第七章核酸分子杂交技术与核酸序列测定
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常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选,酶切图谱的制作,基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交固相杂交(solid-phasehybridization)是将变性的DNA固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜)上,再与探针进行杂交,故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交(dot hybridization)是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。
该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果,可以推算出杂交阳性的拷贝数。
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差,有一定比例的假阳性。
印迹杂交(blotting hybridization)Southern印迹杂交:凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段,将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定,再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应,用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。
可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等。
Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来,其被测样品是RNA。
核酸分子杂交的方法及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术及其在医学检验中的应用核酸分子杂交技术是一种技术,可以用来检测和识别特定的基因,查明个体与被研究物之间的关系。
在过去的几十年里,它已经被广泛应用于疾病诊断、环境检测和发现新基因等领域,基本上都要求快速、灵敏和特异性的检测结果,以及定性和定量的研究结果,而这一切都可以通过核酸分子杂交技术来实现。
本文综述其基本原理、步骤、优缺点以及在医学检验中的应用。
一、核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交技术(in situ hybridization, ISH)是一种用来识别和检测特定的基因序列的分子生物学技术,通常用于染色体分析,可以发现特定基因所在的细胞和组织。
它是根据两种相互作用的核酸分子之间结合的原理工作,即“杂交”。
在杂交反应中,一条条的核酸分子(DNA或RNA)互相结合,形成特定的结构,从而在某些非常特异的情况下进行识别。
另外,通过应用适当的荧光技术,可以直观地观察和显示杂交反应。
二、核酸分子杂交技术的步骤核酸分子杂交技术包括以下几个步骤:(1)样本准备。
样本准备是研究时的第一步,在这一步骤中研究者根据自己的研究需求,选择合适的样本。
(2)核酸分离。
在核酸分离步骤中,由于核酸是微小的,因此需要采用特殊的技术来从样本中分离出核酸,而这些技术通常是PCR,即聚合酶链反应,用于提高核酸的灵敏度。
(3)核酸杂交。
在核酸杂交的步骤中,首先,将抗体结合到探针中,然后将探针与样本中的核酸结合起来,形成双螺旋构型,从而实现特异性识别。
(4)信号分析。
在信号分析步骤中,需要对样本中的核酸进行鉴定,以及检测所测试的核酸是否核苷酸序列正确的特定目的。
最常见的技术是利用基因组芯片,通过它们可以对大量的基因进行组合扩增,从而识别、分析和检测出特定基因。
三、核酸分子杂交技术的优缺点(1)优点核酸分子杂交技术有很多优点,如:(1)操作简单,容易实现自动化,可以提高生产效率;(2)能够检测出对特定基因的非常特异性的序列;(3)可以测定大量基因,使得研究者可以更容易地进行基因组学研究;(4)技术可以检测出胞内和蛋白质的体外表达;(5)核酸分子杂交技术的发展使得药物研发有了新的思路和突破,可以更加准确高效地展开新药的研发。