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rnai干扰技术原理
RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是一种通过特异性降解靶向基因mRNA的方法，从而抑制目标基因表达的技术。
RNAi 技术的原理源于细胞内天然的基因沉默机制，通过这种机制，细胞可以利用小分子RNA来调控基因表达。
RNAi技术的应用已经在基础研究和临床治疗中取得了重要进展。
RNAi技术的原理基于三个主要分子，小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和RNA诱导沉默复合物（RISC）。
siRNA是由外源DNA或RNA转录而来，它可以与靶向基因的mRNA互补配对，从而导致该mRNA的降解。
miRNA则是由内源基因产生的，它们可以与mRNA 的3'非翻译区域互补配对，从而抑制翻译或导致mRNA的降解。
RISC是一个多蛋白复合物，它能够识别并结合siRNA或miRNA，并将其引导到靶向mRNA上，从而促进mRNA的降解或抑制翻译。
RNAi技术的应用非常广泛，包括基因功能研究、药物研发和治疗等领域。
在基因功能研究中，科研人员可以利用RNAi技术靶向性地沉默特定基因，从而研究该基因在细胞生物学和生理学过程中的作用。
在药物研发领域，RNAi技术被用于开发针对特定基因的治疗药物，例如针对癌症和遗传性疾病的治疗。
此外，RNAi技术还被应
用于农业领域，用于改良作物品质和抗病性。
总之，RNAi技术作为一种强大的基因沉默技术，已经在生命科学研究和医学领域发挥了重要作用，并且有着广阔的应用前景。
随着对RNAi技术原理的深入理解和技术的不断改进，相信RNAi技术将会在未来发挥更加重要的作用。
12用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（１－３）后要立刻抽提蛋白，进行分析用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系瞬时RNAi短时转染是一种常见的简单生物手段，这种手段能够将外源性的siRNA或是能够编码siRNA的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中。
转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中。
转染过程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用加速基因物质进入细胞质。
或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含物体，然后经过内吞作用进入细胞质中。
.不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的siRNA不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解。
转染的外源DNA由于不能够插入核内基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。
一旦所转染的细胞中siRNA消失后，靶基因功能又重新恢复到转染前水平。
采用转染技术来产生基因沉默通常要在４８－７２小时才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持２４－９６小时。
因此，siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的siRNA干扰效率。
当前，由于siRNA转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主要用于短时基因沉默。
长久RNAi由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的沉默。
siRNA转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成siRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞。
RNA介导的基因沉默技术研究基因沉默是基因表达调控的一种机制，它通过阻断基因转录或抑制已经转录的mRNA的翻译来抑制基因表达。
RNA介导的基因沉默技术采用了RNA作为调控基因表达的工具。
这种技术广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农作物改良等领域。
RNA介导基因沉默技术主要分为siRNA、miRNA和shRNA三类。
1. siRNAsiRNA是20-25个核苷酸的双链RNA，它通过与靶基因mRNA特异性杂交，介导RNA诱导靶基因沉默。
这个过程通过小核RNA和RISC( RNA-Induced Silencing Complex)协同完成。
当siRNA与mRNA杂交后，RISC会切断mRNA形成不完整的片段，导致mRNA降解或翻译抑制。
siRNA技术可以实现精准靶向，对于多种疾病治疗具有潜在的应用价值。
但是，siRNA技术的缺点是需要选择合适的RNA靶点，并且siRNA的短寿命和难以穿透细胞膜限制了其广泛应用。
2. miRNAmiRNA是20-24个核苷酸的单链RNA，它通过特异性结合目标mRNA，同时与RISC结合，引导RISC切割目标mRNA分子。
同时，miRNA还可以通过直接结合靶标的5’端和3’端调控mRNA 的效率和速度。
miRNA广泛参与基因表达调控，可以调控20000多种基因的表达。
miRNA的缺点是具有很高的复杂性和不确定性。
miRNA靶基因的预测算法准确性存在差异，miRNA同靶基因的作用机制还需要进一步研究。
3. shRNAshRNA是基于RNA干扰技术的新型分子，可以在基因水平靶向RNA，抑制基因表达。
shRNA是单链RNA，具有RNAi引发靶基因沉默的功能。
其优点是技术简单，稳定性较好，可以长期干扰一个基因，生成稳定的RNAi信号。
但是，shRNA技术的缺点是仍然存在一些安全性问题和非特异性靶向的可能性。
实现精准稳定靶向仍然是一个需要解决的问题。
RNA介导的基因沉默技术具有广泛的研究和应用前景。
RNA干扰及其机制RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种在真核生物中广泛存在的保守的基因调控机制。
它通过靶向特定的RNA分子，降低或抑制其转录或翻译，从而实现对基因表达的调控。
RNA干扰机制包括小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）和microRNA(miRNA)两种方式。
RNA干扰的机制主要涉及到siRNA和miRNA的合成、成熟和靶向调控过程。
siRNA是由外源RNA（如病毒RNA）或内源RNA（如转座子RNA）降解产生的小分子RNA，它与RNA诱导的沉默复合体（RISC）相结合，通过序列互补靶向其作用靶标RNA分子，导致靶标RNA的降解或翻译抑制。
miRNA则是内源性产生的一类小RNA，通过转录、剪切和成熟过程产生成熟miRNA，与RISC结合后，靶向调控多个mRNA的翻译。
在siRNA合成过程中，双链RNA（dsRNA）首先由核酸多聚酶复制或RNA转录过程产生，而在miRNA合成过程中，则由miRNA前体RNA经过外核脱去部分序列后产生。
这些长链RNA经过核酸酶Dicer酶的作用进一步加工成为长度约为21-23个核苷酸的双链小miRNA或siRNA。
miRNA与RNA诱导的沉默复合体（RISC）结合后，通过序列互补机制靶向特定的mRNA，从而发挥调控的作用。
RNA干扰的调控作用主要通过两种方式实现：一是通过mRNA的降解，siRNA或miRNA与RISC结合后，通过靶标mRNA上的完全或部分互补序列，引导RISC靶向特定mRNA上的区域，使该mRNA受到核酸内切酶的攻击，导致mRNA的降解；二是通过转录的翻译抑制，siRNA或miRNA与RISC结合后，通过靶标mRNA上的互补序列，抑制其翻译的发生，使得mRNA不能被核糖体识别和翻译出蛋白质。
在细胞中，RNA干扰不仅参与基因的调控，还参与到染色体剪接、DNA甲基化和染色质乃至整个基因组的稳定性调控中。
ｓｉＲＮＡ和ｍｉＲＮＡ的研究进展摘要RNAi（RNA interference）即RNA干涉，是由外源或内源性的双链RNA （double starand RNA，dsRNA）导入细胞而引起的与dsRNA 同源的mRNA 降解，进而抑制相应基因表达，可以抑制诸多真核基因的表达。
siRNA（small interferance RNA ，siRNA）即小干扰性RNA，是RNA干扰的引发物，不同的siRNA 可以引导不同水平的RNAi。
非编码RNA 中的微小RNA（micro RNA，miRNA），能够识别特定的目标mRNA，通过与mRNAs 3’非翻译区结合，影响蛋白翻译水平。
miRNA和siRNA在生成机制、作用途径等方面关系密切，既区别又相互联系，小分子RNA的研究将是今后分子生物学的研究热点之一。
关键词RNAi；siRNA ；miRNARNAi（RNA interference）即RNA干涉，也称RNA干扰，是由外源或内源性的双链RNA（double starand RNA，dsRNA）导入细胞而引起的与dsRNA 同源的mRNA 降解，进而抑制其相应的基因表达[1]。
RNAi是生物体内的一种进化保守机制，是机体为了抵抗病毒入侵的一种天然保护作用。
这种沉默机制首先是在研究线虫（C.elegans）发育缺陷时发现的。
随后，在各种模式生物（如果蝇、拟南芥、小鼠等）中，人们通过克隆测序及生物信息学的方法发现并寻找到了多个类似的微小RNA，证明RNAi介导基因沉默现象在生物体内普遍存在。
在多种植物和动物中存在着不同数量的微小RNA，其中有些具有众多的表达数量及特定的表达模式，并且在众多物种间具有不同程度的序列保守性。
小干扰性RNA（small interferance RNA ，siRNA）是RNAi的主要引发物，在生命调节中发挥了重要作用，本文对siRNA及miRNA的研究进展做一综述。
1siRNAsiRNA是病毒感染细胞或发生转座子活动时产生的，能降解其同源mRNA 的RNA小分子，长度一般约为22 nt。
RNA介导基因沉默和基因表达调控在生物学领域，RNA在基因沉默和表达调控中扮演着重要的角色。
事实上，RNA几乎可以编程生命。
RNA通过多种方式与DNA交互作用，介导基因沉默和表达调控，从而在细胞内掌管一系列生物学功能。
RNA介导的基因沉默RNA干扰（RNAi）是通过RNA介导的基因沉默的过程。
在RNAi中，双链RNA通过RNA酶剪切形成短RNA（如小干扰RNA和微小RNA），并与RNA识别复合物（RISC）结合。
RISC可通过与特定靶标mRNA的互补匹配来识别和切割它们。
一些小RNA，如小干扰RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA），可以与RISC结合并改变与它们匹配的mRNA的转录和翻译，从而介导基因沉默。
在RNAi中，siRNA由外源产生，例如病毒入侵或实验室制备，而miRNA则由细胞内生成。
一些miRNA通过向mRNA靶标提供“停车位”，从而控制靶标的翻译和/或降解。
RNA介导的基因表达调控除RNAi外，RNA还负责介导基因表达调控。
转录因子是大多数基因表达的主要调节因子，它们通过结合特定的DNA序列来控制基因表达。
有些转录因子通过与RNA相互作用，进一步调节基因表达。
蛋白质编码基因的长非编码区域（lncRNA）是一种新发现的RNA类别，可能在调节基因转录中发挥积极作用。
lncRNA通过与转录因子或调节因子相互作用来影响基因的表达。
与siRNA和miRNA不同，lncRNA逐渐被视为注重背景噪音，但是越来越多的证据表明，它们确实可以改变某些基因的表达模式。
RNA疫苗和药物由于RNA在基因调控中核心的作用，RNA技术有望被广泛应用于疾病治疗和药物开发。
例如，RNA疫苗被研发出来，可利用RNA的基因沉默机制来触发免疫反应防止病原体感染。
RNA干预（RNAi）技术还可被应用于基于基因的疾病治疗，例如癌症和病毒感染。
另外，由于lncRNA在基因调控中的作用，它们也被广泛应用于药物研发中。
lncRNA在基于基因的疾病治疗和免疫调节中具有很好的应用潜力。
RNAi（RNA interference），也称RNA干扰，是一种通过RNA分子阻止基因表达的现象。
RNAi在生物科技研究、药物研发等领域得到广泛应用。
RNAi的分子机制主要涉及到三种方式：
1. 小干扰RNA机制：外源性（如病毒携带）的dsRNA在体内被Dicer酶加工成21-23nt长度的siRNA，按照碱基互补配对原则与靶mRNA完全互补配对而引发靶mRNA的降解，从而抑制靶基因的表达。
2. 重复相关siRNA机制：来源于基因组内重复序列的dsRNA在体内被Dicer 酶加工成siRNA分子，形成RNA诱导的转录沉默复合体，进一步识别DNA序列上的互补序列，引起染色质修饰。
3. 微小RNA（miRNA）机制：与siRNA不同，miRNA与靶mRNA的结合是通过碱基的不完全互补配对而实现，它并不引起靶mRNA的降解而是引起靶mRNA在翻译水平上的抑制。
RNAi的作用是在多重水平上发挥作用的。
最初在华丽新小杆线虫中发现，dsRNA所诱导的基因沉默在转录后水平，因为dsRNA导致了相应RNA（mRNA）的降解，而基因启动子和内含子序列作为基因沉默触发物则无效。
后来在植物中也发现，RNAi引起的基因沉默也是在转录后水平。
除此转录后水平降解mRNA 的机制外，RNAi还通过其他机制来影响基因表达。
总的来说，RNAi的分子机制涉及到多种复杂的生物学过程和分子互作，这些过程共同实现了对基因表达的精确调控。
1。
RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因治疗开辟了新的途径。
近两年来，这方面的科学论文及报道爆炸性增长，几乎每天都有新的结果涌现。
这些论文中，出现了很多与RNA干扰相关的概念，意思很相近但并不完全相同，这里列举了几个常见的RNA干扰相关的名词及其简单的解释：1、miRNA：在遗传学中，微RNA（microRNAs，miRNA）是长度在21-23个核苷酸之间的单链RNA片段，调节基因的表达。
miRNA由基因编码，从DNA 转录而来，但不翻译成蛋白。
初级转录产物（primary transcripts，pri-miRNA）缩短其颈环结构得到功能性的miRNA。
成熟的miRNA分子与一个或更多个mR NA分子部分互补，其主要功能是下调基因的表达。
而microRNA这个概念第一次在2001年Science (26 October 2001)的文章中出现。
2、dsRNA：双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）是一种有互补链的R NA，与细胞中发现的DNA相似，dsRNA构成了一些病毒（双链RNA病毒）的基因组。
像病毒RNA或siRNA之类的双链RNA能够促发真核细胞中的RNA 干扰，引起脊椎动物中的干扰素反应。
3、shRNA：小发卡或短发卡RNA（a small hairpin RNA or short hairpin RN A, shRNA）是一段具有紧密发卡环（tight hairpin turn）的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。
利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上（RNA-induced silencing complex，RISC），该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。
RNA干扰机制与基因调控随着科技的不断发展，人们逐渐认识到RNA在基因调控中起到的重要作用。
RNA干扰机制是其中的一个重要部分，它通过RNA介导的基因沉默和转录后基因沉默来完成对基因的调控。
本文将从RNA干扰机制的基本概念、RNAi和miRNA 两种干扰机制的区别、RNA干扰机制和基因调控之间的关系等方面进行探讨。
一、RNA干扰机制的基本概念RNA干扰是细胞利用RNA分子特异性介导的基因调控过程，可实现基因沉默和转录后基因沉默。
RNA干扰最早发现于拟南芥，由美国获得了2006年度诺贝尔生理或医学奖。
RNAi被认为是RNA干扰的一种形式，始于在真菌中发现的基因调控机制。
RNAi中的siRNA与miRNA都能在生物体内介导靶向特异性基因的带有核酸酶作用的复合物，在水解靶标RNA后沉默靶标基因的表达。
二、RNAi和miRNA两种干扰机制的区别RNAi是由外源dsRNA引起的，所形成的小分子干扰RNA(siRNA) (19~25mer)在RISC(RNA-induced silencing complex)的协同参与下沉默mRNA的翻译或降解靶标mRNA，但siRNA的细胞寿命短暂(短至小时)，是一种通过转录后基因沉默的方法，局限于特定基因区域中。
miRNA是一个由内源性基因转录产生的单链局部二级结构RNA(70~100nt)，在Dicer的作用下切割出一个21~25nt左右的墨子结构RNA，成为小RNA，mmiRNA 与miRNA相似，但是起点不一样，miRNA具有广泛性调控，是一种通过mRNA 3'UTR结合沉默实现对不特定基因区域的调控。
三、RNA干扰机制和基因调控之间的关系RNA干扰机制和基因调控是密切相关的，RNA干扰机制是一种在基因调控过程中起重要作用的机制。
RNA干扰通过两种不同的机制来实现对基因的调控，即RNA介导的基因沉默和转录后基因沉默。
RNA介导的基因沉默通过介导siRNA，利用RNA诱导基因沉默复合体(RISC)去引起基因的沉默，后者利用小分子RNA(mRNA)在RISC的协作下进行靶向作用，引导RNA酶切除聚合酶切断靶标RNA。
用siRNA 进行transient transfection 不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天(1 —3)后要立刻抽提蛋白，进行分析
用质粒中的shRNA 进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长
用病毒中的shRNA 进行感染( infection ) ，抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系
瞬时RNAi 短时转染是一种常见的简单生物手段，这种手段能够将外源性的siRNA 或是能够编码siRNA 的质粒通过非病毒感染的方式导入细胞中。
转染的细胞通常在细胞质膜表面有一个短时小孔或者一个“洞”，这些特殊的孔结够能够让基因物质通过细胞膜进入细胞质中。
转染过程中可以借助磷酸钙与形成极小的磷酸钙复合物沉淀黏附在细胞膜表面，而借助内吞作用加速基因物质进入细胞质。
或者也可以通过借助带正电荷的阳离子脂质体形成脂质体包含物体，然后经过内吞作用进入细胞质中。
. 不过上述的这些转染技术所产生的沉默作用持续时间较短，因为所诱导的siRNA 不能够进行自身复制而且会因为细胞的分化而被稀释或降解。
转染的外源DNA 由于不能够插入核内
基因组通常会在细胞经历有丝分裂过程中丢失。
一旦所转染的细胞中siRNA 消失后，靶基
因功能又重新恢复到转染前水平。
采用转染技术来产生基因沉默通常要在48-72小时才能达到高沉默率，而且根据不同转染效率也只能维持2 4 - 9 6小时。
因此，siRNA转染可作为短期分析基因功能的有效工具，而且可以方便快速去验证针对靶基因所设的siRNA 干扰效率。
当前，由于siRNA 转染技术易于制备、随时可用以及很短的操作时间等特点主要用于短时基因沉默。
长久RNAi
由于表型改变通常和基因型改变在时间上不同步，许多分析试验就要求长时间对靶基因的沉默。
siRNA 转染直接产生的沉默由于其短时性就不能用于长时间的实验研究，人工合成siRNA的转染手段由于其不稳定性和低转染效率不能广泛运用于其他类型细胞。
使用载体质粒手段也同样受细胞系限制，比如原代细胞就不能转染其用做长期培养研究。
长时期的基因沉默就特别需要发展一类长期稳定的细胞系，这就要求所转染的外源基因能够长期留在宿主细胞基因组中或者其子代细胞细基因组中. 。
病毒介导siRNA 载体其病毒高感染效率特点对于原代细胞和其它难转染细胞是一种很好的选择。
为了准确地测定siRNA 对细胞靶基因的沉默效率，就必须能够转染更多的细胞。
否则，如果转染细胞的数量不够的时候，那么在使用RT-PCR或Western analysis 进行分析
的时候，背景条件中的非转染细胞就会干扰我们对转染细胞的分析结果。
目前，有下面几种表达传递发卡siRNA 病毒载体，包括： 1. 逆转录病毒载体, 这是一种比较好用的载体，它能够将siRNA 表
达框整合到分化的细胞基因组中并能够通过在抗生素选择条件下维持稳定长期的hsRNA表达。
2•慢病毒载体，这种载体扩大了宿主细胞的种类包
括一些未分化的细胞和分化末期细胞，通过扩增，转导成功的细胞基因组中将会永远包含
shRNA表达框，并能够稳定表达shRNA产生持久的基因沉默的效果。
3.腺病毒载体，这
也是一种常见的分整合病毒，它能够感染分化和未分化的细胞，但只能在细胞中以一种游
离体的形式存在。
优点缺点
短暂转染方便快捷不可再生，短期
稳定转染稳定性，永久性滞后性，致死性
可诱导RNA 干扰可逆调控耗时
RNA、miRNA及siRNA的区别和联系
RNA干扰（RNAi）：近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA 组成的双链RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA 发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing, PTGS）被称为RNA 干扰（RNAi）。
MicroRNA（miRNA,微RNA）:即为长度为22nt左右的5端带磷酸基团、3端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA 家族。
小干涉RNA（siRNA ）:是在RNA 干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20 个碱基对组成，包括 5 个磷酸盐， 2 个核苷和 3 个悬臂。
miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。
2.二者都依赖Dicer 酶的加工，是Dicer 的产物，所以具有Dicer 产物的特点。
3.二者生成都需要Argonaute 家族蛋白存在。
4.二者都是RISC 组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。
5.miRNA 和siRNA 合成都是由双链的RNA 或RNA 前体形成的。
miRNA与siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA 是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA 干涉的中间产物。
2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。
3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA 是不对称加工，miRNA 仅是剪切pre-miRNA 的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA 对称地来源于双链RNA 的前体的两侧臂。
4. 在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3-UTR区，而siRNA可作用于mRNA 的任何部位。
5.在作用方式上，miRNA 可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA 只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。
6.miRNA 主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而
siRNA 不参与生物生长，是RNAi 的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
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