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大学课程《细胞生物学》实验教案-叶绿体的分离与荧光观察大学课程《细胞生物学》实验教案叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
二、实验原理用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。
三、实验材料新鲜菠菜叶四、实验器材组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片，普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。
五、实验药品匀浆介质(0.25mol／L蔗糖、0.05mol／L Tris—HCi缓冲液，pH7.4)：称取85.55g蔗糖，6.05gTris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约42．5ml0.lmol／LHCI，最后蒸馏水定容至1000ml。
50％蔗糖溶液，15％蔗糖溶液。
0.35M氯化钠，0.01％吖啶橙六、实验步骤(一)叶绿体的密度离心l. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取5g，剪碎。
2. 加入预冷到近0'C的匀浆介质10ml，在研钵内低温捣碎o。
3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
4. 滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上1000r／min离心1min。
5. 在2ml离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液，注意要用滴管吸取15％蔗糖液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，50％蔗糖溶液加0.9ml，15％蔗糖溶液加0.5ml。
加液完后，可见两种溶液界面处折光稍有不同，这样密度梯度就制好了。
6．在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入0.3ml上清液。
7．离心8000r／min，20min。
8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带；用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。
还可在暗室内用荧光显微镜观察。
(二)菠菜叶手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1～2滴0.35mol／LNaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察，(1)在普通光镜下观察·(2)在荧光显微镜下观察(3)用同样方法制片，但滴加1～2滴0.01％吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖片后即可在荧光显微镜下观察。
蔗糖密度梯度离心是一种分离和纯化生物分子（如蛋白质、核酸等）的常用方法。
密度梯度离心利用溶液中不同密度的层级来实现分离，蔗糖是常用的密度梯度介质之一。
下面是蔗糖密度梯度离心的一般步骤：
1. 准备样品：将待分离的混合物样品准备好，通常是细胞裂解液、细胞上清液、蛋白质提取物等。
2. 制备蔗糖梯度：按照需要离心的生物分子的密度范围，选择适当的蔗糖浓度。
通常是在离心管中按体积比例混合蔗糖和缓冲液，制备成密度梯度。
3. 加样：将待分离的样品轻缓地加到蔗糖梯度上，以防混合。
4. 离心：将装有样品和蔗糖梯度的离心管放入离心机中，进行高速离心。
离心过程会使样品中的生物分子沉降到与其密度相匹配的蔗糖层级中。
5. 收集分离物：离心后，观察离心管中形成的密度梯度。
在离心管中，生物分子会沉降到不同的密度层级，形成分离的带状区域。
用适当的技术，如针管、泵或滴管，从密度梯度中收集分离的生物分子。
密度梯度离心是一种常用的生物分离技术，特别适用于分离不同密度的生物分子或细胞亚群。
在生物学、生物化学、免疫学等领域中
广泛应用，用于纯化和分析复杂的混合物。
实验一密度梯度离心法提取叶绿体探索新鲜菠菜叶片叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法，为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。
以叶片为材料，通过差速离心法制备粗叶绿体制品，分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体；提取叶绿体蛋白质，并进行电泳分析。
两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体，但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低，分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点，并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。
与Pecoll梯度离心法相比，蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。
1 实验目的掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
2 实验原理密度梯度离心就是通过扩散法用相同的缓冲液把梯度介质配成不同浓度的梯度液，采用上铺法（或下铺法）将密度最大的梯度液置于离心管的底部，而把密度最小的梯度液铺在梯度的最上层，然后经之一段时间（最好放在与离心管温度相同的温度下，一般为24小时），让密度梯度溶质扩散，最后形成一种较为平坦的梯级梯度。
然后在密度梯度介质液柱的顶部铺上一层样品溶液，在离心期间，样品中的各种亚细胞组分会按照它们各自的沉降速度，被分成一系列的样品区带离心。
这种离心方法的基本依据是利用样品颗粒或大分子的不同沉降速率从而达到分离的目的。
密度梯度的作用在于一方面支撑样品溶液，另一方面用来稳定区带以防离心期间梯度柱中产生的对流对它的破坏。
颗粒在梯度中移动的快慢。
取决于它们的大小、形状、密度和离心力以及梯度介质的密度和黏度。
在含有不同颗粒的混合样品中，各种颗粒的移动是相互独立的，因此在各种颗粒的S值相差很小的情况下也能达到分离目的。
用两种或若干种浓度的蔗糖制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
通过这种方法可粗略的分离叶绿体。
蔗糖密度梯度离心原理
蔗糖密度梯度离心是一种常用的生物化学分离技术，通过在蔗糖溶液中形成梯度，利用不同物质在梯度中的沉降系数不同的原理，实现生物大分子的分离和纯化。
本文将介绍蔗糖密度梯度离心的原理及其在生物化学研究中的应用。
蔗糖密度梯度离心的原理是基于物质在密度梯度中的沉降系数不同而实现的。
在蔗糖溶液中，溶液浓度逐渐增加，形成一个密度梯度。
当样品加载到密度梯度上方时，由于样品与梯度中某一层的密度相近，样品会停留在该层上。
这样，不同密度的生物大分子就可以被分离开来。
蔗糖密度梯度离心广泛应用于生物化学研究中，例如可用于分离细胞器、蛋白质、核酸等生物大分子。
在分离细胞器方面，可以通过蔗糖密度梯度离心将细胞质、线粒体、叶绿体等细胞器分离开来，为后续的研究提供纯净的样品。
在分离蛋白质方面，可以利用蔗糖密度梯度离心将不同密度的蛋白质分离开来，实现纯化。
在分离核酸方面，也可以利用蔗糖密度梯度离心将DNA、RNA等核酸分离开来，为分
子生物学研究提供纯净的核酸样品。
总之，蔗糖密度梯度离心是一种重要的生物化学分离技术，通过利用物质在密
度梯度中的沉降系数不同的原理，实现生物大分子的分离和纯化。
在生物化学研究中具有广泛的应用价值，为研究人员提供了一种有效的手段，帮助他们获得纯净的样品，推动生物化学领域的发展。
蔗糖密度梯度离心原理蔗糖密度梯度离心是一种常用的生物化学分离技术，通过蔗糖溶液中浓度梯度的建立，利用生物分子在不同密度梯度中的沉降系数差异，实现生物分子的分离和纯化。
本文将介绍蔗糖密度梯度离心的原理及其在生物化学实验中的应用。
蔗糖密度梯度离心的原理主要是利用蔗糖在水溶液中的密度梯度，使生物分子在不同密度梯度中有不同的沉降速度。
一般来说，蔗糖密度梯度离心需要使用离心管或离心管盒，首先在离心管中依次加入不同浓度的蔗糖溶液，然后将待分离的生物样品加入到蔗糖密度梯度上层，最后进行高速离心。
在高速离心过程中，生物分子会根据其密度在蔗糖密度梯度中沉降到相应位置，从而实现不同生物分子的分离和纯化。
蔗糖密度梯度离心在生物化学实验中有着广泛的应用。
首先，它可以用于分离和纯化细胞器。
由于细胞器具有不同的密度，因此可以利用蔗糖密度梯度离心将不同细胞器分离开来，从而得到纯净的细胞器样品。
其次，蔗糖密度梯度离心还可以用于分离和纯化蛋白质。
许多蛋白质具有不同的密度，因此可以利用蔗糖密度梯度离心将不同蛋白质分离开来，得到纯净的蛋白质样品。
此外，蔗糖密度梯度离心还可以用于分离和纯化病毒、DNA、RNA等生物分子。
总之，蔗糖密度梯度离心是一种重要的生物化学分离技术，它通过建立蔗糖溶液中的密度梯度，利用生物分子在不同密度梯度中的沉降速度差异，实现生物分子的分离和纯化。
在生物化学实验中，蔗糖密度梯度离心有着广泛的应用，可以用于分离和纯化细胞器、蛋白质、病毒、DNA、RNA等生物分子。
通过合理的实验设计和操作，蔗糖密度梯度离心可以为生物化学研究提供重要的技术支持，为科研工作者提供纯净的生物样品，促进生物化学领域的发展和进步。
实验一细胞膜通透性观察1.渗透作用：水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
2.溶血：将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
问答题1、为什么所有带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散？带电的物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性，因此带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散。
2、为什么把红细胞放入葡萄糖高渗液中也会发生溶血？将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，分子进入红血细胞，导致水的摄入，使细胞膨胀、破裂发生溶血。
3、为什么把红细胞放入低渗或某些等渗的盐溶液中会发生溶血？将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。
各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。
将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，分子进入红血细胞，导致水的摄入，使细胞膨胀、破裂发生溶血。
实验二线粒体和液泡系的超活染色与观察概念题1、超活染色:体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
2、液泡系：在细胞内，凡是由膜所包围的小泡或液泡，除线粒体、质体外，都属于液泡系，包括圆球体。
3活体染色:是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但又无毒害的一种染色方法。
4圆球体：用活体染色的方法，而染不上中性红的小泡被称为圆球体。
问答题（每题10分）1、为什么詹纳斯绿B能专一性地对线粒体染色？由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的基团。
蔗糖密度梯度离心原理
蔗糖密度梯度离心是一种常用的生物化学分离技术，它利用蔗
糖在水溶液中形成梯度的性质，对生物大分子进行分离和纯化。
本
文将详细介绍蔗糖密度梯度离心的原理及其在生物化学实验中的应用。
蔗糖密度梯度离心的原理是利用蔗糖在水溶液中形成梯度的性质。
当蔗糖溶液的浓度逐渐增加时，溶液的密度也会逐渐增大，形
成密度梯度。
生物大分子在这样的密度梯度中会受到离心力的作用，从而在离心过程中按照其密度不同而分布在不同位置。
这样，就可
以实现对生物大分子的分离和纯化。
蔗糖密度梯度离心广泛应用于生物化学实验中。
例如，可以利
用蔗糖密度梯度离心来分离和纯化细胞器，如线粒体、叶绿体和内
质网等。
此外，蔗糖密度梯度离心还可用于分离和纯化蛋白质、核
酸和病毒等生物大分子。
在分子生物学和生物化学研究中，蔗糖密
度梯度离心是一项非常重要的技术手段。
在进行蔗糖密度梯度离心实验时，首先需要制备蔗糖溶液，并
将其加入离心管中。
然后，样品溶液也加入离心管中。
接下来，将
离心管放入离心机中进行离心。
在离心过程中，生物大分子会在密度梯度中分布到不同位置。
最后，根据需要，可以采集不同位置的生物大分子，从而实现分离和纯化的目的。
总之，蔗糖密度梯度离心是一种重要的生物化学分离技术，它利用蔗糖在水溶液中形成梯度的性质，对生物大分子进行分离和纯化。
在生物化学实验中，蔗糖密度梯度离心被广泛应用于细胞器、蛋白质、核酸和病毒等生物大分子的分离和纯化。
掌握蔗糖密度梯度离心的原理和操作方法，对于开展生物化学研究具有重要意义。
实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体实验原理2、1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。
密度梯度区带离心法又可分为两种：（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。
在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。
此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。
离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。
梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1、28 kg/cm3和60％。
此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。
离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。
密度梯度离心法分离提纯叶绿体及叶绿体荧光染色课程名称：细胞生物学实验指导老师：成绩：__________________ 实验名称：密度梯度法分离提纯叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的学习密度梯度法，分离提纯菠菜叶绿体及叶绿体的荧光显微镜观察。
二、实验原理1、一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关；2、用两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，这样，可粗略地分离叶绿体。
三、实验用品1. 材料：新鲜菠菜叶2. 器材：光学显微镜、荧光显微镜、台式高速冷冻离心机，研钵、剪刀、托盘、玻皿等3. 试剂：（1）匀浆介质（0.25 mol/L 蔗糖、0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液，pH7.4）（2）50%蔗糖溶液，（3）15%蔗糖溶液四、实验步骤1. 洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去掉叶柄、主脉后，称取2~3g ，剪碎置研钵中。
2. 加入10ml 匀浆介质于研钵中，研磨成糜状。
3. 用双层纱布过滤捣碎液到烧杯中。
4. 将滤液倒于离心管内，500rpm 离心10min ，轻轻吸取上清液。
5. 先将50%蔗糖溶液0.4ml 加入离心管，再取15%蔗糖溶液0.4ml 小心沿管壁缓缓注入，不能搅动50%蔗糖液面，使两种溶液界面可见，制成密度梯度。
6. 加入0.4ml 上清液，严格平衡离心管后，用水平转头8000r/min 离心，20min 。
7. 用滴管轻轻吸出界面处的溶液，滴于载玻片上，盖上盖玻片后，显微镜下观察。
另装订线取部分溶液在暗室内用荧光显微镜直接观察。
蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体
一实验目的
掌握手工制作密度梯度的技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。
二实验原理
概述
密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。
此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。
密度梯度区带离心法又可分为两种：
（1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。
在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。
此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。
离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心
一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。
梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60％。
此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间
（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。
离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。
体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。
等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。
Cl），其密度可达等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（C
S
1.7g/cm3。
此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。
梯度溶液的制备
（1）梯度材料的选择原则。
作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。
②可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。
③不会对离心设备发生腐蚀作用。
④容易纯化，价格便宜或容易回收。
⑤浓度便于测定，如具有折光率。
⑥对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。
这些条件是理想条件，完全符合每种性
能的梯度材料几乎是没有的。
下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。
②无机盐类：CsCl （氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。
③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。
④硅溶胶：如Percoll。
⑤蛋白质：如牛血清白蛋白。
⑥重水。
⑦非水溶性有机物：如氟代碳等。
（2）梯度材料的应用范围
⑴蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。
⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。
主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。
⑶氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达 1.91g/ml。
由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。
⑷卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。
NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。
⑸Percoll：是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。
它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。
密度梯度区带离心法图解
图2-23 A速度沉降，B等密度沉降
收集区带的方法
（1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。
（2）有针刺穿离心管底部滴出。
（3）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。
（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。
三实验材料
新鲜菠菜叶。
四实验器材
组织捣碎器，高速冷冻离心机，普通离心机，离心管，Corex离心管，烧杯，漏斗，纱布，载玻片，盖玻片。
普通光学显微镜，剪刀，滴管，荧光显微镜。
五实验药品
匀浆介质（L蔗糖、L Tris-Hcl缓冲液，）
配制方法：称取85.55g 蔗糖，6.05g Tris，溶解在近400ml蒸馏水中，加入约 L的Hcl溶液，最后用蒸馏水定容至500ml。
60% 蔗糖溶液，50％蔗糖溶液，40% 蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15％蔗糖溶液配制方法：配制80% 的蔗糖溶液，然后按照下表进行稀释，分别配制成50%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液。
六实验步骤
洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去除叶柄、主脉后，称取50g，剪碎。
加入预冷到近0℃的匀浆介质100ml，在组织捣碎机上选高速档捣碎2min。
捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。
滤液移入普通玻璃离心管，在普通离心机上500r/min离心5min，轻轻吸取上清液。
在Polyallomer离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液 (或依次加入60%，40%，20%，15% 的蔗糖溶液)，注意要用滴管吸取15％蔗糖溶液沿离心管壁缓缓注入，不能搅动50％蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml （如果是四个梯度则每个梯度加6ml）。
加液完成后，可见两种溶液界面处折光率稍不同，形成分层界面，这样密度梯度便制好了.
在制好的密度梯度上小心地沿离心管壁加入1ml上清夜。
严格平衡离心管，份量不足的管内轻轻加入少量上清夜。
用甩平转头离心18000r/min，90min。
取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下观察。
还可在暗室内用荧光显微镜观察。
七结果与分析
结果如图所示，叶绿体在由两种不同浓度的蔗糖溶液组成的混合液中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；而在由四种不同浓度的蔗糖溶液组成的混合液中，叶绿体可形成两条带，聚集在密度梯度交界处。
沉降系数较大的细胞组份则
沉到离心管底部。
吸出叶绿体制成临时装片，暗室内用荧光显微镜观察，视野中可见到许多的小红点，这是由于叶绿体被荧光激发而产生的。
结果证明，该方法可以较好的分离出叶绿体。
八离心操作的注意事项
高速与超速离心机是生化试验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。
使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。
装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。
每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。
若要在低于室温的温度下离心时。
转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。
离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。
每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。
每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。
