大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。

因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。

在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。

如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。

有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II了。

这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。

要新从浓NaOH稀释制备0.4 N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。

事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

用了不新鲜的0.4N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。

中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。

（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。

（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。

因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。

）3.室温离心5,000rpm，5min。

弃上清，控干。

4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。

（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。

否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。

）5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。

（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。

加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）6.加7mL P3。

（P2和P3之间反应时间不要超过5min。

混匀后可见絮状沉淀。

该步若置于冰上，沉淀效果更好。

但位于室温的反应以足以达到实验需要。

）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。

7.室温（4度更好，但没有必要。

）离心，10,000 rpm, 5min。

8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。

加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于4度。

若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。

（分子克隆p35）9.室温离心10,000rpm 15min。

10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。

11.3,000 rcf离心3min，弃上清。

（可以不要非常完全控干）12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。

病毒大量制备和CsCl梯度离心纯化：1. 将293细胞铺于30-40个10cm dish，至细胞长满，每块板加入合适滴度的病毒（约107-108 pfu/ml）10 µl，感染细胞，待细胞全部病变后（4-7天），每块板中加入约500 µl（150ul）10% Nonidet P 40（NP40）以裂解细胞。

收集整个细胞裂解物，如果不是立即做CsCl纯化的话，可放在-80°C 冰箱。

2. 12,000 rpm离心10 min，弃细胞碎片，收集上清。

每100ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5M NaCl），冰上1 hr沉淀病毒。

3. 12,000 rpm离心上述混合物20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-Hcl，pH 8.0）。

4o C 7,000 rpm离心5 min，收集病毒悬浮液。

4. CsCl梯度的制备，用滴管轻轻加入2.0 ml的CsCl （密度1.40g/ml，溶剂同上）。

再加入3.0 ml 密度为1.30 g/ml 的CsCl 溶液。

再加入5 ml的病毒悬浮液。

20,000 rpm，室温离心2 hr。

收集密度在1.30-1.40g/ml 之间的病毒条带至透析袋中，透析袋用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min。

在透析缓冲液（将50g蔗糖，10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1,000 ml）中，4o C 透析过夜，中间换一次透析液。

收集病毒，测定病毒滴度。

三种密度的CsCl溶液配制（溶于灭菌20 mM Tris中, pH8.0），4℃保存。

欢迎下载，谢谢观看！资料仅供参考学习。

质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。

）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。

保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。

）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。

注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。

b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。

3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。

注：最后菌液的OD600值应为0.4。

由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。

4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。

注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。

（完整版）质粒DNA的提取、纯化与鉴定分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

二、实验原理：1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard 法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

第16卷 第4期 衡水学院学报 Vol. 16, No. 4 2014年8月 Journal of Hengshui University Aug. 2014收稿日期：2014-01-20作者简介：高英杰(1978-),男,河北饶阳人,河北师范大学生命科学学院实验师;赵红桃(1983-),女,河北行唐人,河北师范大学生命科学学院讲师,理学博士.DOI:10.3969/j.issn.1673-2065.2014.04.013优化的密度梯度离心法提取质粒DNA高英杰，赵红桃(河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)摘 要：质粒常被用做基因的载体．纯化质粒DNA 的方法可以分为3种：碱裂解法、煮沸裂解法和SDS 碱裂解法．这些方法可以纯化共价闭合环结构质粒DNA ，而大量获得高纯度的闭环结构质粒DNA 最经典方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法．该方法经过我们的实践与优化，减少了质粒中蛋白质和基因组DNA 的污染，提高了质粒的纯度和得率，所得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，效率高达60 % ~ 70 %，明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA ． 关键词：质粒DNA ；氯化铯-溴化乙锭；密度梯度离心法；拟南芥原生质体；转化效率中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1673-2065(2014)04-0049-03质粒DNA 是一种基因运载工具，在分子生物学、基因工程中有着极为广泛的应用，作为质粒载体有3个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点．而质粒DNA 的分离提取是分子生物学实验中最基本的工作．现在已经建立了多种提取纯化质粒DNA 的方法[1]，这些方法都包括3个步骤：培养细菌，收集和裂解细菌，纯化质粒DNA ．由于质粒的大小不同，收集质粒的方法应有所区别，大于15 kb 的质粒要用温和的方法．小于15 kb 的质粒可以用较剧烈的方法，有些大肠杆菌例如：HB101不能用加热的方法裂解．分离纯化质粒的方法各有利弊，根据不同的实验要求对所提纯质粒的纯度也有所不同，通常提出的质粒都存在一定量的RNA 和菌体染色体DNA 的污染[2]．纯化质粒DNA 最经典的方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法[3]，溴化乙锭可以插入DNA 碱基之间，溴化乙锭与线状DNA 和闭环DNA 结合有差别，在饱和溴化乙锭的氯化铯梯度溶液中线状DNA 的浮密度为1.54 g/cm 3，闭环DNA 的浮密度为1.59 g/cm 3，所以离心的结果是线状DNA 和闭环DNA 会停留在离心管的不同区域，从而将闭环DNA 分离纯化出来．氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心具体还可以分为连续梯度和不连续梯度．区别在于氯化铯溶液浓度在离心管中是否连续，如果是一个连续的浓度梯度，例如加入10 mg/mL 溴化乙锭的终浓度1.55 g/mL 的氯化铯溶液，经过超高速离心后会与DNA 、RNA 等形成一个连续的浓度梯度，闭环DNA 会悬浮于某一层，从而可以收集纯化．不连续梯度是将3个不同浓度的氯化铯溶液逐一加至离心瓶中形成3种不同浓度氯化铯，这3种浓度的氯化铯并不混合，而是形成独立的三层进行离心．我们采用连续浓度梯度的方法对质粒DNA 进行分离，最终优化出了一套纯化方法，用氯化铯溴化乙锭连续密度梯度法可以得到理想的DNA ，用于后续的实验．1 仪器与方法1.1 仪器日立超速离心机，型号CP100WX ，转头型号SRP83VT ．1.2 方法1) 配制试剂：溶液I(50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl ，10 mmol/L pH 8.0 EDTA)，溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH, 1 g/L SDS)，溶液Ⅲ(294 g/L 醋酸钾, 115 mL/L 冰醋酸)，EB 溶液(10 mg/mL)，10 × SSC(1.5 mol/L NaCl, 0.15 mol/L 柠檬酸钠)．2) 接菌到试管中，摇到混浊后扩培到1 L 2×YT 培养基中，37 ℃ 摇培过夜；3) 收集菌体，离心条件： 4 000 r/min ，4 ℃，20 min ，弃上清．加入25 mL 溶液Ⅰ，振荡重悬菌体；4) 加入50 mL 溶液Ⅱ并缓慢颠倒，冰上放置2 min ；5) 加入40 mL 溶液Ⅲ颠倒混匀，冰上放置5 ~ 10 min ；50 衡水学院学报投稿平台:/ 第16卷6) 离心：4 000 r/min，25 ℃，20 min．(可用玻璃棒轻轻打碎大块的沉淀，以获得更好的离心效果)．离心后将上清用折叠成漏斗状的miracloth(Millipore公司生产)过滤到新的250 mL离心瓶中(过滤白色不溶物，减少蛋白和基因组DNA污染)，加入等体积的异丙醇，在室温条件下沉淀15 min，静置后可以见到絮状沉淀；7) 离心：12 000 r/min，4 ℃，10 min，弃去上清，沉淀用75 %乙醇洗2次，每次洗后均需离心3 ~ 5 min，离心后弃去上清；8) 尽量吸干净上清，晾干沉淀，加入4 mL超纯水溶解，(可以用吹风机热风吹5 s即可)，加纯水后，若不易溶，可在37 ℃条件下促溶，由于质粒浓度大，溶解后比较粘稠有拉丝现象；9) 将4 mL质粒溶液转移到15 mL离心管中，加入5.05 g氯化铯颠倒混匀，并使其充分溶解(氯化铯溶解过程中会吸热，溶液会变凉，溶解后会产生絮状物浮在液面，溶液为乳白色)；10) 加入100 µL 100 mg/mL溴化乙锭(EB)溶液，混匀后离心：3 000 r/min，25 ℃，10 min，(液面上会有不溶物出现)；11) 将上清转移到超速离心管中，(不建议使用移液器转移，因为会有很多气泡出现．可以改用注射器吸取并将上清转移)．离心：65 000 r/min，25 ℃，16 h；12) 离心结束后，离心管中会出现3个明显的红色条带，最上一层为蛋白质，中间一层为缺口环状和线状DNA，最下一层条带为我们的目的条带闭环质粒DNA，将质粒约2 ~ 3 mL吸到15 mL离心管中(吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层)．然后加入10 × SSC平衡好的异戊醇，混匀，静置分层后将上层吸出弃去以便抽提溴化乙锭．13) 重复上一步骤直到质粒溶液透明无色，将上层的异丙醇去除干净；14) 将250 µL质粒溶液吸到2 mL离心管中，加4倍体积70 %乙醇，混匀后室温沉淀20 min；15) 离心：1 200 r/min，25 ℃，10 min，弃上清，70 %乙醇洗涤沉淀；16) 离心后将上清吸干，晾干沉淀，每管加入200 µL超纯水溶解．2 结果与分析由图1和图2可以看出，用氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法提取的质粒DNA纯度明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA，通过超微量紫外可见分光光度计测得质粒DNA质量浓度分别为500 ng/µL 和100 ng/µL．图1电泳图所示氯化铯密度梯度离心获得的琼脂糖凝胶电泳亮度明显高于普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳．对于后续实验，我们对拟南芥原生质体进行双分子荧光互补实验，图2所示用密度梯度离心法提取的质粒DNA可以达到60 % ~ 70 %的转化率，而普通的质粒小量抽提试剂盒用于拟南芥转化最好只有10 %的转化效率．A BA：密度梯度离心得到质粒DNA电泳图B：普通质粒抽提试剂盒得到质粒DNA电泳图图1 质粒电泳检测图1A为用氯化铯密度梯度离心获得的不同构建的质粒的琼脂糖凝胶电泳．图1B为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒的琼脂糖凝胶电泳．图1A一个融合YFP的基因，通过氯化铯密度梯度离心获得的高纯度的质粒，用于拟南芥原生质体的转化，转化效率约为60 % ~ 70 %，效率较高．图1B为用普通的质粒小量提取试剂盒得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，转化效率仅为10 %左右．第4期 高英杰，等 优化的密度梯度离心法提取质粒DNA 51A ：激光共聚焦下观察高纯度的质粒用于拟南芥原生质体的转化B ：普通的质粒用于拟南芥原生质体的转化图2 质粒质量鉴定-原生质体转化3 讨论影响氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法提取质粒DNA 因素及应注意的事项如下：1) 实验过程中用到氯化铯及溴化乙锭均为有毒试剂，必须戴手套，减少与皮肤直接接触．2) 离心的次数较多，还需用到超速离心，一定要在专业人员培训后方可操作，以免发生事故．3) 离心结束后，吸取质粒DNA 时一定要注意，吸前先将超速离心管的顶部扎一小孔进气，方便后续吸取质粒层．4) 对质粒DNA 要及时进行抽提，过夜或长时间放置都会导致EB 不容易抽提出来．5) 异丙醇有刺激性气味，进行异丙醇去处操作时最好在通风橱中进行．参考文献：[1] 李亮,蔡志强,赵希岳.细菌质粒DNA 的快速提取及检测[J].江苏工业学院学报,2003,15(3):30-31.[2] 黄南,程熠,连欢,等.改进溶液II 配方可提高质粒DNA 提取的质量及得率[J].华中科技大学学报:医学版,2008,37(6):816-818.[3] J ·萨姆布鲁克, D ·W ·拉塞尔.分子克隆实验指南:上[M].黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:53-58.Optimize the Extraction of Plasmid DNA with Method of Density GradientCentrifugationGAO Ying-jie, ZHAO Hong-tao(College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang, Hebei 050024, China)Abstract: Plasmid is often used as gene carrier. Method of purifying plasmid DNA can be divided into three types: the alkaline lysis method, boiling lysis and SDS alkaline lysis method. These methods can be used to purify covalently closed circular plasmid DNA, and the classical method of obtaining high-purity closed circular plasmid DNA is cesium chloride - ethidium bromide density gradient centrifugation. Through practice and optimization, we can reduce the pollution of protein and genomic DNA in plasmid and raise the purity and yield. The obtained plasmid is used for the conversion of arabidopsis thaliana protoplasts, and the conversion efficiency is as high as 60%-70%, which is significantly higher than that extracted with common plasmid extraction test kit.Key words: plasmid DNA; cesium chloride-ethidium bromide; density gradient centrifugation; arabidopsis thaliana protoplast; conversion efficiency(责任编校：李建明 英文校对：李玉玲)。

DNA提取过程中所用试剂的机理1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。

也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。

对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。

溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。

简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。

2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。

SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。

质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。

当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。