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过初步发酵实验，平板分离和复发酵实验三个部分来测定漓江水中的总大肠菌群数量，试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
关键词：细菌、菌落、大肠菌群前言：水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数中不得超过3个/L，细菌总数不得超过100个/L。
细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(m L)。
它反映的是检样中活菌的数量。
大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
通过这两个实验的好处有：了解和学习水中细菌菌落总数和大肠菌群的检验原理、检验方法、数据处理和报告方法；学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法；学习和掌握测定水中大肠菌群的多管发酵法；了解大肠菌群数量与水质状况的关系,以及它在饮水中的重要性。
大肠菌裙检测是一项非常重要的微生物检测工作，它可以帮助我们了解环境和食品中是否存在大肠菌裙，从而保证人们的健康安全。
在大肠菌裙检测中，平板计数法是一种常用的检测方法。
下面将介绍大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领。
1.准备工作在进行大肠菌裙检测之前，需要准备相应的实验器材和培养基。
实验器材包括平板计数仪、移液器、无菌培养皿等。
培养基一般选择大肠埃希氏菌（EC）培养基。
2.样品处理将待测样品取适量放入无菌容器中，进行适当的稀释。
这一步要确保样品的稀释倍数适中，以保证后续的计数结果准确。
3.接种和培养取一定量的处理过的样品，在无菌工作台上均匀涂抹于含有适量培养基的培养皿上，然后进行培养。
培养条件一般为37摄氏度，培养时间为24小时。
培养后会形成菌落，这些菌落代表了原始样品中的细菌数量。
4.计数和记录在培养后，利用平板计数仪对菌落进行计数。
计数的时候需要注意避免重复计数同一菌落，保证计数准确。
需要记录计数结果，包括菌落数量和相应的单位。
5.结果分析根据计数结果，可以对原始样品中的大肠菌裙数量进行估算。
可以通过对对照组和样品组的比较来判断样品中大肠菌裙的数量是否合格。
大肠菌裙检测中平板计数法的主要操作要领就是以上几点。
通过严格按照这些要领进行操作，可以确保检测结果的准确性和可靠性。
在进行操作过程中，还需要遵守无菌操作规范，确保实验过程中不受外界污染。
希望大家在进行大肠菌裙检测时能够严格按照操作要领进行，保证测试结果的准确性，从而更好地保障人们的健康安全。
大肠菌裙检测中的平板计数法是一种经典的微生物计数方法，它主要用于测定食品、饮用水、环境等样品中大肠菌裙的数量。
在这个过程中，我们需要注意几个关键的环节，来保证实验的准确性和结果的可靠性。
在准备工作环节，我们需要保证实验器材和培养基的质量。
实验器材一定要经过严格的消毒和清洁，以免外来细菌的污染影响实验结果。
培养基的选用也尤为重要，要选择与待测细菌的生长要求相适应的培养基，以保证细菌在培养基上的正常生长。
大肠菌群检测操作规范培训一、引言大肠菌群是指肠道内的一类细菌，包括大肠埃希菌、变形杆菌、埃斯特菌、摩根氏菌等，是人体健康的重要指标之一。
大肠菌群检测是一种常见的临床检验项目，可以用于判断肠道菌群的平衡状况，对于排查肠道疾病、调节肠道菌群平衡等具有重要的临床意义。
本文旨在对大肠菌群检测相关的操作规范进行培训，以确保检测结果的准确性和可靠性。
二、前期准备1. 实验室环境准备：（1）实验室应当保持清洁整洁，操作台面应当有足够的空间进行操作。
（2）实验室空气应当流通良好，保持适宜的温度和湿度。
（3）实验室内应当配备必要的实验仪器和设备，如PCR仪、离心机、冰箱、显微镜等。
（4）实验室内应当配备必要的耗材和试剂，如离心管、移液器、试剂盒等。
2. 人员准备：（1）参与大肠菌群检测的工作人员应当接受相关的培训，了解操作规范和实验流程。
（2）工作人员应当穿着符合卫生要求的工作服和手套，避免交叉感染。
三、操作规范培训1. 样本采集：（1）样本采集应当在临床医生指导下进行，严格按照采集标本的要求进行操作。
（2）采集的样本应当尽快送交实验室进行检测，避免样本长时间保存导致细菌数量的改变。
2. 样本处理：（1）收到样本后，应当立即进行处理，避免样本受到外界污染。
（2）样本应当在无菌条件下进行离心、抽提DNA等处理工作，避免外来细菌的干扰。
3. PCR扩增：（1）PCR扩增是大肠菌群检测的关键步骤，应当严格按照PCR扩增试剂盒说明书进行操作。
（2）PCR扩增反应体系应当准确配制，避免试剂用量不足或过量导致扩增失败或者非特异性扩增。
4. 扩增产物检测：（1）扩增产物检测应当使用准确的方法，如琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR。
（2）扩增产物的检测结果应当与正对照和负对照比较，确保结果的准确性。
5. 数据分析：（1）检测结果应当由专门的人员进行数据分析，避免结果的误解和错误解读。
（2）对于阳性结果的样本，应当进行多次重复检测以确认结果的可靠性。
大肠菌群计数检验操作规程一、目的建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化.二、适用范围适用于大肠菌群计数的检验操作。
三、职责1.检验人员严格按检验操作规程进行检验.2.QC主管监督检查执行情况.四、程序1。
范围本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定2。
术语和定义2.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3. 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。
3。
2冰箱：2℃～5℃。
3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。
3。
4天平：感量为 0。
1 g.3。
5均质器。
3。
6振荡器。
3.7无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。
3.9无菌培养皿：直径 90 mm。
3.10 pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。
3。
11菌落计数器.4。
培养基和试剂4。
1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose,LST）肉汤：见附录 A 中 A。
1。
4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录 A中A。
24.3磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A。
3.4。
4无菌生理盐水：见附录 A中 A。
4。
4。
5无菌 1 mol/L NaOH:见附录 A中 A。
5.4。
6无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.6。
5。
检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1大肠菌群 MPN计数法检验程序6.操作步骤6。
1 样品的稀释6。
1.1 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min～2 min,制成 1:10 的样品匀液。
一、编制目的为规范本中心食品中大肠菌群测定的检验方法，特编制本指导书。
二、适用范围本作业指导书适用于食品中大肠菌群( Coliforms)计数的方法。
本作业指导书第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。
三、编制依据GB/T 4789.3—2016 《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。
四、实验原理4.1 MPN法 MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。
待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
4.2平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。
五、仪器和试剂5.1设备与材料5.1.1冰箱：2℃～5℃；5.1.2恒温培养箱：36℃±1℃；5.1.3恒温水浴锅：46℃±1℃5.1.4显微镜：10×～100×；5.1.5灭菌乳钵、灭菌玻璃珠：直径约5mm;5.1.6 天平：感量0.1g；5.1.7灭菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10 mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头；5.1.8灭菌培养皿：直径90ml、灭菌锥形瓶：500mL；5.1.9灭菌刀、剪子、镊子等。
5.2培养基和试剂5.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨胨(lauryl sulfate tryptose,LST)肉汤将胰蛋白胨或胰酪胨20.0g、氯化钠 5.0g、乳糖 5.0g、磷酸氢二钾2.75g、磷酸二氢钾2.75g，溶于蒸馏水1000mL中，校正PH至6.8±0.2，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10ml。
121℃高压灭菌15min。
5.2.2煌绿乳糖胆盐(brilliant green lactose bile,BGLB)肉汤将蛋白胨10.0g、乳糖10.0g溶于约500ml蒸馏水中，加入牛胆粉(oxgall或oxbile)200ml溶液（(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中,调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975ml，调节PH7.2±0.1，再加入0.1%煌绿水溶液13. 3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管 10mL。
大肠菌群的测定1目的和要求(1)了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义(2)学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量2原理大肠菌群之一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产生气体，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间结指出食品是否有肠道致病菌污染的可能。
三步法：（1）发酵乳糖，产气产酸发酵试验；（2）初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离；（3）复发酵对分离菌做证实实验。
食品中大肠菌群数系以每100g（或100ml）检样内大肠菌群最近数(the most probable number 简称MPN)表示。
最近数MPN法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。
将3个稀释梯度的待检验样品稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释梯度试液接种3或5支。
经过培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可以得到原样品中微生物的估计数量。
MPN检测方法尤其适用于带菌量、其他方法不能检测的食品，如水、乳制品及其其他食品中大肠菌群的计数。
3材料3.1样品乳、肉、果汁、糕点、发酵调味品及其他食品。
本实验对象菠萝汁和果粒橙3.2菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气杆菌（Enterobacteria aerogenes）3.3培养基及其试剂乳糖胆盐发酵管（单料或双料）、乳糖发酵管、伊红美兰琼脂干粉（EMB）、革兰氏染色液、无菌生理盐水（9ml/试管，225ml/250ml三角瓶，内含有适量玻璃珠）、75%酒精棉球等3.4其他恒温箱、恒温水域、药物天平、无菌培养皿、无菌吸管（1ml、10ml）、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、质均器、载玻片等4流程样品↓无菌称量25g稀释↓温热的225ml灭菌生理盐水锥形瓶；再作1:10稀释度（即取1ml第一次稀释后的样品，加入到9ml的生理盐水中去）再作1:100稀释度接种、培养↓取1ml试样接种到接种到乳糖单眼发酵液中，每个梯度稀释液作3次接种，并在24±2h，36±1℃条件下进行培养初发酵结果分析↓若不产气，即为大肠杆菌阴性，报告大肠杆菌阴性；气，则划线伊红美兰琼脂平板23±3h、36±1℃进行培养分离结果↓革氏染色：若为G+阳性，报告大肠杆菌阴性；若为G-阴性则为无芽孢杆菌接种（复发酵）↓乳糖发酵管中24±2h，36±1℃件下培养最终结果产气报告大肠杆菌阳性；不产气报告大肠杆菌阴性5步骤5.1实验准备取样稀释，做成1:10、1:100、1:1000的均匀稀释液为检样。
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2 乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3 分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4 证实试验在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5 报告根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4 粪大肠菌群(faecal coliform)4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2 结果报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。
溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。
病死率一般在10%，各别可高达50%。
血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。
病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。
大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。
在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。
大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。
培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。
培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰、改良的SD-39（MSD）琼脂添加了头孢克肟和亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。
方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。
37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。
Chapman等共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。
用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。
Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需2cfu/g 。
Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。
用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。
Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。
在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。
因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。
目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。
检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。
IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。
结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。
菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。
在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。
23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC 分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。
用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。
用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。
IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。
3．生化反应目前许多国家使用的O157和H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。
因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。
典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+）葡萄糖（+）麦芽糖（+）甘露醇（+）蔗糖（－/+）硫化氢（－）尿素（－）靛基质（+）甲基红（+）V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（+/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。
MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。
大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。
Thompson等建立了一种快速MUG试验,取MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。
二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA4．免疫荧光技术5．胶乳凝集6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。
这样可去除K抗原的影响。
为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。
鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。
2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。
这一技术最初用于免疫电镜技术。
至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。
胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。
金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。
胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。
