密度梯度离心法-抽提脑突触体

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氯化铯梯度离心原理

氯化铯梯度离心原理密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。

密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）ph中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。

密度梯度离心原理当不同颗粒之间存在沉降系数差异时，在一定离心力的作用下，颗粒以一定的速度沉降，在密度梯度不同的区域形成分区。

密度梯度离心法密度梯度离心法 density gradient centrifugation method 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。

此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。

此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。

在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。

此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。

离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。

替来他明——唑拉西泮合剂对大鼠脑皮质突触体钙动力学的影响

泮合剂麻醉对大鼠大脑皮质突触体钙离子浓度的影响存在浓度依赖性。结果提示，替来他明一唑拉西泮合剂引起大鼠脑神经突
触前钙离子内流使突触体内钙离子浓度升高，促使突触囊泡释放抑制性神经递质可能是其产生全身麻醉作用的机理之一。关键词：替来他明；唑拉西泮；突触体；钙离子；麻醉中图分类号：￥８５９．７９１文献标识码：Ａ文章编号：０５２９ — ６００５（２０１３）０４ — ００６９ — ０２
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．ＫＣ１Ｗａｓｕｓｅｄａｓｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｉｍｕｌａｎｔｔｏｉｎｄｕｃｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｓｙｎａｐｔｏ — ｓｏｍｅｓ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇｆｌｕｏ一３，ａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｃａｌｃｉｕｍｉｎｄｉｃａｔｏｒ，ａｆｔｅｒｈｉｇｈ，ｍｅｄｉ — ｕｍａｎｄｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ — ｚｏｌａｚｅｐａｍｗｅｒｅａｄｄｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅ — ｚｏｌａｚｅｐａｍｉｎｄｕｃｅｄａｄｏｓｅ — ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇｅｎｅｒａｌａｎａｅｓｔｈｅｔ —

密度梯度离心法的原理解析

密度梯度离心法的原理解析密度梯度离心法是一种广泛应用于生物化学、分子生物学和医学领域的实验技术，用于分离和纯化生物大分子、细胞和次细胞结构。

该方法基于样品中不同组分的密度差异，利用离心力和密度梯度分离的原理来实现。

密度梯度离心法的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. 密度梯度制备：制备一个由多个密度层构成的梯度液体。

这些密度层是根据密度逐渐增加或减少排列的，通常由离心管或离心管中的夹层形成。

常用的密度梯度制备物质包括蔗糖、葡萄糖或碘化物等。

2. 样品处理：将待分离的样品加入到密度梯度中。

样品可以是生物大分子如蛋白质、核酸或多肽，也可以是细胞或次细胞结构如细胞核或线粒体等。

3. 离心分离：通过高速离心设备，施加离心力将密度梯度中的样品分离。

离心过程中，样品中的各个组分受到的离心力不同，根据其密度的差异在密度梯度中上下移动。

离心力越大，移动距离越远。

4. 提取和分析：离心分离后，不同密度层中的组分被提取出来，然后进一步进行分析。

这可以是采用分光光度法、蛋白质电泳、质谱分析或核酸杂交等技术。

通过分析不同密度层中的组分，可以获取样品中各种生物大分子或细胞结构的纯度和数量信息。

密度梯度离心法的优点是可以实现高分辨率和高效率的分离和纯化。

这是因为，不同密度的组分在离心力的作用下可以根据其密度差异均匀地分布在梯度液体中，从而实现准确分离。

该方法对样品体积和细胞大小没有特别严格的要求，适用于分离和研究多种不同类型的生物样品。

密度梯度离心法还可以用于研究细胞功能和结构的多个方面。

它可以用于分离不同亚细胞器如线粒体、内质网和高尔基体等，进一步研究它们的功能和组成。

该方法还可用于分离和纯化蛋白质复合物、染色体和病毒等，为进一步研究它们的生理和生化特性提供有力的工具。

总结和回顾上述内容，密度梯度离心法是一种基于样品中不同组分密度差异的分离和纯化技术。

它可以通过制备密度梯度、施加离心力和分析不同密度层中的组分来实现。

该方法具有高分辨率、高效率和广泛适用性的优点，可用于研究多种生物样品的分离和纯化，以及细胞和亚细胞结构的功能和组成研究。

密度梯度离心法抽提脑突触体

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⑤不能用刹车
密度梯度离心法抽提脑突触体
密度梯度离心
• 优点：
• ①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； • ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有
一定浮力密度差的颗粒； • ③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带
由于对流而引起混合。
• 缺点：
• ① 离心时间较长； • ② 需要制备梯度； • ③ 操作严格，不宜掌握。
isotonic solution • 7. identification and analysis
密度梯度离心法抽提脑突触体
脑突触体分离
1. 组织按1：10（1g:10ml）的比例投入冰冷的PH 7.4匀浆缓冲液，用匀浆器制备匀浆后移至离心管。
2. 离心 1,000g x 10 min，将上清液S1移至干净试管。 3. 离心 16,000g x 20 min，留取沉淀P2。 4. 将沉淀溶于10倍体积的0.32 mol / L 蔗糖液。 • 铺于蔗糖梯度上（0.8 mol / L【27%】和1.2 mol / L
【41%】各1.5ml）离心65,000g x 45min。收集 0.8mol/L与1.2mol/L蔗糖界面之间的致密物。 5. 用PBS溶液（pH7.4）洗去蔗糖，再离心16,000g x 30min，收集沉淀即为突触体。
密度梯度离心法抽提脑突触体
密度梯度离心法抽提脑突触体
密度梯度离心法抽提脑突触体
• ④硅溶胶：如Percoll • ⑤蛋白质：如牛血清白蛋白 • ⑥重水D2O • ⑦非水溶性有机物：如氟代碳等
密度梯度离心法抽提脑突触体
常用于等密度离心梯度材料
密度梯度离心法抽提脑突触体
等密度梯度离心
• ①离心时间要长

密度梯度离心法分离细胞器顺序

密度梯度离心法分离细胞器顺序
密度梯度离心法分离细胞器有多种不同方法和顺序，以下是其中两种常见的方法：
1.Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。

其分布由上到下依次为：稀释的血浆层和血小板层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。

2.Percoll分层液法：是连续密度梯度离心分离法，由上到下依次为：死细胞层和血小板层、血浆层、富含单核细胞组分层、富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。

Percoll分层液法是纯化分离单核细胞和淋巴细胞的一种较好方法。

Percoll密度梯度离心法分离中枢神经系统组织中的单个核细胞

Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法分离中枢神经系统组织中的单个核细胞
吕翠，冯金红，侯召华ຫໍສະໝຸດ 魏云波，韩婷婷（齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，环境与健康免疫研究室，山东济南２５００１４）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１８．０７．０２６文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０１８）０７－１０３０－０７中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２８１；Ｒ３２９２４；Ｒ３３１１２５；Ｒ７４４３；Ｒ７４５７摘要：目的建立快速分离小鼠中枢神经系统（ＣＮＳ）组织中单个核细胞的方法。方法以正常Ｃ５７ＢＬ／６小鼠、实验性变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）和阿尔茨海默病（ＡＤ）模型小鼠为研究对象，通过７０％～３０％Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法，获取小鼠脑组织和脊髓中单个核细胞，利用台盼蓝染色检测细胞存活率后，通过流式细胞术进一步分析细胞的表型特点。结果分离得到的单个核细胞存活率在９０％以上；流式细胞术分析结果表明，ＥＡＥ和ＡＤ小鼠中浸润到ＣＮＳ的淋巴细胞群比例明显升高，且介导炎症反应的Ｔｈ１和Ｔｈ１７细胞亚群比例明显升高，而具有免疫调节作用的Ｔｒｅｇ细胞亚群比例明显下降。结论采用７０％～３０％Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法从小鼠ＣＮＳ中分离的单个核细胞存活率高，细胞活性不受分离过程的影响，可进一步利用流式细胞术分析细胞的表型特征。此方法操作简单快速，适用于对ＣＮＳ淋巴细胞等单个核细胞的分析。
量［４］，但由于受到染色方法和检测手段的限制，这种方法不能同时分析淋巴细胞的多个指标，具有很大的局限性。流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）是一种先进的细胞定量分析技术，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从１个细胞中测得多个参数，与传统的荧光显微镜检查相比，具有参数多、速度快、精度高、准确性好等优点。因此，利用ＦＣＭ分析ＣＮＳ中的淋巴细胞无疑是当前较全面、高效的方法。近两年，在国内的研究中，这种方法开始被研究者采用，但在处理组织样本的过程中，多数采用简单的机械研磨或酶消化的方法来获得单个细胞［５－６］，而由于ＣＮＳ中细胞种类繁多，且淋巴细胞所占比例又较低，使得这两种方法获得的细胞纯度、活性和产量均较低，不利于进行流式细胞分析。因此，本研究在参照国外相关文献的基础上［７－８］，利用正常Ｃ５７ＢＬ／６小鼠、实验性变态反应性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｌｌｅｒｇｉｃｅｎｃｅｐｈａｌａｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）和阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）模型小鼠，通过Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法提取了小鼠脑组织和脊髓中单个核细胞，并利用ＦＣＭ进行了细胞表型的分析。旨在总结和建立一种方便、高效的从脑组织和脊髓组织中获取单个核细胞的方法，为ＣＮＳ中单个核细胞（包括神经元、神经胶质细胞、浸润的淋巴细胞等）功能的研究提供重要分析手段。１材料与方法１．１ＡＤ模型小鼠ＡＰＰ／ＰＳ１小鼠，Ｃ５７ＢＬ／６ＪＴｇＮ（ＡＰＰ／ＰＳ１）品系，合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１４－００１１，♂，２２～２４周，体质量（３０±２）ｇ，１０只，购于至善（北京）健康医学研究院有限公司，饲养于山东省科学院分析测试中心动物房。动物饲养完全遵照山东省分析测试中心实验动物管理委员会条例。动物房湿度为５０％～５５％，温度为（２３±２）℃，１２ｈ明暗交替采光，饲喂无菌普通鼠粮，自由饮水。本研究动物实验通过山东省分析测试中心医学伦理委员会审查和监督。１．２ＭＯＧ３５～５５诱导Ｃ５７ＢＬ／６小鼠ＥＡＥ模型１．２．１实验动物８～１０周龄♀Ｃ５７ＢＬ／６小鼠，合格证号：ＳＣＸＫ（京）２０１２０００１，体质量（２０±２）ｇ，１０只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。利用ＭＯＧ３５～５５多肽（ＭｉｍｏｔｏｐｅｓＰｅｐｔｉｄｅｓ公司）、弗氏完全佐剂（ｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ公司，Ｃａｔ＃７００１）和百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓｔｏｘｉｎ，ＰＴ）（ＬｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司，Ｃａｔ＃１８０）诱导ＥＡＥ模型。１．２．２Ｃ５７ＢＬ／６小鼠ＥＡＥ模型的建立ＥＡＥ模型的建立参照已报道的方法［９］。简述如下：ＭＯＧ３５～５５多肽用ＰＢＳ

江苏省苏州市2023-2024学年高三上学期期初调研测试生物

2023~2024学年第一学期高三期初调研测试生物学2023. 09一、单项选择题:共14 题,每题2分,共28分。

每题只有一个选项最符合题意。

1.下列关于细胞生命历程的叙述,正确的是A.多细胞生物的生长是细胞增殖的结果B.高度分化的细胞中不存在DNA复制C.衰老细胞的染色质固缩,细胞核缩小D.细胞凋亡时，基因发生了选择性表达2.高尔基体是有“极性”的,其顺面接受由内质网合成的物质并转入中间膜囊进一步修饰加工，反面参与溶酶体酶等蛋白质的分类和包装。

如图是发信号生在反面的3条分选途径。

下列叙述错误的是A.在高尔基体中间膜囊中会形成具有一定功能的蛋白质B.胰岛B细胞分泌胰岛素的过程属于是调节型分泌.C.若反面上的M6P受体数量减少会影响衰老细胞器的水解D.膜的流动性使顺面和反面的蛋白质种类和数量相同3.线粒体内膜是有氧呼吸第三阶段的场所,其上存在两条呼吸途径。

主呼吸链途径发生时，电子传递链释放的能量使H+通过蛋白复合体从基质移至内外膜间隙，然后H+驱动ATP合酶合成ATP;交替呼吸途径发生时，不发生H+的跨膜运输。

下列叙述的错误是A.合成ATP时H+顺浓度梯度由内外膜间隙进人基质B.主呼吸链途径中的蛋白复合体起载体蛋白的作用C.交替呼吸途径比主呼吸链途径产生更多的ATPD.乳酸菌细胞内不存在主呼吸链和交替呼吸途径4.下列关于构成细胞的元素和化合物的叙述,正确的是A.Mg是叶绿素的重要组分,缺Mg叶脉周围通常呈现黄色B.缺乏P时细胞中磷脂、核酸和A TP等物质的合成会受影响C.果糖是光合作用植物特有的，而半乳糖是动物特有的D.真核生物遗传信息的载体主要是由蛋白质和DNA组成的5.某家族患有甲、乙两种单基因遗传病,其中一种病的致病基因位于X染色体上。

研究人员通过调查得到了该家族的遗传系谱图(图1) ,然后对I1、II2、II3及III2的两对基因进行电泳分离,得到了不同的条带(图2)。

下列叙述正确的是A.甲病是伴X染色体显性遗传病，乙病是常染色体隐性遗传病B.条带①代表甲病的致病基因,条带③代表乙病的致病基因C.对II的两对基因进行电泳分离，所得的条带应该是①和③D.只考虑甲、乙两种遗传病，I4和II1基因型相同的概率是1/26.为研究DNA复制机制,科学家用荧光染料给Rep(解旋酶中驱动复制叉移动的结构)加上标记，以获知Rep相对于DNA分子的运动轨迹(如图)。

(整理)密度梯度离心法densitygradientcentrifugationmethod.

密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。

不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。

也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。

连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。

密度梯度离心又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法；原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。

常用的有蔗糖、甘油；密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度；操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。

离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。

若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。

利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA 以来，该法取得许多成果。

2010年北京市高考生物试卷(含解析版)

2010年北京市高考生物试卷一、本卷共5小题，每小题6分，共120分．在每小题列出的四个选项中，选出符合题目要求的一项．1．（6分）在家中用鲜葡萄制作果酒时，正确的操作是（）A．让发酵装置接受光照B．给发酵装置适时排气C．向发酵装置通入空气D．将发酵装置放在45℃处2．（6分）下列对生物细胞代谢活动的描述，不正确的是（）A．大肠杆菌在拟核区转录信使RNAB．乳酸菌在细胞质基质中产乳酸C．衣藻进行光合作用的场所是叶绿体D．酵母菌的高尔基体负责合成蛋白质3．（6分）以下依据神经细胞功能做出的判断，不正确的是（）A．膝跳反射弧中传出（运动）神经元的轴突较长B．膝跳反射弧中传入（感觉）神经元的树突较多C．突触前膜释放的递质（如乙酰胆碱）始终不被酶分解D．分泌肽类激素旺盛的神经细胞核糖体较多4．（6分）决定小鼠毛色为黑（B）/褐（b）色、有（s）/无（S）白斑的两对等位基因分别位于两对同源染色体上．基因型为BbSs的小鼠间相互交配，后代中出现黑色有白斑小鼠的比例是（）A ．B ．C ．D ．5．（6分）保护生物多样性是实现人类社会可持续发展的基础．下列对生物多样性的理解正确的是（）A．生物多样性的丰富程度与自然选择无关B．群落演替过程中的生物多样性逐渐降低C．物种多样性比较高的生态系统相对稳定D．遗传多样性较低的种群适应环境能力强　二、非选择题（共3小题，满分50分）6．（20分）在验证生长素类似物A对小麦胚芽鞘（幼苗）伸长影响的试验中，将如图1所示取得的切段进入蒸馏水中1小时后，再分别转入5种浓度的A溶液（实验组）和含糖的磷酸盐缓溶液（对照组）中。

在23℃的条件下，避光振荡培养24小时后，逐一测量切段长度（取每组平均值），实验进行两次，结果见如柱状图2。

请分析并回答：（1）生长素类似物是对植物生长发育有重要作用的一类化合物。

本实验中 mg/L 浓度的溶液促进切段伸长的效果最明显。

（2）振荡培养的目的是：①增加溶液中的以满足切段细胞呼吸的需求；②使切段与溶液成分接触更。

密度梯度离心法 density gradient centrifugation method

密度梯度离心法density gradient centrifugation method密度梯度离心法density gradient centrifugation method〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。

用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。

利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。

自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取得许多成果。

为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。

通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等以纯化为目的的情况，利用密度差，使用分离超离心机，采用预先制备好的蔗糖等的密度梯度。

〔2〕采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。

若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。

这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。

这是与〔1〕不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。

因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。

按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。

方法2：纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。

其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融 3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。

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5．浓度便于测定，如具有折光率。
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R-z离心法梯度介质
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①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原 ②无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、 NaCl、KBr等 ③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等 ④硅溶胶：如Percoll ⑤蛋白质：如牛血清白蛋白 ⑥重水D2O ⑦非水溶性有机物：如氟代碳等
脑突触体分离
1.
2. 3. 4. •
5.
组织按1：10（1g:10ml）的比例投入冰冷的PH 7.4匀浆缓冲液，用匀浆器制备匀浆后移至离心管。离心 1,000g x 10 min，将上清液S1移至干净试管。离心 16,000g x 20 min，留取沉淀P2。将沉淀溶于10倍体积的0.32 mol / L 蔗糖液。铺于蔗糖梯度上（0.8 mol / L【27%】和1.2 mol / L 【41%】各1.5ml）离心65,000g x 45min。收集 0.8mol/L与1.2mol/L蔗糖界面之间的致密物。用PBS溶液（pH7.4）洗去蔗糖，再离心16,000g x 30min，收集沉淀即为突触体。
常用于等密度离心梯度材料
等密度梯度离心
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①离心时间要长 ②可用角式转头或水平式转头
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③粒子密度相近或相等时不宜用
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④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度
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⑤不能用刹车
密度梯度离心
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优点：
①分离效果好，可一次获得较纯颗粒； ②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒； ③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
密度梯度离心
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速率-区带 (R-z)离心法
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等密度沉降
V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r
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V：是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒） d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。 σ：样品颗粒的密度（克/厘米3） s：密度梯度液的密度（克/厘米3） η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米· 秒） ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分 r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）当σ>S时 V>0即样品顺离心力方向沉降 σ〈 S时 V〈 0即样品逆离心力方向上浮 σ=S时 V=0即样品停止沉降或上浮，"稳定"在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率一区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。
凹凸梯度
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为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度，我们常常将梯度曲线在近梯度面处有较陡的斜率，也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度，与此相反，如果液面处梯度液足以支持（托住）样品，故考虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率（在高密度区）才能得到理想的分辨率，那么凹型指数曲线型梯度便能满足这个要求。
梯度形状的选择
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梯度形状：是指梯度介质没着离心管长轴方向的密度变化特征。 R-z离心：连续梯度：直线型的（等速梯度）光滑曲线型（凸指数、凹指数、凹凸指数）等密度离心：连续梯度自成梯度不连续梯度：阶梯形预成梯度
差速离心法
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优点：
操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。
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缺点：
①分离效果差，不能一次得到纯颗粒； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
沉降系数
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颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速率。用小写斜体s表示。等于每单位离心场的速度。或s=v/ω2r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r 是到旋转中心的距离，v是沉降速度。 1S=10-13秒 Eg：核糖体及其亚基在30S和80S之间
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离心机使用过程中的壁效应
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壁效应是正常的离心机离心管中由于细胞沉降方向与管壁不平行引起的，即使在甩开转子中也会导致细胞在离心管壁处聚集，当介质选择不当时，细胞与管壁接触就被吸附，增加了产生凝块的可能性，也会丢失沉降到离心管壁的细胞。在离心机固定角转子中用等密度法分离时，有时会产生严重的壁效应，在离心淘洗过程中，细胞同样会黏附到锥形腔上，黏附作用有时很强，如用牛血清蛋白作淘洗介质时，黏附到壁上的细胞不能用缓冲液冲掉。
亚细胞结构分离技术密度梯度离心法
离心技术
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差速离心 differential centrifugation
是指在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。
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密度梯度离心 density gradient centrifugation
是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
0.32M蔗糖匀浆1ml 0.8M蔗糖 1.5ml 1.2M蔗糖 1.5ml
Thank you
等速梯度
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在某一恒定离心转速时，样品颗粒在梯度中以恒定速度沉降。在做到等速沉降，必须使梯度和粘性力的增加与沿着离心半径方向的离心力增加相平衡，在这种梯度液中，颗粒的沉降距离与离心时间，离必力，以及颗粒本身的沉降多数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降分数，就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。
How to make sucrose density gradients
Beckman polyallomer tube
线性梯度制备系统SJK2
NATURE PROTOCOLS
2ml x 4
F3：0.55um
F4：0.64um
差速离心法
速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀
(a)细胞匀浆；(b)细胞碎片；(c)线粒体、过氧化物酶体、溶酶体； (d)微粒体、核糖体；(e)细胞液；(可溶性蛋白质及小分子生物)
离心力场
离心过程
离心时间
较短，一般为几小时到几小时
密度梯度材料的选择原则
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1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。 2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。
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3．不会对离心设备发生腐蚀作用。
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4．容易纯化，价格便宜或容易回收。
离心机的转子
（a）水平转子；（b）固定转角转子；（c）垂直离心管转子
试剂配方
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匀浆缓冲液 0.32 mol / L 蔗糖，1 mmol / L EDTA， 10 mmol / L HEPES-NaOH， PH 7.4。 0.8 mol / L 蔗糖液 0.8 mol / L 蔗糖，1 mmol /L EDTA， 10 mmol / L Tris Hcl， PH 7.5。 1.2 mol / L 蔗糖液 1.2 mol / L 蔗糖，1 mmol /L EDTA， 10 mmol / L Tris Hcl， PH 7.5。 Buffer A 1% Triton X-100， 20 mM HEPES， 100 mM Nacl， 2 mM EDTA， 5 mM NaF， 1 mM Na3VO4， 1 mM aprotinin， 1 mM leupeptin， 1 mM PMSF， PH 7.2 。 Buffer B 15 mM HEPES，0.15 mM NaCl，1% SDS，10 mM EDTA，1 mM DTT，5 mM NaF， 1 mM Na3VO4，1 mM aprotinin， 1 mM leupeptin， 1 m M PMSF， PH 7.5 。
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密度梯度离心
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速率-区带 (R-z)离心法
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等密度沉降
R-z离心法中梯度液的作用
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离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。（减少样品的扩散）
密度梯度离心法
R-z离心法分离原理介质以物质沉降速度的不同进行分离等密度沉降法以物质的浮力密度不同进行分离密度小，密度大，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖浓如CsCl, 密度为1～1.9g/cm3，度10%~67%，密度1～1.3g/cm3，自成连续梯度预制梯度，不连续强，离心速度高，使被分离物质易沉降样品向离心管底沉降稍强，速度相对低，使CsCl 形成梯度，建立沉降扩散平衡不论样品起始时在什么位置，离心中样品停留于介质的等密度部位较长，十几小时到数天
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缺点：
① 离心时间较长； ② 需要制备梯度； ③ 操作严格，不宜掌握。
蔗糖密度梯度离心 preparation of synaptosomes
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1. Preparation of sucrose gradients 2. Homogenization 3. Preparation of S1 fraction from brain tissue 4. Preparation of P2 fraction from brain tissue 5. Sucrose gradient fractionation procedure 6.Transfer of synaptosomes from sucrose to an isotonic solution 7. identification and analysis