吉凯基因慢病毒滴度检测方法

慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。

该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。

培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。

3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。

四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。

2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。

（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。

3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。

过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月目录简介 (3)第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4)实验材料 (5)过表达克隆制备 (6)第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17)实验材料 (18)L e n t i v i r u s病毒包装 (21)病毒的收获及浓缩 (22)L e n t i v i r u s滴度测定 (24)参考文献 (33)简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。

吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。

吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。

GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。

通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。

pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。

pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。

慢病毒滴度测定方法简介(表达荧光的慢病毒)Day 0：将生长状态良好的293T 细胞消化计数后稀释至1⨯105/ml, 加入96孔板，100 μl/孔(1⨯104个细胞)，每种病毒需要6个孔。

放入37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。

Day 1: 在EP 管中做10倍梯度稀释，连续6个稀释度。

稀释方法如下：每种病毒准备6个1.5 ml EP 管，每管加入90 μl完全培养基，往第一个管中加入10 μl病毒原液，混匀后，吸取10 μl 加入第二个管混匀。

以此类推。

然后把稀释好的病毒和细胞孵育过夜。

Day 2：吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100 μl 完全培养液，以利于细胞的生长。

Day 3：显微镜观察荧光。

此时荧光会有初步表达。

Day 4：在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10-30%之间）的孔进行细胞计数，并计算滴度。

其计算公式如下:滴度（TU/ml）=细胞数⨯荧光百分比⨯103/病毒原液体积(μl)。

举例：③号管对应孔的荧光比例为30%，细胞总数为8⨯104，滴度（TU/ml）=8⨯104⨯30%⨯103/0.1=2.4⨯108如果要感染2×105个细胞，MOI=30（1个细胞对应30个病毒粒子）（见下注），则需要病毒体积为=2×105⨯30/2.4⨯108（ml）=0.025 ml=25 μl.注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。

各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。

慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P11）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）;Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine™LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix LipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀；e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：455 µl Opti-MEMpMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15 µl PLUS Reagent 45 µl Mix Lipofectamine LTX Up to 500µl Opti-MEM 500 µl Total V olume500 µl Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。

吉凯基因慢病毒滴度检测方法逐孔稀释滴度测定法:一：样品准备1.检测前一天，对293T 细胞传代，每个24 孔中加１×105 个细胞，体积为500μL；2.次日，准备7~10 个无菌的Ep 管，在每个管中加入90 μL 的培养基（DMEM+10%FBS）；3.取待测定的病毒原液10μL 加入到第一个管中，混匀后，取10 μL 加入到第二个管中。

继续相同的操作直到最后一管；4.选取所需的细胞孔，吸去90 μL 培养基。

加入稀释好的病毒溶液。

放入37℃5%CO培养箱中培养；25.48 小时后，加入新鲜培养基500 μL。

小心操作，不要吹起细胞；6. 4 天后，抽提RNA 准备做RT-qPCR。

二：Real time 定量PCR 法测定滴度具体操作内容参考“吉凯基因慢病毒包装手册”14页“2) Real time 定量PCR 法测定滴度”三：滴度计算方法1.加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。

通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。

2.反转录反应所获得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。

3.例如：若某次滴度检测中，1.00E-05 μL组样品和control组样品的Ct值存在2个左右差异，则认为在1.00E-05 μL组样品中存在病毒颗粒。

假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/(1.00E-05) *20＝2.00E+6 TU/μL=2.00E+9 TU/ml。

四：融解曲线说明由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。

通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。

由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。

病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔。

放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。

稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀。

依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）。

定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。

每孔细胞为5×104个。

接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。

将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。

在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl 的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。

在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。

然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。

用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。

用培养基吹洗下，离心收集细胞。

怎么检测慢病毒滴度呢？
滴度（Titer）：单位体积中有感染能力的病毒数目；单位：TU/mL（活性滴度单位）。

通常来说LV滴度检测：越准确，就越花时间；越省事的，就越不准确。

根据并不是所有的实验要求都需要精确检测，例如对于构建基因稳定过表达或干扰表达（shRNA）的细胞株，由于有后续的筛选的过程，就可采取快速检测法（死病毒也会检测出来）。

LV滴度的快速检测包括QPCR，ELISA和试纸法。

其差异在于，QPCR法：检测病毒核酸量；ELISA法：检测病毒衣壳蛋白量；试纸法：检测病毒p24衣壳蛋白含量。

而对于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究，则需要精确检测LV的滴度，包括荧光报告基因法和抗生素筛选法。

慢病毒滴度检测方法空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。

这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。

由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。

1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。

或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。

2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。

第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。

稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。

稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。

用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。

换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。

然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。

注意：每次稀释时都必须换用新枪头。

3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。

4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。

5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。

21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。

结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。

50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。

细胞准备：1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。

慢病毒滴度检测——ELISA法VS qPCR法
慢病毒滴度检测是检验慢病毒是否合格的方法之一。

在一些特定的实验中，我们需要为病毒的浓度，即滴度，进行测定。

由于慢病毒载体的不同以及客户需求的不同，有的慢病毒会带有荧光标记，而有的没有，故而滴度检测也有不同的方法。

一、ELISA法
传统的p24 ELISA可检测到293细胞在瞬时转染过程中产生的病毒相关p24和游离p24，而游离的p24可以占上清液中p24总量的很大一部分。

因此，传统的p24 ELISA通常会高估存在的慢病毒的数量。

新的QuickTiter慢病毒滴度试剂盒（与慢病毒相关的HIV p24）可最大程度地减少此问题。

一项专有技术可在运行测定的ELISA部分之前，将慢病毒与溶液中的游离p24分离。

二、Real-time PCR法
GeneCopoeia的Lenti-Pac 慢病毒滴度检测试剂盒系列产品为简便、快速检测慢病毒颗粒的滴度而设计。

试剂盒包含从RNA抽提到qRT- PCR检测过程的全套试剂，样品经过RNA抽提、DNase消化、反转录、qRT-PCR步骤即可确定慢病毒滴度。

特点：
1.能够判断慢病毒是否包装成功；
2.准确测定病毒拷贝数，以确保细胞转导和基因表达的效率；
3.提供滴度检测过程从病毒的RNA提取到qPCR检测所需要的试剂。

综上，慢病毒滴度检测：ELISA法结合qPCR法，想怎么测就怎么测~
文章来源：武汉艾美捷科技。