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新型聚乙烯亚胺非病毒基因载体的研究马昆1，胡敏新1，汪卫军2，齐岩3，邹积宏3，邱利焱1，金一1*（1.浙江大学药学院，药物制剂剂研究所，杭州 310058；2. 浙江仙琚制药股份有限公司，浙江仙居317300；3. 黑龙江大学，生命科学院，哈尔滨 150080）摘要：目的将曲安奈德接枝低分子量聚乙烯亚胺（PEI 1800）合成新型非病毒基因载体TA-PEI，提高转染效率，降低毒性。
方法曲安奈德的21位羟基用甲磺酰氯取代，生成曲安奈德甲磺酸酯。
PEI 1800，Traut’s 试剂与曲安奈德甲磺酸酯一步反应生成TA-PEI聚合物。
将TA-PEI与pDNA复合生成polyplex，其理化性质，转染效率和细胞毒性被研究。
结果TA-PEI被合成。
其缓冲能力与PEI 25K相似，优于纯水。
其能与pDNA复合形成200 nm左右的粒子。
转染活性提高，优于PEI 25K，细胞毒性低于PEI 25K。
结论接枝TA后，PEI 1800的转基因活性增强，而毒性较低，是一种有希望用于基因治疗的基因载体。
关键词：基因传递；非病毒载体；聚乙烯亚胺；细胞核靶向基金项目：国家重点基础研究发展计划（973项目，2009CB930300）；国家自然科学基金（30873175）；浙江省自然科学基金（Y2090229）作者简介：马昆，男，博士研究生研究方向：药物新技术与新剂型*通讯作者：金一，男，博士生导师研究方向：药物新技术与新剂型 Tel:(0571)88208435 E-mail:******************Preparation and Characteristics of a New Polyethylenimine Polymer as Non-viral Gene Carrier SystemMA Kun1,WANG Wei–jun2, HU Min–Xin1, QI Yan3, QIU Li–Yan1, JIN Yi 1*(1Institute of Pharmaceutics, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Zhejiang Xianju Pharmaceutical Co.,Ltd. Xianju, Zhejiang 317300, China; 3College of life Sciences, Heilung–kiang University, Harbin 150080, China)ABSTRACT: OBJECTIVE Triamcinolone acetonide (TA) was conjugated with low molecular weights PEI (PEI1800) to synthesize a novel non–viral carrier (TA–PEI) to enhance its transfection efficiency and reduce cytotoxicity. METHODS TA with 21-OH was reacted with methanesulfonyl chloride to create TA mesylate. Then a one-pot reaction between PEI 1800, Traut’s reagent and TA mesylate yielded TA-PEI polymer. And the polyplex of TA-PEI/pDNA was prepared. Its physicochemical characteristics, transfection efficiency and cytotoxicity were investigated. RESULTS TA–PEI was synthesized. Its buffer capacity was similar to PEI 25K and better than pure water. It could complex with pDNA to form particle around 200 nm. Its transfection activity was enhanced and higher than that of PEI 25K. Its cytotoxicity was lowerthan that of PEI 25K. CONCLUSION After conjugated with TA, transgenic activity of PEI 1800 was improved and with low cytotoxicity. TA–PEI has a great potential for gene therapy as non–viral carrier.KEY WORDS: Gene delivery; Non–viral vector; Polyethylenimine; Nuclear translocation随着分子生物学和生物技术的发展，基因治疗已经成为遗传病，传染病，癌症等疾病的的一种新兴治疗方法。
pH响应性树枝状聚合物-金纳米粒子复合药物载体的制备朱钦富;胡可珍;李小杰;陈明清【摘要】以表面接枝聚乙二醇链的聚酰胺胺树枝状聚合物(PEG-PAMAM)为纳米载体,在其内部空腔包覆金纳米粒子,在金纳米粒子表面连接硫辛酸改性的阿霉素(LA-DOX),从而间接实现了抗癌药物在PEG-PAMAM内的高效负载.同时,LA-DOX 中的酰腙键提供pH响应性,实现了药物的pH响应性释放.紫外-可见(UV-Vis)光谱表明,包覆金纳米粒子的PEG-PAMAM纳米载体对LA-DOX的负载能力显著增强.体外细胞实验表明,负载LA-DOX的树枝状聚合物-金纳米粒子复合药物载体具有较强的抗肿瘤能力.【期刊名称】《高等学校化学学报》【年(卷),期】2019(040)005【总页数】6页(P1065-1070)【关键词】树枝状聚合物;金纳米粒子;pH响应性;纳米药物【作者】朱钦富;胡可珍;李小杰;陈明清【作者单位】江南大学化学与材料工程学院,合成与生物胶体教育部重点实验室,无锡214122;江南大学化学与材料工程学院,合成与生物胶体教育部重点实验室,无锡214122;江南大学化学与材料工程学院,合成与生物胶体教育部重点实验室,无锡214122;江南大学化学与材料工程学院,合成与生物胶体教育部重点实验室,无锡214122【正文语种】中文【中图分类】O633纳米科技的发展为肿瘤治疗提供了新手段.肿瘤组织本身具有特殊的构造和区别于正常细胞的微环境,使纳米粒子能选择性地富集在肿瘤部位,从而为肿瘤的靶向给药提供了契机[1～3].构建纳米尺寸、载药量大、生物毒性低并在肿瘤部位选择性释放药物的药物载体是当今生物医药领域的一个研究热点.目前,脂质体、有机无机杂化纳米颗粒、聚合物胶束及树枝状聚合物是研究较为广泛的药物载体[2,3].树枝状聚合物因具有独特的分子结构和物理化学性质而备受关注[4].树枝状聚合物具有精确的纳米构造,通常呈现球形或者椭圆形结构,具有丰富的表面官能团和较大的内部空间,能包埋并化学键合药物,在肿瘤诊断及治疗领域具有潜在的应用价值[5].通过对树枝状聚合物进行表面改性,还可以赋予其生物相容性、单分子稳定性及靶向功能等特性[6～12].表面接枝聚乙二醇链的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PEG-PAMAM)具有极低的生物毒性、良好的单分子稳定性、长时间血液循环及肿瘤靶向性能[13].利用疏水及电荷相互作用,PEG-PAMAM的内腔可以负载抗癌药物分子和光敏剂分子,特别是含羧基或负电荷的分子[14,15].但由于大多数药物与PAMAM内腔的相互作用力不强,使PEG-PAMAM中负载的分子在缓冲溶液中会被快速释放,限制了PEG-PAMAM纳米药物载体在肿瘤治疗中的应用.树枝状聚合物的内部空腔为纳米粒子提供了吸附位点,为树枝状纳米载体的构筑提供了新的思路.树枝状聚合物-金纳米粒子是通过物理相互作用将金纳米粒子(AuNPs)包覆到树枝状聚合物的内部空腔中,使金纳米粒子表面可以进一步功能化[16].因此,本文以包覆金纳米粒子的PEG-PAMAM(PEG-PAMAM@AuNPs)为纳米载体,在金纳米粒子表面连接硫辛酸改性的阿霉素(LA-DOX),制得负载LA-DOX 的PEG-PAMAM@AuNPs复合物(PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX),实现了抗癌药物在PEG-PAMAM内的高效负载和可控释放.内核的金纳米粒子显著提高了载体的负载效率[16～18],LA-DOX中的酰腙键提供了pH响应性[19～21],通过体外细胞实验探究了药物载体的抗肿瘤效率.1 实验部分1.1 试剂与仪器聚乙二醇(PEG),数均分子量为2000,国药集团化学试剂有限公司; 树枝状聚酰胺胺(PAMAM,G4),数均分子量为14215,64个氨基基团,Sigma(上海)贸易有限公司;α-硫辛酸(LA),Aladdin生化科技股份有限公司;N,N′-羰基二咪唑(CDI),国药集团化学试剂有限公司; 盐酸阿霉素(DOX),Aladdin生化科技股份有限公司; 肼基甲酸叔丁酯、无水乙醚、无水甲醇及氯仿,分析纯,国药集团化学试剂有限公司; 其余试剂或溶剂均为分析纯.Bruker-DMX500型核磁共振(1H NMR)波谱仪,德国Bruker公司,400 MHz; UV-1100型紫外-可见(UV-Vis)分光光度仪,北京瑞利分析仪器公司; JEM-2100plus型透射电子显微镜(TEM),日本电子株式会社,200 kV; Infinite M200Pro型酶标仪,帝肯奥地利有限责任公司.1.2 实验过程1.2.1 PEG-PAMAM@AuNPs的制备利用对硝基苯基碳酸酯封端的聚乙二醇(PEG-NPC)和PAMAM的酯交换反应制备PEG-PAMAM[22][Scheme 1(A)].然后通过原位还原将金纳米粒子负载到树枝状聚合物内核中,制得PEG-PAMAM@AuNPs[16](Scheme 2).Scheme 1 Synthetic route for PEG-PAMAM(A)and LA-DOX(B)Scheme 2 Preparation of PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX nanocomposites 1.2.2 硫辛酸改性阿霉素(LA-DOX)的制备将α-硫辛酸(3 g,14.5 mmol) 和CDI(2.605 g,16.07 mmol)溶解在10 mL氯仿中,搅拌活化1 h后,加入含肼基甲酸叔丁酯(1.874 g,14.18 mmol)的氯仿溶液10 mL,在氮气气氛下室温反应12 h; 反应结束后,用柱层析分离产物(洗脱剂为乙酸乙酯),最后旋转蒸发除掉溶剂,得到中间体1(4.04 g,产率88.99%).将中间体1(2 g,6.24 mmol)溶解在10 mL三氟乙酸中,混合冰水浴反应30 min,旋转蒸发除掉溶剂,得到中间体2(1.9 g,产率90.91%); 将盐酸阿霉素(12 mg,0.021 mmol)与中间体2(20.75 mg,0.062 mmol)(体积比为1∶3)溶于6 mL无水甲醇中,室温反应12 h; 用乙酸乙酯沉淀后,离心分离并真空干燥得到LA-DOX[Scheme1(B)].1.2.3 PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX的制备将LA-DOX与PEG-PAMAM@AuNPs以摩尔比20∶1混合在水溶液中,搅拌3 h,透析24 h,除掉游离的阿霉素分子,得到PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX.1.2.4 体外缓释将PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX置于截留分子量为3500的透析袋中,于37 ℃分别在pH=7.4和5.0的磷酸缓冲液中透析,每隔一段时间取透析液,利用紫外-可见分光光度计测试其在最大吸收波长481 nm处的吸光度,通过吸光度值确定DOX释放量.每个实验重复3次,并计算平均值及标准偏差(SD). 1.2.5 体外抗肿瘤性能测定将Hela 细胞接种于96孔细胞培养板中(每个孔含有大约5000个细胞及100 μL DMEM培养液),置于温度为37 ℃,二氧化碳浓度为5%的培养箱中培养24 h; 加入100 μL含有不同单分子胶束浓度的培养液,继续培养48 h; 然后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL) 的PBS溶液,再继续培养4 h; 最后,除去含MTT的培养液后,加入150 μL DMSO,避光摇晃15 min,使甲瓒溶解完全.通过酶标仪进行检测,检测波长为570 nm.每个实验重复3次,计算平均值及标准偏差.2 结果与讨论2.1 PEG-PAMAM的结构表征为考察载体的生物相容性和单分子稳定性,利用PEG-NPC与PAMAM的酯交换反应制备PEG-PAMAM[22]. PEG-PAMAM的分子结构通过1H NMR谱得到验证.由图1(A)可见,PEG的特征峰—COOCH2CH2O—与PAMAM的特征峰—NCH2CH2CONH—的峰面积积分比为128.3∶248,与理论值相符,证明每个树状聚合物上接枝了约64条聚乙二醇链,PAMAM表面胺基改性率接近100%.Fig.1 1H NMR spectrum of PEG-PAMAM in D2O(A)and UV-Vis spectra of PEG-PAMAM(a)and PEG-PAMAM@AuNPs(b)in aqueous solution(B) Inset of (B): TEM image of PEG-PAMAM@AuNPs.大多数药物与树枝状聚合物内腔的相互作用力较弱,为提高载体与药物的相互作用,通过原位还原将金纳米粒子负载到树枝状聚合物内核中,制得树枝状聚合物-金纳米粒子复合物[16].利用紫外-可见吸收光谱对其进行表征[图1(B)],PEG-PAMAM@AuNPs在520 nm处出现了金纳米粒子的特征吸收峰; 利用TEM表征了PEG-PAMAM@AuNPs的形貌[图1(B)插图],可见PEG-PAMAM@AuNPs为圆球形,粒径为6 nm左右,与之前工作结果一致[23],证明金纳米粒子负载在PEG-PAMAM内腔.2.2 LA-DOX的结构分析利用硫辛酸对药物阿霉素进行改性,改性产物侧链含有二硫五元环基团,与纳米载体中金纳米粒子具有较强的相互作用[16～18],并引入具有pH响应性的酰腙键,能够在酸性条件下释放出DOX药物分子[19～21],从而实现DOX的pH响应性释放. 图2(A)为中间体1的1H NMR谱图.五元环上接近S的—CH2与叔丁基的峰面积积分比为2∶9,表明中间体结构和预期一致.图2(B)为LA-DOX的1H NMR谱图.接近S的—CH2与—OCH3的峰面积积分比为2∶3,证明LA-DOX被合成. Fig.2 1H NMR spectra of intermediate 1(A)and LA-DOX product(B)Fig.3 UV-Vis spectra of PEG-PAMAM-DOX complex(A),PEG-PAMAM@AuNPs-DOX complex(B), PEG-PAMAM-LA-DOX complex(C)and PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX complex(D)before(a) and after(b)dialysis inaqueous solution (A),(C)c.PEG-PAMAM; (B),(D)c.PEG-PAMAM@AuNPs. 2.3 纳米载体药物的负载效率PEG-PAMAM和PEG-PAMAM@AuNPs对原药DOX的负载效率分别如图3(A)和(B)所示.PEG-PAMAM透析后的药物负载效率仅为0.76%,平均每个树状聚合物中负载0.15个DOX分子,负载效率极低,与文献[24]报道基本一致.PEG-PAMAM@AuNPs透析后药物负载率仅为0.95%,平均每个树状聚合物中负载0.21个DOX分子,与PEG-PAMAM负载效率相接近,证明金纳米粒子的引入对未改性的DOX的负载效率基本没有影响,与预想完全吻合.这是因为阿霉素与树枝状聚合物之间存在疏水相互作用,在PBS缓冲溶液中DOX会逐渐负载到树枝状聚合物的内核,但由于DOX与树枝状聚合物内腔的相互作用力较弱,药物分子在透析过程中被快速释放,无法有效延长药物在体内的循环周期.PEG-PAMAM和PEG-PAMAM@AuNPs对LA-DOX的负载效率分别如图3(C)和(D)所示.PEG-PAMAM透析后对LA-DOX的负载效率为7.98%,每个树枝状聚合物分子中负载1.59个LA-DOX分子,负载能力有所增强.这可能是由于LA-DOX的疏水性比DOX有所增强,与PEG-PAMAM的疏水内腔的相互作用随之增强.PEG-PAMAM@AuNPs透析后对LA-DOX的负载效率为47.42%,每个PEG-PAMAM@AuNPs分子中负载9.18个LA-DOX分子,负载效率显著提高.PEG-PAMAM@AuNPs对LA-DOX的高效负载应归功于LA-DOX与金纳米粒子之间硫-金键的形成,从而间接实现了DOX在树枝状聚合物中的高效负载.Scheme 3 pH responsive release of PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX nanocomposites2.4 药物载体的体外缓释行为LA-DOX中的酰腙基团提供pH响应性释放功能,实现药物DOX的响应性释放(Scheme 3).为研究载药纳米载体的pH响应性,对PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX在生理条件下(pH=7.4)和弱酸性条件(pH=5.0)下的药物释放行为进行了研究(图4).在生理条件下,72 h时DOX释放量仅为9%,而在酸性条件下,72 h时DOX 释放量为99%,证明PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX能在酸性条件下快速释放负载药物,具有良好的pH响应性.Fig.4 Evaluation of drug release profiles for PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX under physiological and acidic conditions using dialysis method at37℃pH:a.5.0;b.7.4.Fig.5 Cytotoxicity of PEG-PAMAM@AuNPs(),LA-DOX(),DOX()and PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX()with gradient DOX concentration2.5 药物载体的抗肿瘤效率抗肿瘤效率极大地影响纳米载体的应用.为研究纳米载体的抗肿瘤效率,分别对PEG-PAMAM@AuNPs、LA-DOX、原药DOX和PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX的细胞存活率进行了研究(图5).结果表明,添加不同浓度的PEG-PAMAM@AuNPs,细胞存活率都较高,表明纳米载体具有很低的生物毒性.与原药DOX相比,LA-DOX具有较低的细胞毒性,这可能是因为药物进入细胞的机制存在一定的差异; 随着DOX浓度的增加,PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX的细胞存活率相应下降,证明纳米载体的抗肿瘤能力具有浓度相关性.载体抗肿瘤效率较高,有望应用于肿瘤的高效治疗.3 结论本文设计并制备了一种基于表面接枝聚乙二醇链的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PEG-PAMAM)的纳米药物载体(PEG-PAMAM@AuNPs-LA-DOX).该载体具有良好的单分子稳定性及较低的生物毒性,以金纳米粒子为功能性平台实现了抗肿瘤药物DOX稳定而高效的负载及pH响应性释放性能.体外细胞实验表明,负载LA-DOX 的树枝状聚合物-金纳米粒子复合物具有较好的抗肿瘤效率,在生物医学领域具有良好的应用前景.参考文献【相关文献】[1] Hu Q.,Studies on the Construction and in vitro Anti-cancer Efficiency of Multifunctional PAMAM-DOX Conjugates Drug Delivery System,Soochow University,Suzhou,2013(胡青.多功能PAMAM聚合物递药系统的构建及体外抗肿瘤研究,苏州: 苏州大学,2013)[2] Sun R.,Zhu W.,Liu Y.Q.,Journal of Pharmaceutical Research,2014,33,249—252(孙蕊,朱琰,刘玉琴.药学研究,2014,5,249—252)[3] Hu H.X.,Wang X.Q.,Zhang H.,Zhang Q.,Journal of PharmaceuticalSciences,2015,10,1232—1239(胡宏祥,王学清,张华,张强.药学学报,2015,50,1232—1239)[4] Mintzer M.A.,Grinstaff M.W.,Chem.Soc.Rev.,2010,40,173—190[5] Tomalia D.A.,Soft Matter,2010,6,456—474[6] Astruc D.,Boisselier E.,Ornelas C.,Chem.Rev.,2010,110,1857—1959[7] Haensler J.,Francis S.C.Jr.,Bioconjugate Chem.,1993,4,372—379[8] Jevprasesphant R.,Penny J.,Jalal R.,Attwood D.,Mckeown N.B.,D’EmanueleA.,Int.J.Pharm.,2003,252,263—266[9] Malik N.,Wiwattanapatapee R.,Klopsch R.,Lorenz K.,Frey H.,Weener J.W.,J.Controlled Release,2000,65,133—148[10] Kolhatkar R.B.,Kitchens K.M.,Swaan P.W.,Ghandehari H.,BioconjugateChem.,2007,18,2054—2060[11] Majoros I.J.,Myc A.,Thomas T.,Mehta C.B.,Baker J.R.,Biomacromolecules,2006,7,572—579[12] Shi X.,Wang S.,Sun H.,Baker J.R.,Soft Matter,2007,3,71—74[13] Cheng Y.,Zhao L.,Li Y.,Xu T.,Chem.Soc.Rev.,2011,40,2673—2703[14] Kojima C.,Kono K.,Maruyama K.,Takagishi T.,Bioconjugate Chem.,2000,11,910—917[15] Kojima C.,Toi Y.,Harada A.,Kono K.,Bioconjugate Chem.,2007,18,663—670[16] Wang X.,Cai X.,Hu J.,Shao N.,Wang F.,Zhang Q.,Xiao J.R.,ChengY.Y.,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,9805—9810[17] Figueroa E.R.,Lin A.Y.,Yan J.,Luo L.,Foster A.E.,Drezek R.A.,Biomaterials,2014,35,1725—1734[18] Wei Y.,Li Y.,Zhang N.,Shi G.,Jin L.,Ultrason Sonochem,2010,17,17—20[19] Li X.J.,Takashima M.,Yuba E.,Harada A.,Kono K.,Biomaterials,2014,35,6576—6584[20] HrubM.,Konák C.,Ulbrich K.,J.Controlled Releas e,2005,103,137—148[21] Ma Y.,Fan X.,Li L.,Carbohydr.Polym.,2016,137,19—29[22] Kojima C.,Kono K.,Maruyama K.,Takagishi T.,Bioconjugate Chem.,2000,11,910—917[23] Kono K.,Takeda K.,Li X.,Yuba E.,Harada A.,Ozaki T.,Mori S.,RSC.Adv.,2014,4,27811—27819[24] Yu P.L.,Li S.T.,Ye L.,Yang H.,Wang C.X.,Chinese J.Biomed.Eng.,2007,26,921—925(余沛霖,李慎涛,叶玲,杨华,王丛霞.中国生物医学工程学报,2007,26,921—925)。
第9期2011年9月高分子学报ACTA POLYMERICA SINICANo．9Sep．，20111086*庆祝沈家骢院士80华诞专稿；2011-04-18收稿，2011-06-08修稿；国家自然科学基金（基金号50873102，50733003，21074129，50903009和A3项目20921140264）、吉林省科技发展计划（项目号20090128，20096018）和科技部国际合作项目（项目号2009AA03Z308）资助；＊＊通讯联系人，E-mail ：xschen@ciac．jl．cn ；weiyen@tsinghua．edu．cn doi ：10．3724/SP．J．1105．2011．11121京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征*董璇1，2田华雨1陈杰1夏加亮1，2陈学思1＊＊危岩3＊＊（1中科院长春应用化学研究所先进生态环境材料重点实验室长春130022）（2中国科学院研究生院北京100039）（3清华大学理学院化学系北京100084）摘要使用京尼平与分子量为1800的超支化低聚乙烯亚胺在70%的乙醇溶液中反应，合成了具有荧光的交联型聚合物．利用核磁、凝胶渗透色谱、粒度仪、zeta 电位仪和凝胶阻滞电泳对聚合物载体及其与DNA 复合物颗粒进行了表征．研究表明，聚合物载体与DNA 复合物颗粒粒径为120 150nm ，zeta 电位为+20 25mV ，聚合物/DNA 在质量比为0.25时能够将DNA 完全阻滞．通过MTT 细胞毒性测试和体外荧光素酶质粒转染实验得出，载体在测试范围内显示了非常低的细胞毒性，最佳转染效率明显高于PEI25k ，同时载体可用于荧光标记．关键词京尼平，低聚乙烯亚胺，基因载体，转染，荧光基因技术的发展使得基因缺陷导致的疾病或者癌症等的根治成为可能［1 3］．病毒类载体被广泛的应用于基因治疗中，但是病毒类载体存在着很大的免疫安全隐患，极大地限制了其发展．聚阳离子载体便宜易得，且不存在病毒类载体的安全隐患，日益成为基因载体领域的研究热点［3］．其中，聚乙烯亚胺（PEI ）由于其独特的“质子海绵效应”，能够实现载体与DNA 形成的复合物从内涵体中逃逸，引起科研学者的广泛关注［4］．作为金标准的PEI25k （M n =2.5ˑ104Da ）虽然具有较高的转染效率，但细胞毒性大限制了其应用［5 10］．通过使用各种不同的交联剂将低分子量PEI 进行选择性的交联得到的交联型PEI 不仅保持了低分子量PEI 的低毒性同时还获得了与PEI25k 相似的转染效率［11 15］．京尼平（Genipin ）由于其极低的细胞毒性和基因毒性和优良的生物相容性，是一种新型、天然的交联剂．因此，其在药物控释、骨组织修复以及组织工程支架等生物医用领域得到了广泛的应用［16，17］．然而，在基因传递领域，有关京尼平的应用只有较少的报道［18］．利用京尼平交联低聚乙烯亚胺的合成及应用尚鲜见报道．因此，本文通过京尼平交联分子量为1800的超支化低聚乙烯亚胺，得到了一种新型具有荧光的阳离子聚合物，研究了其作为非病毒基因载体应用的各项性能．1实验部分1.1试剂与仪器超支化聚乙烯亚胺（PEI25k ）（Sigma ，M w =2.5ˑ104）；支化低聚乙烯亚胺（OEI1800）（Alfa ，M w =1800）；京尼平（Genipin ）（上海天放公司）；透析袋（MWCO 3500，上海绿鸟公司）；小牛胸腺DNA （Promega 公司）；4'，6二脒基-2-苯吲哚（DAPI ，Sigma-Aldrich ）；噻唑蓝（MTT ）（Sigma 公司）；BCA （二喹啉甲酸）法蛋白浓度检测试剂盒（Pierce 公司）；酶标仪（ELISA microplate reader ，Bio-rad 公司）；乙醇溶剂为化学纯直接使用．1.2实验过程1.2.1京尼平交联低聚乙烯亚胺（GP ）的合成将2.96g OEI1800（1.64mmol ）置于圆底烧瓶中，用15mL 70%的乙醇溶解；另将0.37g （1.64mmol ）京尼平（Genipin ）溶于1.5mL 70%的乙醇中，将京尼平溶液加入到OEI1800的反应瓶中混合均匀，升温至37ħ搅拌反应3天．反应完毕后，在截留分子量为3500的透析袋中透析3天，用G4砂芯漏斗过滤溶液，将滤液冷冻干燥，得到蓝黑色目标产物京尼平交联低聚乙烯亚胺聚合物（GP ），收率为50%．9期董璇等：京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征1.2.2测试方法核磁共振氢谱（1H-NMR ）用Bruker AV400NMR 核磁共振仪测试，以D 2O 为溶剂．凝胶渗透色谱（GPC ）由Waters 515泵、1根7.8ˑ300mm 线形柱、1个Wyatt 十八角激光光散射器和1个OPTILAB DSP 折光指数检测仪组成．流动相为0.3mol /L 醋酸钠（pH = 4.4），使用前用0.02μm 滤膜过滤，流速为0.5mL /min［19］．1.2.3凝胶阻滞电泳实验配制0.1mg /mL 的质粒DNA （pDNA ，pEGFP-N1）水溶液，加入等体积一定浓度的聚合物溶液，混合，涡旋，孵育10min 后，用1%的琼脂糖电泳分析．1.2.4复合物的粒径与表面电位表征配制0.05mg /mL 的小牛胸腺DNA 水溶液，复合物根据不同的阳离子聚合物/DNA 比例混合制备，涡旋后孵育30min ，粒径大小与表面电荷采用纳米粒度电位仪（zeta plus ，Brookhaven 公司，美国）进行测定．Scheme 1Synthesis route of genipin crosslinked PEI （GP ）copolymer1.2.5细胞毒性测试采用MTT 方法进行表征．HEK293细胞按照1ˑ104cell /孔的密度接种于96孔板中，置于37ħ5%CO 2的孵箱，于含有10%新生牛血清（FBS ）、100μg /mL 链霉素和100Unit /mL 青霉素的DMEM 培养液中培养24h．然后在每孔中加入100μL 不同浓度阳离子聚合物的磷酸盐缓冲液（PBS ），继续培养24h 后，每孔加入20μL MTT （5mg /mL ）的PBS 溶液，继续培养4h ，小心弃去培养液，每孔加入200μL 二甲基亚砜（DMSO ），振荡10min ，用酶标仪测试每孔在492nm 波长下的吸收值．细胞存活率（%）=（A sample /A control ）ˑ100%．A sample 为与聚合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，A control 为未与聚合物溶液作用的细胞样品孔的吸收，每组实验重复3次．1.2.6细胞荧光素酶转染实验转染前24h ，HEK293细胞按照1ˑ104cell /孔的密度接种于96孔板中，加入DMEM 培养液在37ħ5%CO 2的孵箱中培养24h 后使细胞汇合度达到80% 90%．转染前，更新培养液，配制不同质量比的阳离子聚合物/DNA 复合物，室温下结合30min ，加入96孔板中．继续培养48h ，小心弃去培养液，用PBS 清洗2次，然后每孔加入100μL 细胞裂解液．使用荧光素酶分析系统（Promega 公司）测定荧光素酶活性的相对光单位（relative light unit ，RLU ）．采用BCA 法测定裂解液中的蛋白含量，转染效率采用荧光素酶活性的每毫克蛋白质的RLU 表示．1.2.7激光共聚焦实验HEK293细胞按照1ˑ105cell /孔的密度接种于6孔板中的11mm 盖玻片上，在细胞汇合度达到70% 80%时进行转染，选荧光素酶质粒DNA （pGL3plasmid ）为报告基因，阳离子载体/DNA 复合物的质量比为20ʒ1．在转染后5h 取出培养板，用3.7%多聚甲醛固定10min ，弃去上清液，用PBS 洗3次．每孔加入1μL DAPI 溶液（1μg /mL ）标记细胞核10min ，使用激光共聚焦显微镜（Leica ，TCS SP2）观察照相．2结果与讨论2.1载体合成及表征聚合物GP 的合成过程如示意图1所示．京尼平和OEI1800都在70%乙醇中溶解很好，即使使用一个过大的反应浓度也不会出现一个黏稠的反应体系［20，21］，从而能够较精确地控制反应浓度，使交联产物的可重复性大大增强．实验发现，通过控制乙醇的浓度可有效控制交联度，在99%乙醇中反应得到的交联聚合物在水中不溶解，而在70%乙醇中反应得到的聚合物在水中溶解性很好，可能是由于在高浓度的乙醇中反应得到交联产物中憎水性的京尼平含量增加降低了交联生成的聚阳离子在水中的溶解性．另外，得到交联聚合物GP 中含有大量的共轭结构，表现出了荧光7801高分子学报2011年性，通过激光共聚焦显微镜观察也证实了这一点．聚合物的结构通过1H-NMR 的方法进行了表征．如图1所示，OEI1800结构的特征峰在δ2.4 3.5处；而在δ4.21（a ）、7.73（b ）、5.87（c ）、5.71（d ）出现的特征峰分别归属于京尼平的亚甲基峰以及杂环上质子峰，由此证明了京尼平交联OEI1800反应的发生．Fig．11H-NMR spectrum of GP22in D 2O通过GPC-光散射方法测定产物绝对分子量及其分布的结果见表1．随着反应物（Genipin /OEI1800）投料摩尔比的减小，聚合物分子量变小；相对于OEI1800聚合物的分子量都显著增大，也证实了京尼平交联OEI1800反应发生．Table 1Preparation of GP copolymersSample Feed molar ratio of Genipin /OEI1800M w PDI GP212ʒ175700 1.13GP222ʒ251100 1.09GP232：3402001.182.2GP /DNA 复合物的粒径与表面电位载体/DNA 复合物颗粒的粒径大小及表面电荷情况直接影响基因传递过程的稳定性以及细胞内吞效率［20，21］．通过图2（a ）表面电位结果并结合图2（b ）粒径测试结果，可以得出，通过Genipin 交联OEI1800反应得到较大分子量的GP21、GP22以及GP23都能够有效的包裹保护DNA ，形成120 150nm 复合物颗粒．表面电位随着载体/DNA 质量比增加，复合物颗粒的表面电荷由负变正并逐渐增大，最终稳定在+20 25mV．PEI25k 具有很强的DNA 结合力，能够与DNA 复合并压缩形成120nm 左右的表面带正电的颗粒．虽然OEI1800分子结构与PEI25k 相同，但由于分子量偏低结合力弱，其与DNA 复合形成较大的颗粒（280nm 左右），表面电荷很小（+14mV 左右）．这一结果也体现了交联型阳离子的结合力较单纯的交联单元（OEI1800）提高了很多．Fig．2（a ）zeta potentials and （b ）particle sizes of complexesof DNA and different carriers at various mass ratios2.3凝胶阻滞电泳通过凝胶阻滞电泳实验进一步考察载体材料GP 与DNA 的结合能力．如图3所示，3种聚阳离子材料GP21、GP22和GP23都能够非常有效地完成对质粒DNA 的电泳阻滞．PEI25k 、GP21、GP22和GP23的临界阻滞载体/DNA 质量比分别为0.15、0.25、0.25和0.2，聚阳离子材料GP21、GP22和GP23临界阻滞载体/DNA 质量比都比PEI25k 稍高一点，可能是由于交联反应过程中伯胺参与反应，从而伯胺基团数量的减少导致电荷密度的降低，与DNA 的结合能力减弱．2.4MTT 细胞毒性表征图4为在不同聚合物浓度下的细胞存活率曲线．所有的GP 共聚物（GP21、GP22和GP23）都表现出比PEI25k 更低的细胞毒性，这与报道的此类载体性质一致［22，23］．在浓度＜50μg /mL 时，所有GP 共聚物都表现出较低的细胞毒性，细胞存活率88019期董璇等：京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征Fig．3Gel retardation assay of complexes at various mass ratios （a ）PEI25k /pDNA ，（b ）GP21/pDNA ，（c ）GP22/pDNA ，（d ）GP23/pDNA ；mass ratio of complex /DNA ，1 8：0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4均大于70%，与OEI1800相当．随着GP 聚合物浓度的增加，细胞毒性也随之相应增加，这是因为交联的GP 共聚物比OEI 具有更高的阳离子密度．Fig．4The percentages of viable cells at various polymerconcentrations for PEI25k ，OEI1800，GP21，GP22，GP232.5细胞荧光素酶转染选用pGL3plasmid 作为报告基因进行细胞转染实验评价材料的性能．用HEK293细胞系分别对PEI25k 、OEI1800和载体GP 进行转染性能比较．如图5所示，交联型基因载体GP 与单纯OEI1800相比，具有更高的转染效率．GP 聚合物的转染效率随着分子量的降低而升高．GP22和GP23的最佳转染效率都高于PEI25k ，其中，GP23/DNA 在其最佳转染质量比为20ʒ1时的转染效率明显高于PEI25k /DNA 最佳转染质量比为1ʒ1的转染效率；GP21的转染效率则略低于PEI25k．Fig．5Transfection efficiency of carrier /pDNA at variousmass ratios in HEK293cells2.6GP /DNA 复合物颗粒的细胞内吞在前期定性以及定量实验中，GP 材料可以有效地介导DNA 进入细胞转染，获得了比较高的转染效率．为了进一步证实GP 共聚物介导DNA 细胞传递的能力，以GP22为代表，利用激光共聚焦显微镜对其与DNA 复合物颗粒进行了观察拍照．图6即是GP22/DNA 复合物颗粒在HEK293细胞转染5h 后分布情况结果．图6（b ）中箭头所示的白色（红色）区域为GP22自身发出的红色荧光，图6（a ）中箭头所示白色区域为DAPI 染色（蓝色）的细胞核．我们能清楚地看到明显的白色（红色）区域说明载体GP22可以发出红色荧光（图6（b ））．通过图6（c ）清楚地看到白色（红色）区域分布在细胞核（蓝色区域）的周围证实了聚阳离子载体GP 能够携带DNA 进行有效地胞内传递．通过这些照片足以说明GP 可以作为自发荧光载9801高分子学报2011年Fig．6Cellular distribution of GP22/pGL3complexes in HEK293cells at5h post-tansfection；cells were fixed with PFA and stained with DAPI to visualize the cell nuclei体材料有效地介导质粒DNA进入细胞内并进行基因传递．3结论通过京尼平交联低聚乙烯亚胺得到了一种新型具有红色荧光的交联型阳离子聚合物GP．通过不同的京尼平/OEI投料比，可以获得不同分子量的GP共聚物．所获得GP共聚物都能够有效地结合DNA，并进行基因传递，表现出与PEI25k相当的转染效率，却具有更低的细胞毒性．此外，其自身的红色荧光性能，使得其在基因传递过程中，易于进行荧光显微镜观察．因此，此类共聚物可作为自身荧光标记载体在基因传递领域将有良好的应用前景．REFERENCES1Merdan T，Kopecek J，Kissel T．Adv Drug Delivery Rev，2002，54（5）：715 7582Olefsky J M．Nature，2000，408（6811）：420 4213Mintzer M A，Simanek E E．Chem Rev，2009，109（2）：259 3024Boussif O，Lezoualch F，Zanta M A，Mergny M D，Scherman D，Demeneix B，Behr J P．Proceedings of the National Academy of Sciences，1995，（92）：7297 73015Tian H Y，Xiong W，Wei J Z，Wang Y，Chen X S，Jing X B，Zhu Q Y．Biomaterials，2007，（28）：2899 29076Chen J，Tian H Y，Guo Z P，Xia J L，Kano A，Maruyama A，Jing X B，Chen X S．Macromole Biosci，2009，（9）：1247 12537Tian H Y，Chen X S，Lin H，Deng C，Zhang P B，Wei Y．Chem Eur J，2006，（12）：4305 43128Xia J L，Chen L，Chen J，Tian H Y，Li F F，Zhu X J，Li G，Chen X S．Macromol Biosci，2011，（11）：211 2189Tian H Y，Deng C，Lin H，Sun J R，Deng M X，Chen X S．Biomaterials，2005，（26）：4209 421710Pei Yuanyuan（裴媛媛），Wang Weiwei（王伟伟），Liu Xianguo（刘先国），Shuai Xintao（帅心涛）．Acta Polymerica Sinica（高分子学报），2010，（1）：79 8611Jere D，Xu C X，Arote R，Yun C H，Cho M H，Cho C S．Biomaterials，2008，（29）：2535 254712Ahn C H，Chae S Y，Bae Y H，Kim S W．J Controlled Release，2002，（80）：273 28213Chen Lei（陈磊），Tian Huayu（田华雨），Chen Xuesi（陈学思），Park Taegwan（朴泰宽），Maruyama Atsushi（丸山厚），Jing Xiabin（景遐斌）．Acta Polymerica Sinica（高分子学报），2009，（6）：499 50514Fu Huili（付慧莉），Cheng Sixue（程巳雪），Zhuo Renxi（卓仁禧）．Acta Polymerica Sinica（高分子学报），2009，（2）：97 10315Dong X，Tian H Y，Chen L，Chen J，Chen X S．J Controlled Release，2011，（152）：135 14216Chiono V，Pulieri E，Vozzi G，Ciardelli G，Ahluwalia A，Giusti P．J Mater Sci Mater Med，2008，（19）：889 89817Muzzarelli R A A．Carbohydr Polym，2009，（77）：1 918Choi D H，Park C H，Kim I H，Chun H J，Park K，Han D K．J Controlled Release，2010，（147）：193 20119Jiang X L，van der Horst A，van Steenbergen M J，Akeroyd N，van Nostrum C F，Schoenmakers P J，Hennink W E．Pharm Res，2006，（23）：595 60320Forrest M L，Koerber J T，Pack D W．Bioconjugate Chem，2003，（14）：934 94021Christensen L V，Chang C W，Kim WJ，Kim S W．Bioconjugate Chem，2006，（17）：1233 124022Guo Zhaopei（郭兆培），Tian Huayu（田华雨），Xia Jialiang（夏加亮），Chen Jie（陈杰），Lin Lin（林琳），Chen Xuesi（陈学思）．Science China Chemistry（中国科学：化学），2010，53（12）：2490 249623Yuan Renxu（苑仁旭），Zuo Yufang（左瑜芳），Xiao Zhongpeng（肖中鹏），Huang Wenlin（黄文林），Shuai Xintao（帅心涛）．Acta 090119019期董璇等：京尼平交联低聚乙烯亚胺智能基因载体的制备与表征Polymerica Sinica（高分子学报），2009，（2）：104 110SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF GENIPIN CROSS-LINKEDOLIGOETHYLENIMINE FOR GENE DELIVERYDONG Xuan1，2，TIAN Huayu1，CHEN Jie1，XIA Jialiang1，2，CHEN Xuesi1，WEI Yen3（1Key Laboratory of Advanced Ecomaterials，Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun130022）（2Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing100039）（3Department of Chemistry，Tsinghua University，Beijing100084）Abstract A novel fluorescent cationic polymer，genipin cross-linked branched oligoethylenimine（1800Da，OEI1800），GP，was successfully synthesized in70%ethanol solution and evaluated as a non-viral gene carrier．The copolymers were characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy（1H-NMR）and gel permeation chromatography（GPC）．The complexes of copolymers/DNA based on GP were measured by dynamic light scattering and Zeta potential instrument．The results showed that the synthesized copolymers could efficiently condense DNA into nanosized particles（120 150nm）with positive surface charges（+20 25mV）．The DNA-binding ability of the copolymers was further examined by gel retardation assy．When the mass ratio of polymer and DNA was0.25，the plasmids were fully retarded in1%agarose gel by gel retardation electrophoresis．Moreover，the in vitro cytotoxicity and transfection efficiency of the GP copolymers were respectively tested by the MTT and luciferase assay，using OEI1800and PEI25k as the control in the HEK293 cells lines．The cell toxicity and gene transfection evaluations showed that the copolymers exhibited lower cytotoxicity and higher gene transfection efficiency than PEI25k in the HEK293cell lines．Finally，the carriers could be used as the fluorescent labeling materials．Therefore，the copolymers may have potential biomedical application as non-viral gene carriers．Keywords Genipin，Oligoethylenimine，Transfection，Gene carrier，Fluorescence。
烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的初步研究柳珊，黄伟，金明姬，权修权，高钟镐【摘要】【摘要】目的考察烷基化低分子量聚乙烯亚胺作为基因递送载体的安全性和有效性。
【期刊名称】中国医药生物技术【年(卷),期】2014(000)006【总页数】7【关键词】【关键词】聚乙烯亚胺；抗肿瘤药，烷基化；基因递送；基因疗法方法以1-溴十二烷和分子量为 1800 的分枝状 PEI（bPEI1.8K）为原料，合成bPEI1.8K-C12，并用1H-NMR 对其结构进行确认；采用MTT 法考察bPEI1.8K-C12的细胞毒性；红细胞溶血实验考察bPEI1.8K-C12的生物相容性；测定 bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的粒径分布和 zeta 电位；采用激光共聚焦显微镜观察bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的细胞摄取行为；采用琼脂糖凝胶阻滞电泳考察bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力；并用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因考察 bPEI1.8K-C12的体外转染效率。
结果经1H-NMR 确认，成功合成了bPEI1.8K-C12；MTT 结果表明bPEI1.8K-C12对人乳腺癌MCF-7 细胞的毒性与bPEI1.8K相当；红细胞溶血实验结果表明高浓度bPEI1.8K-C12静脉注射时具有潜在溶血性；质量比相同时，bPEI1.8K-C12/ DNA 复合颗粒的平均粒径和zeta 电位均比相应的bPEI1.8K/DNA 大；烷基化修饰后，bPEI1.8K-C12对DNA 的固缩能力降低，MCF-7 细胞对bPEI1.8K-C12/DNA 复合颗粒的摄取效率大大增加，bPEI1.8K-C12递送报告基因质粒的体外转染效率显著高于bPEI1.8K，甚至与lipofectamine2000 相当。
结论bPEI1.8K-C12是一种安全高效的基因递送载体，具有较高的进一步开发前景。
基因疗法[1-2]是一种治疗多种先天和后天疾病的有力工具，其在肿瘤治疗中的应用方兴未艾。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910170445.7(22)申请日 2019.03.06(71)申请人 武汉轻工大学地址 430023 湖北省武汉市东西湖区常青花园学府南路68号(72)发明人 刘梁 倪丹妮 陈新 熊学敏 (74)专利代理机构 深圳市世纪恒程知识产权代理事务所 44287代理人 胡海国(51)Int.Cl.C08G 81/00(2006.01)C08B 37/00(2006.01)C12N 15/87(2006.01)(54)发明名称一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖及其制备方法及基因载体(57)摘要本发明公开一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖及其制备方法及基因载体，涉及基因载体技术领域。
所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法包括：向米糠多糖的水溶液中加入高碘酸钾形成反应液后，对反应液进行透析，得透析液；将聚乙烯亚胺溶于缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液；将透析液加入到聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应形成反应溶液，并控制反应溶液呈碱性；将硼氢化钠加入到反应溶液中，形成初样液；对初样液进行透析，取透过液醇沉、离心、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。
本发明还提出一种基因载体，包括聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。
本发明制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖具有较低的细胞毒性和良好的生物兼容性，可以作为一种优质的基因载体应用。
权利要求书2页 说明书8页 附图3页CN 109897187 A 2019.06.18C N 109897187A1.一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖，其特征在于，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖具有结构式(1)所示结构。
结构式(1)：2.一种如权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：向米糠多糖的水溶液中加入高碘酸钾，避光搅拌形成反应液后，对所述反应液进行透析，得透析液；将聚乙烯亚胺溶于缓冲液中，形成聚乙烯亚胺溶液；将所述透析液加入到所述聚乙烯亚胺溶液中搅拌反应形成反应溶液，并在搅拌过程中控制反应溶液呈碱性；将硼氢化钠加入到所述反应溶液中，搅拌反应形成初样液；对所述初样液进行透析，取透过液醇沉、离心、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖。
聚乙烯亚胺-黄芪多糖共聚物的制备及其基因传递性能观察张丹丹;任雪玲;何阿妹;张红;周宇雪;张振中【摘要】To prepare polyethylenimine-radix astragali polysaccharide (PEI-RAP) copolymer and investigate the efficiency of PEI-RAP to transfect tumor cells in vitro .Met hods: PEI-RAP copolymers were prepared with three different methods, polymerization of aziridine, KIO4-PEI reactions and CDI-PEI reactions.The products were characterized using FT-IR.The interaction of PEI-RAP with DNA was investigated using particle size analysis , Zeta-potential measurements and gel electrophoresis assay .MTT method was used to detect the cytotoxicity of PEI-RAP.PEI-RAP was used to deliver pEGFP in three tumor cells, MCF-7, Hela and SMMC-7721 cell lines.Results:PEI-RAP was prepared by polymerization of aziridine successfully , while the other two methods were failed .Agarose gel retardation assay suggested that PEI-RAP could bind and condense plasmid DNA efficiently .When the mass ratio of PEI-RAP to the pEGFP was 12:1,the size and the Zeta potential of the complexes were 156.61 nm and +26.89 mV.The vector PEI-RAP showed no cytotoxicity .The reporter protein assay showed that pEGFP delivered by PEI-RAP could express green fluorescent protein efficiently in three tumor cells in vitro . Conclusion:The prepared PEI-RAP copolymer could be a promising non-viral gene delivery vector.%目的：制备聚乙烯亚胺（ PEI）-黄芪多糖（ RAP）共聚物，探讨其作为非病毒基因载体的可行性。
可降解纳米载体及其制法和应用
本发明涉及一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用。
一、材料
1.小分子量聚乙烯亚胺（LWPEI）：选用分子量在500-2000之间的LWPEI，具有良好的生物相容性和可降解性。
2.交联剂：选用二硫代二丙酸（DTPA）作为交联剂，形成二硫键交联的大分子聚乙烯亚胺聚合载体。
3.可降解巯基β环糊精：通过巯基交换反应将可降解的巯基β环糊精引入到聚乙烯亚胺中，以改善聚乙烯亚胺的交联程度。
4.疏水药物和基因药物：根据需要输送的药物性质选择合适的疏水药物和基因药物。
二、制法
1.将LWPEI溶解在适当的溶剂中，形成溶液。
2.在溶液中加入交联剂DTPA，通过加热搅拌的方式使其充分反应，形成二硫键交联的大分子聚乙烯亚胺聚合载体。
3.将可降解巯基β环糊精与聚乙烯亚胺溶液混合，通过加热搅拌的方式使其充分反应，得到改性的聚乙烯亚胺溶液。
4.将疏水药物和基因药物分别溶解在有机溶剂和生理盐水中，然后将两者混合，得到药物混合液。
5.将改性的聚乙烯亚胺溶液和药物混合液混合，通过搅拌加热的方式使其充分反应，得到基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体。
三、应用
这种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体可以应用于各种需要同时输送基因和疏水药物的领域，如肿瘤治疗、抗病毒治疗等。
其优点在于能够提高药物的溶解性和生物利用度，改善药物的疗效和安全性，并且具有可降解的性质，避免了潜在的副作用和风险。
同时，这种纳米药物输送系统还可以通过静电作用搭载基因药物，并且可以通过化学药物与环糊精的相互作用进行药物包合，进一步提高了药物的输送效率和稳定性。
