Waters AccqTag 方法

AccQ—Tag法测定依替巴肽的氨基酸比值目的：建立反相色谱法测定依替巴肽的氨基酸比值。

方法：采用以6- 氨基喹啉- N- 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）與各氨基酸柱前定量衍生后，经反相色谱测定。

结果：在范围内各氨基酸的线性关系良好，精密度，溶液稳定性，回收率均良好。

结论：该方法准确可靠，重现性好，易于操作，可用于依替巴肽中氨基酸组成的测定。

标签：AccQ- Tag；依替巴肽；氨基酸比值ABSTRACT OBJECTIVE：To establish an HPLC method for determination of Amino acid ratio in eptifibatide . METHODS：the 6-amino decoquinate-N-hydroxyl succinyl imide formicether （AQC）was taken as the derivative reagent to make for the column quantitative derivatization with each amino acid and then to elute by Reverse phase chromatography.RESULTS：Good linearities were obtained for all amino acids.The method showed high selectivity，good repeatability，accuracy and stability . CONCLUSION：The method is simple and rapid and it is applicable for determination of Amino acid ratio in eptifibatide.KEY WORDS AccQ- Tag；ptifibatide；Amino acid ratio；氨基酸比值测定是多肽药物质量控制的重要环节，也是多肽原料药质量标准的重要组成部分，通过测定多肽药物的氨基酸理论个数比，从侧面佐证多肽的结构。

目录I. II. III.IV. 入门指南 a.处理要求b.为氨基酸分析设置自动移液平台c.准备Tecan Freedom EVO 100/4d.试剂制备e.校准品、质量控制标准品、内标和 AccQ•Tag 复溶说明f.试剂布局g.样品分发和条形码h.执行自动样品制备脚本V. 推荐的分析方法VI. 工作流程概述VII.订购信息I. 简介收货后请核对试剂盒清单，如果包装被打开、损坏，内容物缺失或超出有效期，请勿使用本产品。

如需订购替换试剂盒或部件，请联系当地的销售代表。

订购时请提供所需产品的产品部件号和批号。

Waters Kairos 氨基酸试剂盒 - 自动Waters AccQ•Tag 试剂。

NNO NH OOO简介保存和稳定性使用Kairos氨基酸分析试剂盒a.Kairos 氨基酸LC 分析方法b.Kairos 氨基酸MS 分析方法非常感谢您购买Waters™ Kairos™氨基酸试剂盒，此试剂盒仅供研究使用。

本文将介绍Kairos 氨基酸试剂盒(仅供研究使用)的常规维护和使用信息，以期协助您精准测定血浆和尿液样品中的氨基酸。

本文中的方法已经使用AccQ•Tag™衍生化试剂、ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS 系统、Xevo™ TQ-S micro 和ACQUITY QDa™质谱检测器进行了验证，但我们仍建议您根据具体样品优化分析条件并确认分析结果是否准确，尤其是当样品不完全符合工作站及脚本要求时。

为了确保通用性，该试剂盒中所有试剂的量都经过相应扩大，可适应不同自动移液工作站的残留体积要求。

沃特世不提供有关自动化的咨询服务。

如果需要根据特定工作站的要求进行任何调整，建议您直接联系移液工作站供应商寻求帮助。

如果偏离了脚本或工作站要求，用户应自行确保结果准确度得到确认。

本维护和使用手册针对该方案的实施提供了十分详细的分步操作说明。

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AccQ-Tag法测定田参氨基酸胶囊中的氨基酸含量陈　华(广东省药品检验所,广州510180) 摘　要　以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(A Q C)为衍生剂,与田参氨基酸胶囊中的氨基酸柱前定量衍生,用W ater s HPL C仪,P ico.T ag柱,以140mmo l/L的醋酸钠溶液(pH4.95)为溶剂A,乙腈-水(3∶2)为溶剂B,进行梯度洗脱,于248nm测定十种氨基酸,方法简便,结果满意。

关键词　A ccQ-T ag法;田参氨基酸胶囊;氨基酸;6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯中图号　R927.2 田参氨基酸胶囊是采用中国名贵药材人参、田七与日本进口的十种结晶氨基酸运用现代先进工艺技术研制而成。

临床实践证明,田参氨基酸胶囊对肿瘤病人有扶正驱邪的功效。

目前,其质量标准载于《广东省药品标准》(粤Q/WS-2628-96),其“含量测定”项目是规定测定总氮含量。

现认为药品生产时以氨基酸投料,应测定其中十种氨基酸各自含量更严谨,对控制产品质量意义重大,故建议改测总氮量为测十种氨基酸含量。

目前常用的氨基酸测量法,如异硫氰酸苯酯(P IT C)法、邻苯二甲醛(O PA)法等,操作繁琐。

现参考文献[1、2],用A ccQ-T ag法测定,简便快速,能完全分离样品中十种氨基酸,重现性好,灵敏度高。

1　材料和方法1.1　药品和试剂盐酸精氨酸、亮氨酸、盐酸组氨酸、异亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸对照品(日本味之素);6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯、简称A Q C(W ater s公司);田参氨基酸胶囊(广东火星制药厂);乙腈(色谱级),其他试剂均为A R级。

1.2　仪器及色谱条件仪器条件:W ater s2010色谱工作站,Wa ters510泵,Wat ers996检测器。

色谱条件:色谱柱Pico-T ag 柱,3.9m m×150mm,4 m;柱温37℃;检测波长248nm;进样量5 l;流速1.0ml/min梯度洗脱。

AccQ-Tag法测氨基酸含量1.所需设备及试剂1.1.设备：a.天平（精度O.1mg）；b.PH计（精度O.O1级）；c.单标线吸管（50m1）；d.容量瓶（500m1）；e.溶剂过滤器及滤膜（0.45I Jm）；f.试管（1.5x15cm,1.5×IOcm）;g.样品管（6x50mm）；h.微量进样器（10μ1）;1.微量可调移液器（20μ1,100μ1,1000μ1）及吸头；j.旋涡混匀器；k.烘箱（55℃）；1.HP1C系统及AccQ-Tag柱。

1.2.试剂：a.超纯水（＞18MΩ∙cm）;b.乙月青（HP1C级）；c.WatersAccQ-Tag流动相A浓液d.WaterS氨基酸水解液标准（H）；c.WaterSACCQ-F1uor试剂盒（包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B）。

2.流动相A制备：吸取50m1WatersAccQ-Tag流动相A浓液，放至500m1容量瓶中，加超纯水至刻度，用0.45μm滤膜过滤后备用。

3.衍生3.1.标定标准制备3.1.1.ImmO1/1色氨酸标准液：称取色氨酸（生化试剂）20.4mg,加超纯水溶解至Ioom1。

3.1.2.含色氨酸的标定标准：取1支WaterS氨基酸水解液标准，打开后吸取1m1,放至一支干净的1.5x15Cm试管中，加2.5m1色氨酸标准液，6.5m1超纯水，旋涡混匀，每支EPPendorf管分装ImI备用。

（此标准含有的色氨酸的浓度与其它氨基酸一样，为0.25mmo1∕10）3.1.3.10倍稀释后的标准可在-20C保存1个月。

剩余的氨基酸水解液标准可在-20℃保存3个月。

未启封的氨基酸水解液标准可在4℃保存1年。

使用-2（）℃保存的标准应充分解冻并混匀。

32衍生试剂制备1.1.1.将烘箱预热至55土1℃；1.1.2.取一瓶衍生剂粉2A,轻轻敲动以确保打开前所有粉末落在瓶底；1.1.3.吸取ImI稀释液2B并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头；（警告：稀释液2B为乙精，可燃且有毒，参考安全数据表。

茶氨酸的研究进展相关专题：添加剂时间：2012-04-12 12:29 来源：中国资讯网【阿里巴巴化工】茶氨酸是茶叶的特征氨基酸。

大量研究表明,茶氨酸的含量不仅对茶叶的品质有很大的影响,而且具有促进大脑功能和神经的生长、抗肿瘤、降压安神等功效。

本文综述了近十余年来国内外在茶氨酸的形成、积累、测定、制备及应用方面的研究进展。

1 引言至今为止人们在茶叶中已发现25种氨基酸。

其中茶氨酸约占氨基酸总量的50%。

大多数学者认为茶氨酸是茶叶的特征氨基酸,因为到目前为止除了在茶梅、山茶、油茶、簟等四种天然植物中检测出其微量存在外,其他植物中尚未发现。

茶氨酸(theanine)是1950年日本学者酒户弥二郎首次从绿茶中分离并命名的,它属酰胺类化合物,化学命名:Ｎ乙基Ｌ谷氨酰胺,结构式:ＨＯＣＯＣＨＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ3。

自然存在的茶氨酸均为Ｌ型,纯品为白色针状结晶,熔点217～218℃(分解),比旋光度[α]20Ｄ=0 7°,极易溶于水,水解度呈微酸性,有焦糖香及类似味精的鲜爽味,研究证明它的含量与绿茶的品质密切相关,相关系数为0 787～0 876[1]。

2 茶叶中茶氨酸研究进展作为茶叶的特征氨基酸,茶氨酸几乎存在于茶树的所有器官和组织中。

经大量研究表明,茶氨酸在茶树的根部形成,然后向新梢积聚,因而茶树新梢中茶氨酸含量最高。

茶氨酸的形成是茶树储存氮的手段之一,这是因为茶氨酸被茶氨酸水解酶水解为谷氨酸和乙胺,乙胺在胺氧化酶的作用下产生氨和乙醛,氨可作为氮源供茶树的幼龄组织生长,因此茶氨酸是茶树幼芽光合作用开始前有机碳骨架合成的起始物,而且也是茶树中多酚类物质的重要前体。

茶氨酸在茶树中的积累与光照、温度和合成前体密切相关。

研究发现当温度为25℃,黑暗条件下,在培养基中加入盐酸乙胺能明显增加茶氨酸的积累。

1992年我国学者李荣林等对茶树新梢中茶氨酸的分布情况及其在不同季节、不同品种和不同栽培条件下含量的变化作了较全面的研究[2]。

应用AccQ柱前衍生高效液相色谱法检测黑大麦中的游离氨基酸申晓蓉;陈士恩;郭鹏辉;李占虎;李绪伦;韩霁光;李振明;王娟妮【摘要】Objective： AccQ- Tag methods used in this paper, derivatized with 6- arninoquinolyl- N- hydroxysuccinimidyl carbauiate （AQC） as the reagent, isolated and tested samples of black barley types and levels of free amino acids. The results show that： in the detection of nine free amino acids, the lowest was Asp（2.3±0. 031μmol/g）, and the highest was phe（347.6 ±8. 052μmol/g） which is 46.67% of total amino acids, And the amino acid concentration and peak area showed a good linear relationship between higher stability; This method is simple, accurate and reliable, high sensitivity, it can be used prospectly in the development and use and quality control of the black Barley.%采用AccQ柱前衍生高效液相色谱法，以6-氨基喳啉-N-羟基琥珀酰亚胺基．氮基甲酸酯（AQC）为衍生试剂。

分离并检测了黑大麦样品中游离氨基酸种类及其含量．结果表明：在检测出的9中游离氨基酸中，天冬氨馥含量最低（2．3±0．031μmol／g），苯丙氨酸的含量最高（347．6±8．052μmol／g）；占氨基酸总量的46．67％，且氨基酸浓度与峰面积呈良好的线性关系．此方法稳定性较高，操作简单，准确可靠，具有较高的灵敏度，在黑大麦的开发与利用以及质量控制方面具有很好的应用前景．【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)003【总页数】5页(P65-69)【关键词】6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯（AQC）;黑大麦;游离氨基酸【作者】申晓蓉;陈士恩;郭鹏辉;李占虎;李绪伦;韩霁光;李振明;王娟妮【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200【正文语种】中文【中图分类】TQ421.381黑大麦具有能促进人体健康长寿的合理食物结构,属于“三高一低”作物,即高蛋白、高维生素、高纤维素,低脂肪、低糖;同时也富含钙、铁、锌、硒等多种微量元素,其综合指标均高于小麦、玉米、水稻和燕麦等,营养全面而独特,具有极高的营养价值[1].AccQ-Tag分析方法是Waters公司开发的测定氨基酸的方法[2～4],本文以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)为衍生试剂,对黑大麦中的游离氨基酸进行了分离测定,旨在建立一套可靠、快速、分离效果好、灵敏度高、定量准确的黑大麦中游离氨基酸含量的测定方法,以期对黑大麦的开发与利用以及质量控制提供理论参考和技术支持.1 材料与方法1.1 试验材料黑大麦,采自甘肃省宁县.1.2 试验仪器与试剂高效液相色谱仪:(VARIAN PROSTAR 800/363/240/);色谱柱:AccQ-Tag TM柱(美国Waters公司);真空抽滤装置、旋转蒸发器;60 cm×45 mm分离柱,95%乙醇,0.1%醋酸铅,10%三氯乙酸,10%乙酸,1%NaCl,乙醚;乙腈,四氢呋喃,AQC荧光衍生剂,732强酸性阳离子交换树脂,1 mol/L茚三酮溶液.1.3 试剂配置1.3.1 流动相A液的配置采用美国Waters公司提供的硼酸缓冲液,用前取400 mL硼酸缓冲液加高纯水600 m L混匀,超声脱气30 m in.1.3.2 流动相B液流动相B液(稀释乙腈)的配置,由美国Waters公司提供,用前取100 m L乙腈贮备液加纯水900 mL及90μL四氢呋喃混匀,超声脱气30 min.1.3.3 AQC衍生试剂的配置吸取lmL乙睛加入装有衍生剂粉末的瓶中,震荡10 s,放入烘箱,55℃加热10 min 直至粉末完全熔化,即得AQC衍生试剂.1.3.4 标准溶液的配置移取40μL250 mmo1/L的氨基酸混合标准溶液(含17种氨基酸),加入40μL 250 mmo1/L内标物,用高纯水稀释至不同浓度,于4℃冰箱中保存备用.1.4 实验方法1.4.1 样品预处理从宁县随机采取36份黑大麦样品,每份1.5 kg,用纸袋包装备用.每份黑大麦样品试验时充分混匀,精密称取样品5 g,在冰浴条件下加入10 mL10%乙酸完全研碎,转移至250 mL三角瓶中,加入10%三氯乙酸10 m L、10%乙酸10 m L、0.1%的醋酸铅5 m L、95%的乙醇10 m L,沉淀过滤,冰箱4℃保存.24 h后取出经沉淀脱糖去除有机物,真空抽滤去掉固体物质,留滤液,脱脂,24 h后过滤沉淀,最后在40℃条件下旋转蒸发至2 m L备用.1.4.2 样品纯化将制备好的2 mL样液,置于处理过的732强酸性阳离子树脂柱中,再加5 mL去离子水,待液体通过树脂后加50 m L 2 mol/L NH4OH,然后用50 m L去离子水洗涤,将洗涤液收集在自动收集器的180根小试管内,用1 mol/L的茚三酮进行各个收集管的显色反应,收集在滤纸上与茚三酮反映出现紫红色的试管中的液体,用去离子水定容至25 m L,备用.1.4.3 样品的衍生化将纯化后的样品经0.45μm的滤膜过滤,去除的杂质,与AQC荧光试剂充分混合,室温静置10 min,待测.1.4.4 色谱仪条件色谱柱:AccQ-Tag TM柱(美国Waters公司).流动相A:硼酸缓冲液;流动相B:乙腈;流动相C:超纯水,柱温35℃,进样量10μL,梯度洗脱条件如表1所示[5].表1 流动梯度洗脱条件时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速mL/min 0 100 0 1 17 91 9 1 24 80 20 1 32 68 32 1 34 68 32 1 35 0 100 1 37 0 100 1 38 100 0 1 45 100 0 12 结果2.1 标准氨基酸衍生物色谱图图1 标准氨基酸衍生物色谱图将氨基酸标准液稀释成5个浓度后,经AQC衍生后采用氨基酸自动分析仪分析检测(进样量为20 μL),得到氨基酸混合液标准分析图谱(图1,横坐标为氨基酸保留时间,纵坐标为响应值).由图1可知,17种标准氨基酸的排列顺序依次为(从左到右):天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(A rg) 、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(lle)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe).其图谱清晰、分辨率高、操作简单.2.2 标准氨基酸回归方程分析表2 氨基酸混合液标准曲线序号氨基酸(μLmol/mL) 保留时间(min) 标准曲线1 ASP 18.172 8 y=491.9 x+29.67 R2=0.996 2 Ser 19.757 0 y=3959 x+105.1 R2=0.992 3 Glu 20.563 5 y=524.6 x+75.45 R2=0.992 4 Gly 21.529 8y=1123 x+129.5 R2=0.995 5 His 22.034 5 y=1522 x+139.1 R2=0.996 6 Arg 24.265 8 y=1122 x+121.2 R2=0.995 7 Thr 24.598 3 y=1539 x+138.2 R2=0.994 8 Ala 25.599 0 y=1002 x+194.6 R2=0.984 9 Pro 27.535 7y=1863 x+167.9 R2=0.983 10 cys 31.829 7 y=1504 x+107.9 R2=0.999 11 Tyr 32.404 8 y=1932 x+179.9 R2=0.995 12 Val 33.538 3 y=1483 x+357.2 R2=0.998 13 Met 34.373 3 y=1676 x+220.7 R2=0.996 14 lys 36.647 0 y=1487 x+408.9 R2=0.996 15 He 36.807 7 y=4500 x-42.5 R2=0.999 16 leu 37.015 5 y=4382 x+18.77 R2=0.996 17 Phe 37.624 0 y=2317 x+1168 R2=0.999对氨基酸混合液标准图谱进行积分处理后,以各氨基酸浓度(mg/L)为横坐标,响应值为纵坐标,绘制标准曲线,其对应的线性回归方程如表2所示.由表2中各氨基酸回归方程可知,方程线性关系良好.2.3 样品中游离氨基酸色谱图分析将纯化后的样品经0.45μm的滤膜过滤,与AQC反应衍生后,经高效液相色谱仪分析样品中所含游离氨基酸,其色谱图如图2所示.图2 样品中游离氨基酸色谱图2.4 样品中游离氨基酸种类及含量分析根据图2所测结果,将样品峰保留时间与混合液标准曲线中各氨基酸的保留时间相对应,并带入回归方程进行计算,确定样品中所含游离氨基酸种类及含量,其分析结果如表3所示.表3 样品中游离氨基酸种类及含量氨基酸序号各氨基酸名称含量(μmol/g)9天冬氨酸(Asp) 2.3±0.031 10 组氨酸(His) 3.6±0.064 11 苏氨酸(Thr)2.5±0.036 12 丙氨酸(Ala) 22.7±0.158 13 蛋氨酸(Met) 22.2±0.291 14 赖氨酸(Lys) 57.0±0.739 15 异亮氨酸(He) 11.1±0.051 16 亮氨酸(Leu) 8.1±0.067 17 苯丙氨酸(Phe) 347.6±8.052由表3可知,经AQC反应衍生后,用高效液相色谱法分析黑大麦纯化样品,共检出9种游离氨基酸,分别为天冬氨酸(Asp)、组氨酸 (His)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe),含量依次为2.3±0.031、3.6 ±0.064、2.5 ±0.036、22.7±0.158、22.2±0.291、57.0±0.739、11.1±0.051、8.1±0.067、347.6±8.052μmol/g,各氨基酸含量差异较大,其中天冬氨酸含量最低(2.3±0.031μmol/g),苯丙氨酸的含量最高(347.6±8.052μmol/g),占氨基酸总量的46.67%.3 讨论3.1 检测样品的衍生问题衍生过程是整个检测方法的关键.衍生剂的加入量要适当,过少则衍生不完全,过量则AQC水解为AMQ,在检测时会形成一个很大的试剂峰影响检测,且浪费昂贵的试剂[6].此外,还应注意样品必须与衍生剂均匀混合,最好在样品涡旋状态下迅速加入衍生剂,不要等到衍生剂全加完后再涡旋混合.反应试剂混合不均匀可能使衍生剂在还未与全部样品作用时即发生水解而影响检测效果.3.2 pH值对检测结果的影响AccQ柱前衍生法分析氨基酸含量,是通过反相色谱柱分离氨基酸衍生物从而达到检测氨基酸的目的,经适当有机溶剂的梯度洗脱可以同时将总游离氨基酸分离开来[7].因此流动相pH值对分离效果影响很大,每次配备流动相时,都必须用p H计准确控制校准p H值,本实验的p H值应控制在6.8左右.3.3 其他因素对检测结果的影响为避免基线漂移和出现杂峰,每次注射10针后运行一次空白梯度,并用流动相冲洗柱子.因为氧会破坏氨基酸,所以高温水解前最好抽真空或是充氮气以排除氧气的干扰.另外,高压微波溶样可以显著提高氨基酸的提取率[8].4 结论本实验结果表明,AccQ柱前衍生高效液相色谱法具有简便、选择性好、灵敏度高、分离速度快等优点,用此法检测分析样品中氨基酸的含量,其衍生物稳定时间长,代表性好.因此,此方法也适用于黑大麦中游离氨基酸的测定,在黑大麦的开发与利用以及质量控制方面具有很好的应用前景.参考文献:[1]杜连起,李润丰.黑大麦营养价值及其开发利用[J].粮食与油脂,2001,(2):40-41.[2]谢航,张声华.邻苯二甲醛-尿素柱前衍生高效液相色谱法快速检测枸杞中牛磺酸[J].色谱,1997,15(1):54-56.[3]刘媛,谢孟峡.FMOC—C1为柱前衍生化试剂对氨基酸的RP-HPLC定量分析方法的研究[J].现代仪器,1999,6:14-17.[4]肖协忠.烟草化学[M].北京:中国农业出版社,1997.25-30.[5]L IUH 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