Waters AccqTag 方法

AccQ—Tag法测定依替巴肽的氨基酸比值目的：建立反相色谱法测定依替巴肽的氨基酸比值。

方法：采用以6- 氨基喹啉- N- 羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC）與各氨基酸柱前定量衍生后，经反相色谱测定。

结果：在范围内各氨基酸的线性关系良好，精密度，溶液稳定性，回收率均良好。

结论：该方法准确可靠，重现性好，易于操作，可用于依替巴肽中氨基酸组成的测定。

标签：AccQ- Tag；依替巴肽；氨基酸比值ABSTRACT OBJECTIVE：To establish an HPLC method for determination of Amino acid ratio in eptifibatide . METHODS：the 6-amino decoquinate-N-hydroxyl succinyl imide formicether （AQC）was taken as the derivative reagent to make for the column quantitative derivatization with each amino acid and then to elute by Reverse phase chromatography.RESULTS：Good linearities were obtained for all amino acids.The method showed high selectivity，good repeatability，accuracy and stability . CONCLUSION：The method is simple and rapid and it is applicable for determination of Amino acid ratio in eptifibatide.KEY WORDS AccQ- Tag；ptifibatide；Amino acid ratio；氨基酸比值测定是多肽药物质量控制的重要环节，也是多肽原料药质量标准的重要组成部分，通过测定多肽药物的氨基酸理论个数比，从侧面佐证多肽的结构。

目录I. II. III.IV. 入门指南 a.处理要求b.为氨基酸分析设置自动移液平台c.准备Tecan Freedom EVO 100/4d.试剂制备e.校准品、质量控制标准品、内标和 AccQ•Tag 复溶说明f.试剂布局g.样品分发和条形码h.执行自动样品制备脚本V. 推荐的分析方法VI. 工作流程概述VII.订购信息I. 简介收货后请核对试剂盒清单，如果包装被打开、损坏，内容物缺失或超出有效期，请勿使用本产品。

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Waters Kairos 氨基酸试剂盒 - 自动Waters AccQ•Tag 试剂。

NNO NH OOO简介保存和稳定性使用Kairos氨基酸分析试剂盒a.Kairos 氨基酸LC 分析方法b.Kairos 氨基酸MS 分析方法非常感谢您购买Waters™ Kairos™氨基酸试剂盒，此试剂盒仅供研究使用。

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本文中的方法已经使用AccQ•Tag™衍生化试剂、ACQUITY™ UPLC™ I-Class PLUS 系统、Xevo™ TQ-S micro 和ACQUITY QDa™质谱检测器进行了验证，但我们仍建议您根据具体样品优化分析条件并确认分析结果是否准确，尤其是当样品不完全符合工作站及脚本要求时。

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AccQ-Tag法测定田参氨基酸胶囊中的氨基酸含量陈　华(广东省药品检验所,广州510180) 摘　要　以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(A Q C)为衍生剂,与田参氨基酸胶囊中的氨基酸柱前定量衍生,用W ater s HPL C仪,P ico.T ag柱,以140mmo l/L的醋酸钠溶液(pH4.95)为溶剂A,乙腈-水(3∶2)为溶剂B,进行梯度洗脱,于248nm测定十种氨基酸,方法简便,结果满意。

关键词　A ccQ-T ag法;田参氨基酸胶囊;氨基酸;6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯中图号　R927.2 田参氨基酸胶囊是采用中国名贵药材人参、田七与日本进口的十种结晶氨基酸运用现代先进工艺技术研制而成。

临床实践证明,田参氨基酸胶囊对肿瘤病人有扶正驱邪的功效。

目前,其质量标准载于《广东省药品标准》(粤Q/WS-2628-96),其“含量测定”项目是规定测定总氮含量。

现认为药品生产时以氨基酸投料,应测定其中十种氨基酸各自含量更严谨,对控制产品质量意义重大,故建议改测总氮量为测十种氨基酸含量。

目前常用的氨基酸测量法,如异硫氰酸苯酯(P IT C)法、邻苯二甲醛(O PA)法等,操作繁琐。

现参考文献[1、2],用A ccQ-T ag法测定,简便快速,能完全分离样品中十种氨基酸,重现性好,灵敏度高。

1　材料和方法1.1　药品和试剂盐酸精氨酸、亮氨酸、盐酸组氨酸、异亮氨酸、盐酸赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸对照品(日本味之素);6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯、简称A Q C(W ater s公司);田参氨基酸胶囊(广东火星制药厂);乙腈(色谱级),其他试剂均为A R级。

1.2　仪器及色谱条件仪器条件:W ater s2010色谱工作站,Wa ters510泵,Wat ers996检测器。

色谱条件:色谱柱Pico-T ag 柱,3.9m m×150mm,4 m;柱温37℃;检测波长248nm;进样量5 l;流速1.0ml/min梯度洗脱。

AccQ-Tag法测氨基酸含量1.所需设备及试剂1.1.设备：a.天平（精度O.1mg）；b.PH计（精度O.O1级）；c.单标线吸管（50m1）；d.容量瓶（500m1）；e.溶剂过滤器及滤膜（0.45I Jm）；f.试管（1.5x15cm,1.5×IOcm）;g.样品管（6x50mm）；h.微量进样器（10μ1）;1.微量可调移液器（20μ1,100μ1,1000μ1）及吸头；j.旋涡混匀器；k.烘箱（55℃）；1.HP1C系统及AccQ-Tag柱。

1.2.试剂：a.超纯水（＞18MΩ∙cm）;b.乙月青（HP1C级）；c.WatersAccQ-Tag流动相A浓液d.WaterS氨基酸水解液标准（H）；c.WaterSACCQ-F1uor试剂盒（包括硼酸缓冲液1、衍生剂粉2A、稀释液2B）。

2.流动相A制备：吸取50m1WatersAccQ-Tag流动相A浓液，放至500m1容量瓶中，加超纯水至刻度，用0.45μm滤膜过滤后备用。

3.衍生3.1.标定标准制备3.1.1.ImmO1/1色氨酸标准液：称取色氨酸（生化试剂）20.4mg,加超纯水溶解至Ioom1。

3.1.2.含色氨酸的标定标准：取1支WaterS氨基酸水解液标准，打开后吸取1m1,放至一支干净的1.5x15Cm试管中，加2.5m1色氨酸标准液，6.5m1超纯水，旋涡混匀，每支EPPendorf管分装ImI备用。

（此标准含有的色氨酸的浓度与其它氨基酸一样，为0.25mmo1∕10）3.1.3.10倍稀释后的标准可在-20C保存1个月。

剩余的氨基酸水解液标准可在-20℃保存3个月。

未启封的氨基酸水解液标准可在4℃保存1年。

使用-2（）℃保存的标准应充分解冻并混匀。

32衍生试剂制备1.1.1.将烘箱预热至55土1℃；1.1.2.取一瓶衍生剂粉2A,轻轻敲动以确保打开前所有粉末落在瓶底；1.1.3.吸取ImI稀释液2B并弃去以冲洗一个干净的微量移液吸头；（警告：稀释液2B为乙精，可燃且有毒，参考安全数据表。

茶氨酸的研究进展相关专题：添加剂时间：2012-04-12 12:29 来源：中国资讯网【阿里巴巴化工】茶氨酸是茶叶的特征氨基酸。

大量研究表明,茶氨酸的含量不仅对茶叶的品质有很大的影响,而且具有促进大脑功能和神经的生长、抗肿瘤、降压安神等功效。

本文综述了近十余年来国内外在茶氨酸的形成、积累、测定、制备及应用方面的研究进展。

1 引言至今为止人们在茶叶中已发现25种氨基酸。

其中茶氨酸约占氨基酸总量的50%。

大多数学者认为茶氨酸是茶叶的特征氨基酸,因为到目前为止除了在茶梅、山茶、油茶、簟等四种天然植物中检测出其微量存在外,其他植物中尚未发现。

茶氨酸(theanine)是1950年日本学者酒户弥二郎首次从绿茶中分离并命名的,它属酰胺类化合物,化学命名:Ｎ乙基Ｌ谷氨酰胺,结构式:ＨＯＣＯＣＨＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ3。

自然存在的茶氨酸均为Ｌ型,纯品为白色针状结晶,熔点217～218℃(分解),比旋光度[α]20Ｄ=0 7°,极易溶于水,水解度呈微酸性,有焦糖香及类似味精的鲜爽味,研究证明它的含量与绿茶的品质密切相关,相关系数为0 787～0 876[1]。

2 茶叶中茶氨酸研究进展作为茶叶的特征氨基酸,茶氨酸几乎存在于茶树的所有器官和组织中。

经大量研究表明,茶氨酸在茶树的根部形成,然后向新梢积聚,因而茶树新梢中茶氨酸含量最高。

茶氨酸的形成是茶树储存氮的手段之一,这是因为茶氨酸被茶氨酸水解酶水解为谷氨酸和乙胺,乙胺在胺氧化酶的作用下产生氨和乙醛,氨可作为氮源供茶树的幼龄组织生长,因此茶氨酸是茶树幼芽光合作用开始前有机碳骨架合成的起始物,而且也是茶树中多酚类物质的重要前体。

茶氨酸在茶树中的积累与光照、温度和合成前体密切相关。

研究发现当温度为25℃,黑暗条件下,在培养基中加入盐酸乙胺能明显增加茶氨酸的积累。

1992年我国学者李荣林等对茶树新梢中茶氨酸的分布情况及其在不同季节、不同品种和不同栽培条件下含量的变化作了较全面的研究[2]。

应用AccQ柱前衍生高效液相色谱法检测黑大麦中的游离氨基酸申晓蓉;陈士恩;郭鹏辉;李占虎;李绪伦;韩霁光;李振明;王娟妮【摘要】Objective： AccQ- Tag methods used in this paper, derivatized with 6- arninoquinolyl- N- hydroxysuccinimidyl carbauiate （AQC） as the reagent, isolated and tested samples of black barley types and levels of free amino acids. The results show that： in the detection of nine free amino acids, the lowest was Asp（2.3±0. 031μmol/g）, and the highest was phe（347.6 ±8. 052μmol/g） which is 46.67% of total amino acids, And the amino acid concentration and peak area showed a good linear relationship between higher stability; This method is simple, accurate and reliable, high sensitivity, it can be used prospectly in the development and use and quality control of the black Barley.%采用AccQ柱前衍生高效液相色谱法，以6-氨基喳啉-N-羟基琥珀酰亚胺基．氮基甲酸酯（AQC）为衍生试剂。

分离并检测了黑大麦样品中游离氨基酸种类及其含量．结果表明：在检测出的9中游离氨基酸中，天冬氨馥含量最低（2．3±0．031μmol／g），苯丙氨酸的含量最高（347．6±8．052μmol／g）；占氨基酸总量的46．67％，且氨基酸浓度与峰面积呈良好的线性关系．此方法稳定性较高，操作简单，准确可靠，具有较高的灵敏度，在黑大麦的开发与利用以及质量控制方面具有很好的应用前景．【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)003【总页数】5页(P65-69)【关键词】6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯（AQC）;黑大麦;游离氨基酸【作者】申晓蓉;陈士恩;郭鹏辉;李占虎;李绪伦;韩霁光;李振明;王娟妮【作者单位】西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200;甘肃省宁县畜牧局,甘肃庆阳745200【正文语种】中文【中图分类】TQ421.381黑大麦具有能促进人体健康长寿的合理食物结构,属于“三高一低”作物,即高蛋白、高维生素、高纤维素,低脂肪、低糖;同时也富含钙、铁、锌、硒等多种微量元素,其综合指标均高于小麦、玉米、水稻和燕麦等,营养全面而独特,具有极高的营养价值[1].AccQ-Tag分析方法是Waters公司开发的测定氨基酸的方法[2～4],本文以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC)为衍生试剂,对黑大麦中的游离氨基酸进行了分离测定,旨在建立一套可靠、快速、分离效果好、灵敏度高、定量准确的黑大麦中游离氨基酸含量的测定方法,以期对黑大麦的开发与利用以及质量控制提供理论参考和技术支持.1 材料与方法1.1 试验材料黑大麦,采自甘肃省宁县.1.2 试验仪器与试剂高效液相色谱仪:(VARIAN PROSTAR 800/363/240/);色谱柱:AccQ-Tag TM柱(美国Waters公司);真空抽滤装置、旋转蒸发器;60 cm×45 mm分离柱,95%乙醇,0.1%醋酸铅,10%三氯乙酸,10%乙酸,1%NaCl,乙醚;乙腈,四氢呋喃,AQC荧光衍生剂,732强酸性阳离子交换树脂,1 mol/L茚三酮溶液.1.3 试剂配置1.3.1 流动相A液的配置采用美国Waters公司提供的硼酸缓冲液,用前取400 mL硼酸缓冲液加高纯水600 m L混匀,超声脱气30 m in.1.3.2 流动相B液流动相B液(稀释乙腈)的配置,由美国Waters公司提供,用前取100 m L乙腈贮备液加纯水900 mL及90μL四氢呋喃混匀,超声脱气30 min.1.3.3 AQC衍生试剂的配置吸取lmL乙睛加入装有衍生剂粉末的瓶中,震荡10 s,放入烘箱,55℃加热10 min 直至粉末完全熔化,即得AQC衍生试剂.1.3.4 标准溶液的配置移取40μL250 mmo1/L的氨基酸混合标准溶液(含17种氨基酸),加入40μL 250 mmo1/L内标物,用高纯水稀释至不同浓度,于4℃冰箱中保存备用.1.4 实验方法1.4.1 样品预处理从宁县随机采取36份黑大麦样品,每份1.5 kg,用纸袋包装备用.每份黑大麦样品试验时充分混匀,精密称取样品5 g,在冰浴条件下加入10 mL10%乙酸完全研碎,转移至250 mL三角瓶中,加入10%三氯乙酸10 m L、10%乙酸10 m L、0.1%的醋酸铅5 m L、95%的乙醇10 m L,沉淀过滤,冰箱4℃保存.24 h后取出经沉淀脱糖去除有机物,真空抽滤去掉固体物质,留滤液,脱脂,24 h后过滤沉淀,最后在40℃条件下旋转蒸发至2 m L备用.1.4.2 样品纯化将制备好的2 mL样液,置于处理过的732强酸性阳离子树脂柱中,再加5 mL去离子水,待液体通过树脂后加50 m L 2 mol/L NH4OH,然后用50 m L去离子水洗涤,将洗涤液收集在自动收集器的180根小试管内,用1 mol/L的茚三酮进行各个收集管的显色反应,收集在滤纸上与茚三酮反映出现紫红色的试管中的液体,用去离子水定容至25 m L,备用.1.4.3 样品的衍生化将纯化后的样品经0.45μm的滤膜过滤,去除的杂质,与AQC荧光试剂充分混合,室温静置10 min,待测.1.4.4 色谱仪条件色谱柱:AccQ-Tag TM柱(美国Waters公司).流动相A:硼酸缓冲液;流动相B:乙腈;流动相C:超纯水,柱温35℃,进样量10μL,梯度洗脱条件如表1所示[5].表1 流动梯度洗脱条件时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速mL/min 0 100 0 1 17 91 9 1 24 80 20 1 32 68 32 1 34 68 32 1 35 0 100 1 37 0 100 1 38 100 0 1 45 100 0 12 结果2.1 标准氨基酸衍生物色谱图图1 标准氨基酸衍生物色谱图将氨基酸标准液稀释成5个浓度后,经AQC衍生后采用氨基酸自动分析仪分析检测(进样量为20 μL),得到氨基酸混合液标准分析图谱(图1,横坐标为氨基酸保留时间,纵坐标为响应值).由图1可知,17种标准氨基酸的排列顺序依次为(从左到右):天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(A rg) 、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(lle)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe).其图谱清晰、分辨率高、操作简单.2.2 标准氨基酸回归方程分析表2 氨基酸混合液标准曲线序号氨基酸(μLmol/mL) 保留时间(min) 标准曲线1 ASP 18.172 8 y=491.9 x+29.67 R2=0.996 2 Ser 19.757 0 y=3959 x+105.1 R2=0.992 3 Glu 20.563 5 y=524.6 x+75.45 R2=0.992 4 Gly 21.529 8y=1123 x+129.5 R2=0.995 5 His 22.034 5 y=1522 x+139.1 R2=0.996 6 Arg 24.265 8 y=1122 x+121.2 R2=0.995 7 Thr 24.598 3 y=1539 x+138.2 R2=0.994 8 Ala 25.599 0 y=1002 x+194.6 R2=0.984 9 Pro 27.535 7y=1863 x+167.9 R2=0.983 10 cys 31.829 7 y=1504 x+107.9 R2=0.999 11 Tyr 32.404 8 y=1932 x+179.9 R2=0.995 12 Val 33.538 3 y=1483 x+357.2 R2=0.998 13 Met 34.373 3 y=1676 x+220.7 R2=0.996 14 lys 36.647 0 y=1487 x+408.9 R2=0.996 15 He 36.807 7 y=4500 x-42.5 R2=0.999 16 leu 37.015 5 y=4382 x+18.77 R2=0.996 17 Phe 37.624 0 y=2317 x+1168 R2=0.999对氨基酸混合液标准图谱进行积分处理后,以各氨基酸浓度(mg/L)为横坐标,响应值为纵坐标,绘制标准曲线,其对应的线性回归方程如表2所示.由表2中各氨基酸回归方程可知,方程线性关系良好.2.3 样品中游离氨基酸色谱图分析将纯化后的样品经0.45μm的滤膜过滤,与AQC反应衍生后,经高效液相色谱仪分析样品中所含游离氨基酸,其色谱图如图2所示.图2 样品中游离氨基酸色谱图2.4 样品中游离氨基酸种类及含量分析根据图2所测结果,将样品峰保留时间与混合液标准曲线中各氨基酸的保留时间相对应,并带入回归方程进行计算,确定样品中所含游离氨基酸种类及含量,其分析结果如表3所示.表3 样品中游离氨基酸种类及含量氨基酸序号各氨基酸名称含量(μmol/g)9天冬氨酸(Asp) 2.3±0.031 10 组氨酸(His) 3.6±0.064 11 苏氨酸(Thr)2.5±0.036 12 丙氨酸(Ala) 22.7±0.158 13 蛋氨酸(Met) 22.2±0.291 14 赖氨酸(Lys) 57.0±0.739 15 异亮氨酸(He) 11.1±0.051 16 亮氨酸(Leu) 8.1±0.067 17 苯丙氨酸(Phe) 347.6±8.052由表3可知,经AQC反应衍生后,用高效液相色谱法分析黑大麦纯化样品,共检出9种游离氨基酸,分别为天冬氨酸(Asp)、组氨酸 (His)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(He)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe),含量依次为2.3±0.031、3.6 ±0.064、2.5 ±0.036、22.7±0.158、22.2±0.291、57.0±0.739、11.1±0.051、8.1±0.067、347.6±8.052μmol/g,各氨基酸含量差异较大,其中天冬氨酸含量最低(2.3±0.031μmol/g),苯丙氨酸的含量最高(347.6±8.052μmol/g),占氨基酸总量的46.67%.3 讨论3.1 检测样品的衍生问题衍生过程是整个检测方法的关键.衍生剂的加入量要适当,过少则衍生不完全,过量则AQC水解为AMQ,在检测时会形成一个很大的试剂峰影响检测,且浪费昂贵的试剂[6].此外,还应注意样品必须与衍生剂均匀混合,最好在样品涡旋状态下迅速加入衍生剂,不要等到衍生剂全加完后再涡旋混合.反应试剂混合不均匀可能使衍生剂在还未与全部样品作用时即发生水解而影响检测效果.3.2 pH值对检测结果的影响AccQ柱前衍生法分析氨基酸含量,是通过反相色谱柱分离氨基酸衍生物从而达到检测氨基酸的目的,经适当有机溶剂的梯度洗脱可以同时将总游离氨基酸分离开来[7].因此流动相pH值对分离效果影响很大,每次配备流动相时,都必须用p H计准确控制校准p H值,本实验的p H值应控制在6.8左右.3.3 其他因素对检测结果的影响为避免基线漂移和出现杂峰,每次注射10针后运行一次空白梯度,并用流动相冲洗柱子.因为氧会破坏氨基酸,所以高温水解前最好抽真空或是充氮气以排除氧气的干扰.另外,高压微波溶样可以显著提高氨基酸的提取率[8].4 结论本实验结果表明,AccQ柱前衍生高效液相色谱法具有简便、选择性好、灵敏度高、分离速度快等优点,用此法检测分析样品中氨基酸的含量,其衍生物稳定时间长,代表性好.因此,此方法也适用于黑大麦中游离氨基酸的测定,在黑大麦的开发与利用以及质量控制方面具有很好的应用前景.参考文献:[1]杜连起,李润丰.黑大麦营养价值及其开发利用[J].粮食与油脂,2001,(2):40-41.[2]谢航,张声华.邻苯二甲醛-尿素柱前衍生高效液相色谱法快速检测枸杞中牛磺酸[J].色谱,1997,15(1):54-56.[3]刘媛,谢孟峡.FMOC—C1为柱前衍生化试剂对氨基酸的RP-HPLC定量分析方法的研究[J].现代仪器,1999,6:14-17.[4]肖协忠.烟草化学[M].北京:中国农业出版社,1997.25-30.[5]L IUH J.Determination of amino acidsby Precolumn derivatization with6-aminoquinoly 1-N-hydroxysucciniomidyl carbamate and high-performance liquid chromatography with ultrovioletdetection[J].JChromatogr,1994,670(l):59-63.[6]赵媛媛,王红,张华山.柱前衍生反相高效液相色谱分离和测定氨基酸——用N-羟基琥珀酰亚胺-α-萘乙酸酯作衍生试剂[J].分析科学学报,2000,16(3):188-191. [7]张云,孟洁.氨基酸存在形式的分布及滴定法测定的可行性[J].大学化学,2010,3:83-8.[8]谢涛,李德芳.高压微波溶样测定氨基酸[J].现代仪器,1999,4:46-47.。

Accq.Tag法应用技巧陈永波 饶　斌 覃　兰(湖北恩施南方马铃薯研究中心　445000)　(中日合资湖北峰江氨基酸有限公司　445800)摘要:Accq.Tag法是Waters公司于1994年推出的氨基酸测定方法,由于它具有衍生步骤简单,操作方便、生成的衍生物稳定等特点而得到广泛应用,本文介绍一些改善峰组分离度、定量计算及节约衍生剂用量等方面的技巧,以使用户得到最佳的分析结果与降低分析成本。

关键词:Accq.Tag法;应用技巧中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:1006-8376(2001)04-0047-03 Accq.Tag法是目前最为优秀的氨基酸测定方法,Waters Accq.Tag Fluor衍生剂(AQC,即62氨基喹啉基2N2羟基琥珀酰亚氨基酸基甲酸酯)能与所有含氨基的化合物发生快速、定量反应,过量的AQC可在1min内水解为不干扰测定的AMQ,生成的衍生物稳定,可在2690分离单元、510泵、515泵、626泵等溶剂输送系统组成的不同液相色谱系统上采用Accq.Tag专用柱、Pico.Tag专用柱或其它性能较好的C18柱分离,用萤光检测器或紫外检测器检测。

该法适应于氨基酸注射液、口服液及各种水解氨基酸样品的分析,从Milford实验室的应用报告给出了Accq.Tag法衍生的59种氨基化合物的色谱保留性质[1]中可以看出;根据所使用的色谱系统和测定样品的性质,可对流动相A的酸度、梯度、柱温等色谱条件及衍生剂的用量等作相应改变,以获得最佳分离效果和达到降低检测成本的目的。

本文以本实验室常规检测的氨基酸口服液和注射液为例,介绍了通过大量试验总结的一些经验和应用技巧,供大家参考。

1　以不同进样体积作标准曲线[2]收稿日期:2001—01—02作者简介:陈永波(1968—),男,湖北恩施南方马铃薯研究中心农艺师,主要从事分析检测技术研究。

以标准溶液的摩尔浓度为梯度做标准曲线对未知样品进行定量,是一般分析测试工作中的常规方法,即先将标样稀释成一定的浓度梯度(如0.10、0.20、0.30、0.40、0.50μmol/ml),衍生后分别进相同的体积(如8μl或10μl),如此得到的未知样品的结果是摩尔浓度,这样做的好处是可以非常直接地计算。

AccQ．Tag柱前衍生反相高效液相色谱法测定果品中氨基酸含量32分析仪器2007年第4期AccQ.Tag柱前衍生反相高效液相色谱法测定果品中氨基酸含量庞新安.万英(1.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔,8433002.塔里木大学生物技术研究开发中心,新疆阿拉尔,843300)摘要采用AccQ.Tag柱前衍生反相高效液相色谱法同时测定16种氨基酸,氨基酸浓度在2.5～20tLmol/L范围内,其峰面积和氨基酸浓度的线性相关系数均在0.999以上.用该方法测定了四种新疆特产干鲜果品中氨基酸的含量,取得了满意的结果.关键词反相高效液相色谱法氨基酸AccQ.Tag干鲜果品1前言氨基酸是组成蛋白质的基本单位,是生物体中不可缺少的营养成分之一,对促进人体生长发育具有重要作用.目前,氨基酸主要采用茚三酮柱后衍生氨基酸自动分析仪进行测定,但随着氨基酸分析技术的发展,柱前衍生反相高效液相色谱法因其通用性强,选择性好,分离度高,可用于多种物质分析等优点而广泛应用于氨基酸的分析测定_】]. AccQ.Tag方法是Waters公司专门为柱前衍生高效液相色谱法分析氨基酸而开发的新方法,其核心在于AQC(6一氨基喹啉基一N一羟基琥珀酰亚胺基一氨基甲酸酯)专利衍生剂,它能与所有含氨基的化合物发生快速,定量反应,生成高稳定性脲(其最大吸收在250nm左右),用反相高效液相色谱仪分离衍生产物,再用荧光或紫外检测器外标法定量检测衍生产物lL6].新疆独特的自然生态环境,丰富的水土光热资源以及特殊的气候地理条件孕育了众多名,优,特,稀林果资源,其特产干鲜果品的营养丰富,是人们喜爱的美食之一.氨基酸是干鲜果品中主要营养成分之一,其种类和含量是衡量干鲜果品营养质量高低的一项重要指标,在干鲜果品品质鉴定中占有重要地位.传统检测干鲜果品中氨基酸的方法(国家标准方法)为茚三酮柱后衍生法,该法需要使用氨基酸自动分析仪.本实验利用Waters公司的AccQ.Tag方法,以磷酸盐一乙腈一水为流动相,建立了新疆特产巴旦杏,无花果,沙枣,石榴中游离氨基酸含量的高效液相色谱测定方法(HPLC).同时,根据联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WH0)提出的必需氨基酸评分模式,计算了巴旦杏,无花果,沙枣,石榴中的必需氨基酸指数(EAAI),以期对巴旦杏,无花果,沙枣,石榴中氨基酸营养进行综合评价,从而为深层次地开发利用这4种干鲜果品提供科学依据.2实验部分2.1仪器与试剂Waters一2695高效液相色谱仪,配有2475荧光检测器,色谱工作站(美国Waters公司);Fw一100型高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂); VIC一412型Sartorius电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DHG一9101—2SA型电热恒温鼓风干燥箱(扬州鸿都电子有限公司);SK5200H型超声波洗涤器(上海科导超声仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);SK一1型快速混匀器(江苏金坛医疗仪器厂).AccQ.Tag氨基酸测定试剂盒(美国Waters公司):包括AccQ—Flour氨基酸专利衍生剂,专用氨基酸分析柱,玻璃样品衍生管,16种混合氨基酸标准液,其浓度均为2.5b~mol/mL;醋酸盐一磷酸基金项目:新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用点重点实验室开放课题资助项目(BR0602).作者简介:庞新安,男,1974年出生,湖南常德人,汉族,硕士,助理研究员,研究方向:现代仪器分析与农产品品质检测鉴定.E—mail:***************2007年第4期分析仪器33盐缓冲溶液;浓盐酸(AR);苯酚(AR);氢氧化钠(AR).2.2色谱条件色谱柱:WatersAccQ.Tag氨基酸分析柱(3.9mm×150mm,4”m);流速:1.0mL/min;柱温:37℃;激发波长:250nm,发射波长:395nm;进样量:1O肚L;流动相A:醋酸盐一磷酸盐缓冲溶液,按1:10用MiliQ纯水稀释;流动相B:乙腈;流动相C:MillQ纯水;梯度洗脱程序如表1所示.表1梯度洗脱程序2.3样品制备2.3～.样品的水解精确称取预先处理好的巴旦杏,无花果,沙枣,石榴样品,其中巴旦杏,无花果,沙枣为干样,而石榴为鲜样,各放入干燥洁净的安瓿瓶中,倒入适量6.0mol/L盐酸(含0.5新蒸馏的苯酚),抽真空,充高纯氮气,重复3次,迅速将充好氮气的安瓿瓶瓶口置于酒精喷灯上封口,然后置于110℃恒温干燥箱中水解24h,取出水解液过滤并多次冲洗水解管,其滤液用旋转蒸发器蒸止近干,再用0.01mol/L的盐酸溶液溶解稀释后定容到一定体积,备用.2.3.2氨基酸标样与待测样品的衍生用移液器移取2OL已稀释的氨基酸标准溶液和巴旦杏,无花果,沙枣,石榴样液于对应的干净衍生管中,各加入7OL硼酸盐缓冲液,涡旋混和,在涡旋状态下各加入1OL刚配好的AccQ—FlourTM 衍生剂,并保持涡旋混匀1O～20S.在室温下放置1min,用石蜡膜封口,于55℃烘箱内加热10min,取出冷却至室温,供氨基酸分析用.3结果与讨论3.1氨基酸标样工作曲线将氨基酸标准液配制成浓度分别为2.5,5.0,1O,15,20~mol/L的溶液,每一标准液各取1O肚L 按2.3.2项衍生后进行测定,以氨基酸溶液浓度(C,~mol/L)为横坐标(X),以峰面积/内标面积(A,V?s)为纵坐标(Y)绘制氨基酸的标准工作曲线,利用峰面积与浓度进行线性回归.同时,按照2.2项色谱条件对浓度为10~mol/L氨基酸标准溶液平行测定5次进行精密度试验,计算相对标准偏差(RSD),并以3倍噪声(S/N一3)计算检出限.16种氨基酸标样的回归方程,相关系数,线性范围,RSD,最小检出限如表2所示.表2氨基酸标准工作曲线序号氨基酸回归方程相关系数m性.范l/暑(R%SD)篆墨序号晰程数mol/暑㈤RSD嚣IAspA=1550000C+115000.9999542.5—200.8271.9829ProA=2570000 C~448000.9999112.5~201.1564.0162SerA=3500000C+481000.9999582.5~200.7952.90210TyrA=4120O0 OC+2470OO0.9998672.5~20I.41121.7263GluA=1580000C~53400.9999552.5~200.8200.99811V a1A=7670O0O C+150O0O0.9999042.5~201.2034.5844G1vA=4O70O0OC+5990O0.9998512.5~20I.4922.21412MetA=6180 O0OC+750OO0.9999812.5~200.5383.6215HisA=4340000C~419000.9999712.5~200.6572.99713LysA=1590000 C~479000.9999042.5~20I.2O18.7976ArgA:3O70O0OC+1140OO0.9998472.5~20I.24512.95214IleA:940O 0OOC+2290OO0.9999202.5~201.0966.3937TllrA=5O80O0OC+230O0O0.9998592.5—2O1.45510.79415LeuA:8 960000C~1770000.9999652.5~200.7195.1848AlaA=5470000C~1170000.9999472.5~200.8953.81616PheA=1O70O 0OOC+330O0O0.9999172.5~201.11810.190注:Asp(天冬氨酸)Ser(丝氨酸)Glu(谷氨酸)Gly(甘氨酸)His(组氨酸)Arg(精氨酸)Thr(苏氨酸)Ala(丙氨酸)Pro(脯氨酸)Tyr(酪氨酸)V al(缬氨酸)Met(蛋氨酸)Lys(赖氨酸)Ile(异亮氨酸)Leu(亮氨酸)Phe(苯丙氨酸)34分析仪器2007年第4期结果表明,在一定浓度范围内,内标峰面积与氨基酸浓度线性关系良好,其相关系数为0.9998～0.9999,可以作为定量分析依据.同时,16种氨基酸标样的RSD均小于2,表明HPLC具有较好的精密度,荧光检测器的最小检出限为0.998～21.726t~g/L,符合国家标准要求.3.2氨基酸标样的HPLC分析标准氨基酸的分析色谱图如图1所示.图116种氨基酸标准溶液的色谱图1.天冬氨酸2.丝氨酸3.谷氨酸4.甘氨酸5.组氨酸6.精氨酸7.苏氨酸8.丙氨酸9.脯氨酸1O.酪氨酸11.缬氨酸12.蛋氨酸13.赖氨酸14.异亮氨酸15.亮氨酸16.苯丙氨酸3.3果品样品中氨基酸的HPLC分析巴旦杏,无花果,沙枣,石榴4种干鲜果品样品中各种氨基酸含量测定结果如表3所示.由表可知,4种干鲜果品样品中富含16种氨基酸,氨基酸总量为0.06%～12.44,其中8种必需氨基酸含量为0.05～5.25%,占总氨基酸含量的42.21%～82.78,高于FAO/WH0必需氨基酸评分模式的标准(36%),而与鸡蛋蛋白相当,因此具有较高的营养价值.同时,依据必需氨基酸指数计算公式:EAAI一[(Thrp/Thr)×(Tyrp/Tyr)×(V al/V al)×(Metp/Met)×(Lysp/Lys)×(Ilep/Ile.)×(Leup/Leu)×(Phe/Phe)]×100(式中为受验蛋白,为参考蛋白)计算的结果得知,4种干鲜果品样品中各种氨基酸含量合理,适宜人体吸收利用.果品样品(巴旦杏)中16种氨基酸的分析色谱图如图2所示.表3四种干鲜果品样品中氨基酸组成分析结果I号保留时间含量()保留时间含量()(min)巴旦杏无花果沙枣石榴孙暾(min)巴旦杏无花果沙枣石榴1Asp13.804～13.8370.8460.1450.5280.001411Va128.415～28.4360.4630.0660.0710.0032Ser15.293～15.3300.5810.1230.1850.001312Met28.924～29.5560.00980.00130.00680.00033Glu15.946～15.9812.1410.1890.3670.001513Lys31.722～31.7290.1990.0970.1340.00184Gly17.056～17.2720.7190.102未检出0.00114Ile32.430～32.4532.3272.1372.2940.0395His17.3OO～17.7950.4160.0660.1140.000315Leu33.044～33.0760.6420.0760.0800.00246Arg21.61O～21.63O1.7030.1590.224O.OO416Phe34.374～34.384O.8270.0680.0813O.OO147Thr21.945～21.9630.4770.0650.1190.003氨基酸总量()12.443.554.980.068Ala22.601～22.6060.3910.0670.1560.0004必需氨基酸()5.252.512.920.059Pro23.827～23.9500.3920.1810.4860.0009必需氨基酸/氨基酸总量()42.2170.8958.6482.7810Tyr27.221～27.2440.3070.0030.1340.001必需氨基酸指数(EAAI)52.1231.48—73.25一…注:为必需氨基酸;参考蛋白(鸡蛋);…参考蛋白(牛乳);…石榴为鲜样,无可比性2007年第4期分析仪器354结论图2果品样品(巴旦杏)中氨基酸分析色谱图1.天冬氨酸2.丝氨酸3.谷氨酸4.甘氨酸5.组氨酸6.精氨酸7.苏氨酸8.丙氨酸9.脯氨酸1O.酪氨酸11.缬氨酸12.蛋氨酸13.赖氨酸14.异亮氨酸15.亮氨酸16.苯丙氨酸利用AccQ.Tag柱前衍生反相高效液相色谱法测定了新疆特产巴旦杏,无花果,沙枣,石榴中游离氨基酸的含量,结果4种干鲜果品样品中富含16种氨基酸,其氨基酸配比合理,适宜人体吸收利用.该方法的线性范围比较宽,相关系数在0.9998～0.9999之间,RSD均小于2,其检出限符合国家标准要求,在40rain内完成待测样品中16种氨基酸的测定.实验证明,AccQ.Tag柱前衍生反相高效液相色谱法具有简便,快速,经济,灵敏度高,精密度好,准确度好的优点,可以满足巴旦杏,无花果,沙枣,石榴样品中氨基酸分析的要求,对其他果品中氨基酸的分析也具有一定的参考价值.参考文献1侯松嵋,孙敬,何红波,张旭东,王颜红.分析化学,2006,34(10):1395—14002吴光斌,陈发河.仲恺农业技术学院,2006,19(3):26—3O3姜曼花,邱细敏.湖南师范大学(医学版),2006,3(3):34—454瞿其曙,汤晓庆,胡效亚,李寿椿.化学进展,2006,18(6):789—7935刘惠文.氨基酸和生物资源,1995,17(2):50—556卢珍华,郭彩华.食品科学,2006,27(2):238—2417王天成,孙磊,宋为明,李学佩,寇丽筠.现代检验医学杂志,2006,21(6):18—208陈永波,饶斌,覃兰.氨基酸和生物资源,?/301,23(4):47—49收稿日期:2007—05—18 DeterminationofaminoacidsinfruitsbyAccQ.Tagpre-columnderivatizatio nreversedphaseHPLC.PangXinan,WanYing(1.KeyLaboratoryforProtectionandUtilization0厂BiologicalResourcesinTarimBasin,XinjiangProduction&ConstructionCorps,Alar,Xinjia ng,843300;2.Biological TechnologyResearchandDevelopmentCenter,TarimUniversity,Alar,Xinj iang,843300) SixteenaminoacidsweredeterminedbyAccQ.Tagpre—columnderivatizationreversedphasehighper—formanceliquidchromatography.Thelinearcorrelationcoefficientbetween peakareaandconcentrationofaminoacidsintherangeof2.5～2O/~mol/Lwas>O.999.Themethodhasbeenappliedtotheanalysisof fourdryandfreshfruitsofXinjiangwithgoodresults.。

什么是氨基酸?–从化学角度上讲,氨基酸是在分子结构中既带有氨基(-)又带有羧基(-COOH)的一类有机化合物NH2–从生命科学角度来讲,氨基酸是组成蛋白质的基本单元.氨基酸通过氨基和羧基形成肽键(酰胺键)相互联结成多肽和蛋白质H 3N CH CH 3C O N H CH C O CH 2OHOH+H 3N CH CH 3COH O +CH C OCH 2OHOHH 3N H 2O,H +++heat两个氨基酸二肽复杂分析问题–分离o性质的宽泛性o峰对间微小差异o宽范围的基质–检测o无发色团o宽浓度范围多数氨基酸没有“显色基团”–无法用简单的方法检测所有的氨基酸极性都很大,无法反相分离需要进行处理需要进行处理：：“衍生”–增加显色基团增加显色基团，，提高检测灵敏度–改变样品的极性改变样品的极性，，改变分离模式−+COO H N RCH )(3所谓化学衍生,就是选取某种化学试剂与氨基酸进行化学反应,生成一种较易于被检测的新物质生成一种较易于被检测的新物质。

用来与氨基酸反应的试剂叫衍生试剂,例如例如：：A + R →D氨基酸衍生试剂衍生产物衍生反应可发生在色谱分离之前(柱前衍生),也可发生在色谱分离之后(柱后衍生) 柱前衍生法的分离一般在反相柱(如C18)上完成,而柱后衍生法的分离一般在阳离子交换柱上进行生法的分离一般在阳离子交换柱上进行。

柱后法的典型代表为氨基酸分析仪,而AccQ·Tag 为典型的柱前法提高检测的灵敏度–增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度–增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性–改变组份的基团改变组份的基团，，如：o 变离子型化合物为非离子型变离子型化合物为非离子型，，以便用反相方法分离柱后衍生–最常见的是离子交换法后用茚三酮或OPA 衍生–反相HPLC 无需衍生用ESI-MS检测–脉冲安培检测器柱前衍生–许多的试剂被成功地使用; 有一些已经商业化–加上紫外或是荧光的可检测性–改进的色谱技术–通常更快且具有更高的灵敏度–成功的使用需要一些注意事项离子交换–氨基酸分析的通常方法–实际的运行时间大约45-60分钟 反相HPLC/UPLC 衍生氨基酸–最好的分离选择性–最高的灵敏度–最短的分析时间AccQ·Tag方法是一种用于肽及蛋白质水解氨基酸分析的柱前衍生技术AccQ·Tag方法的内容包括:–用Waters的AQC衍生试剂衍生氨基酸–用反相HPLC/UPLC分离衍生产物–用荧光或紫外检测器定量检测衍生产物在AccQ-Tag™衍生剂的基础上建立的方法–公认的化学品–充分理解对于反应的控制–简单的操作适于成批衍生在ACQUITY UPLC™系统上建立的方法–最高的分离度–良好控制的色谱柱化学–公认有效的仪器方法在Empower 软件上建立的方法–具备完全的法规依从性–方法模板–自定义计算ACQUITY UPLC TUV ACQUITY UPLC PDA ACQUITY UPLC FLRACQUITY UPLC CMMasslynx V4.1UPLC/MS衍生用:–涡旋搅拌器–微量移液器(1-100µl)–烘箱(可恒温至55℃)配制流动相用:–超声波清洗器–溶剂过滤装置–100ml和1000ml量筒–500ml或1000ml烧杯–纯水器(可制备18MΩ无有机污染物之高纯水)–选项选项：：pH计(精确到0.01)一套Waters AccQ·Tag化学组件包,包括:–AccQ·Tag TM Ultra Derivitization Kit-含有下述三种试剂各5瓶∶o AccQ·Tag TM Ultra 硼酸缓冲液(1)o AccQ·Tag TM Ultra 衍生剂粉末(2A)溶剂（（2B）o AccQ·Tag TM Ultra 溶剂–AccQ·Tag TM Ultra 1.7um 2.1*100mm氨基酸分析柱–AccQ·Tag Ultra Eluent A浓液—一种预混合好的浓缓冲液–AccQ·Tag Ultra Eluent B液—一种预混合好的洗脱液–氨基酸水解标样—10×1ml安瓿瓶装水解氨基酸标样.每一瓶含17种水解氨基酸各2.5mM(胱氨酸为1.25mM)–6×50mm样品管—用于衍生样品和标样–Total Recovery Vials--UPLC 进样器用全回收样品瓶内标物:–α－氨基丁酸(AABA)–正缬氨酸(NVAL)测柱效流动相:–MilliQ水(18MΩ高纯水)–乙腈HPLC级清洗系统所需化学品:–浓磷酸保证试剂–异丙醇（HPLC级）–甲醇（HPLC级）AccQ·Tag Ultra试剂盒中的2A瓶,装有称量好的衍生剂粉末(并经过检测确保仅含最低限度的氨基酸污染物),用1ml乙腈(2B)溶解后即得10mM 的AccQ·Tag Ultra衍生试剂AccQ·Tag Ultra衍生试剂配制方法如下衍生试剂配制方法如下∶∶1.将加热装置预热至55℃,2.在打开2A瓶之前,轻轻弹击之,确保所有的AccQ·Tag Ultra试剂粉末全落在瓶底3.由2B瓶中吸取1ml AccQ·Tag Ultra稀释剂并放掉,以清洗微量移液管4.吸取1ml AccQ·Tag Ultra稀释剂放入装有AccQ·Tag Ultra衍生剂粉末的2A瓶中,加盖密封5.涡旋震荡15秒钟后放置1分钟6.在加热装置上加热2A瓶,直至AccQ·Tag Ultra衍生剂粉末全部溶解,一般不超过30分钟即可全部溶解衍生试剂(2A粉末)可与环境中的潮气反应,故须在干燥的室温环境中存放,例如干燥器内,若用真空干燥器更好,不要置于冰箱中保存(尤其不能置于冰室内)已用乙腈溶解后的2A溶液使用时亦应注意防水,防甲醇及样品污染,最好用干燥的移液枪头吸取衍生试剂,每衍生一个样品更换一个新的移液枪头未用完的试剂亦应放在干燥器内保存,最好在一周内用完新配制的2A试剂是无色透明清液,若溶液变色或有沉淀析出,说明有部分试剂降解失效或被污染AccQ·Tag化学组件试剂包中提供17种水解氨基酸的标样,每种以外)的浓度均为2.5mM(μm/ml)氨基酸(除Cys2取40μl水解氨基酸标样置于清洁的自动进样瓶中,加入960μl 超纯水,混匀.此标样含胱氨50pmol/μl(等价于100pmol/μl 半胱氨酸),含其它各种氨基酸均为100pmol/μl定量测定时,需根据未知样的浓度,将标样稀释成不同浓度,才能得到合适的标准曲线此校正曲线用标样在－－20℃可保存一个月,剩余的水解氨基储存∶∶此校正曲线用标样在储存酸标样(密封)在－20℃可保存三个月,未开封的水解氨基酸标样安瓿瓶在4℃可保存一年样品衍生步骤过滤1.0 ml 水解液或稀释10倍的17AA标样取10 微升放入6x50mm 干燥衍生管中加入70 微升buffer1 缓冲液,涡旋混和下加入20 微升AQC衍生剂,涡旋混和15秒钟,放置1分钟样品管用石腊膜封口,放于55 ℃烘箱中加热10 分钟.(tyrosine,酪氨酸)准备进样(对于ACQUITY SM或FTN,需转移至UPLC全回收样品瓶中)衍生反应要求在pH8.0-10.0环境下进行,因此,盐酸水解样品需先除去过量盐酸(中和或干燥)按手册所规定的衍生方法,衍生试剂(2A)的加入量是过量5倍的,若加入的衍生剂量不足,会导致定量不准(氨基酸未定量转化为衍生产物)衍生试剂部分失效,会影响定量结果衍生试剂加入量不足,还会产生非单一衍生产物(如Lys,赖氨酸有两个氨基,会出现三种衍生产物:两个单氨基衍生产物和一个双氨基衍生物)衍生工具用微量移液器,不要用针筒注射器为检验2A衍生剂及与氨基酸衍生标样作对照,需先制备一个AQC衍生剂空白试样方法如下:–1.取清洁的6×50mm衍生管一只,用微量移液器加80μl硼酸盐缓冲液(Buffer1)到衍生管中;–2.换一清洁的微量移液枪头吸取20μl刚刚配好的AccQ·Tag Ultra衍生剂(2A),加到衍生管中;–3.涡旋混和几秒钟, 即制成AQC衍生剂空白,备用注意:AQC衍生试剂空白样衍生后不需加热AccQ Eluet B液:–室温下密封,避光保存AccQ Eluet A液:–低温下密封保存,防止内含的乙腈挥发选用适宜的容器–不要用塑料瓶注:未开封的Eluent A和B,在4℃下可保存1个月,开封后的可保存3天色谱柱: AccQ·Tag Ultra , 2.1×100mm–洗脱剂A: 1:10(或1:20)稀释的Elute A–洗脱剂B: Elute B柱温: 55°C流速= 0.7 ml/min梯度洗脱检测波长: UV :260nmPDA2D:260nmFLR: 激发:266nm，发射：473nm色谱柱: AccQ·Tag Ultra , 2.1×100mm–洗脱剂A: Elute A–洗脱剂B: 10%Elute B–洗脱剂C: H2O–洗脱剂D: Elute B柱温: 49°C或43°C流速= 0.7 ml/min梯度洗脱检测波长: UV :260nmPDA2D:260nmFLR: 激发:266nm，发射：473nm???清洗色谱柱及系统1.在结束AccQ Tag AAA色谱测试后,应及时切换至水／乙腈流动相(可编写一个清洗用的仪器方法)清洗色谱柱和检测池(梯度:从90:10=水:乙腈起,0.5ml/min 流速冲洗30分钟,50:50=水:乙腈,30分钟,10:90=水:乙腈清洗30分钟,将柱温降至35°C).再换成100%乙腈洗色谱柱10分钟,保证停机时色谱柱中充满纯乙腈2.用水和乙腈清洗系统后,将放置1:10(或1:20)稀释的Elute A的管路,换成水,Prime5分钟,方可停机清洗色谱柱及系统1.在结束色谱测试后,应及时换成C＋B路(50:50)清洗泵及系统(包括色谱柱),以0.5ml/min流速,至少冲洗30分钟,此时可将柱温降至30℃2.用水清洗系统后,用60:40的乙腈/水(此时应将D路换成纯乙腈)清洗色谱柱50分钟,再换成100%乙腈洗色谱柱10分钟,保证停机时色谱柱中充满纯乙腈。

氨基酸分析整体方案目录简介 03方法原理 04 l衍生l分离试剂及标准品 07 l试剂及标准品l试剂配制AccQ•Tag UPLC 氨基酸分析应用领域 08 l蛋白l培养基l制药工业l临床l食品饮料及饲料故障诊断 12 l背景污染l衍生化条件优化l色谱分离订货指南 16附录 17 l AccQ•Tag UHPLC新方案l AccQ•Tag HPLC方案l Kairos氨基酸分析方案236QSM 系统仪器条件QSM 系统LC 系统ACQUITY UPLC H-Class /TUV (FLR)system 色谱柱AccQ•Tag Ultra 1.7 µm 2.1 x 100 mm;P/N: 186003837流动相A Waters AccQ•Tag Ultra Eluent A 流动相B 10% Waters AccQ•Tag Ultra Eluent B 流动相C 超纯水流动相D Waters AccQ•Tag Ultra Eluent B 流速0.7 mL/min 进样体积 1 µL柱温49 ˚C(或43 ˚C)检测波长UV: 260 nm FLR:激发:266 nm 发射:473 nmQSM 系统流动相梯度表食品和饲料时间（分）流速A%B%C%D%曲线0.000.7 2.00.098.00.0*0.290.7 2.00.098.00.0115.490.79.080.011.00.077.100.78.015.657.918.567.300.78.015.657.918.567.690.77.80.070.921.367.990.7 4.00.036.359.768.590.7 4.00.036.359.768.680.7 2.00.098.00.0610.200.72.00.098.00.06细胞培养、水解产物、烷基化半胱氨酸时间 （分）A%B%C%D%曲线0.0010.00.090.00.0*0.299.90.090.10.075.499.080.011.00.067.108.015.657.918.567.308.015.657.918.567.697.80.070.921.367.99 4.00.036.359.768.59 4.00.036.359.768.6810.00.090.00.0610.2010.00.090.00.06Tips ：n 此氨基酸分析方案的特色体现在：分离效果好、分析时间短、操作简便、分析结果重现性稳定。