PPT医学课件密度梯度离心法取单个核细胞具体方法讲义

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细胞器的分离、纯化实验ppt课件

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实验方法
玉米黄化幼苗线粒体的分别〔整个过程坚持在0-4℃ 〕
1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中放置1小时
2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(分量体积比g:ml) 比例参与离心匀浆介质，快速研磨，留意先参与少许介质液，研碎后将余液参与
3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃
该法的优点是：①分别效果好，可一次获得较纯颗粒；②顺应范围广，既能分别具有沉淀系数差的颗粒，又能分别有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能坚持颗粒活性，并防止已构成的区带由于对流而引起混合。
缺陷：① 离心时间较长；②需求制备梯度；③操作严厉，不宜掌握。
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半径
方法：两点一线法
4. 试剂：
5.
① 线粒体离心匀浆介质。
6.
② 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。
7.
③ 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0
8.
④ 0.35mol/L NaCl
匀浆介质，普通为一定浓度的蔗糖溶液参与其它
9离. 子成分，可以维持亚细胞组分的浸透压。
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概述
离心机
！
制备性
分析性
普通离心机
细胞器的分别、纯化 — 细胞分级分别法
—秦川
实验目的
实验原理
实验用品
实验方法
运用范围： 1.病毒及亚细胞组份分别 2.蛋白梯度分别 3.脂蛋白分别 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯
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实验目的
• 认识离心机及学习离心机的运用方法 • 学习细胞器的分别及纯化的普通原理和
方法
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Percoll密度梯度离心教程 ppt课件

speed centrifugation. • If any significant evaporation occurs during autoclaving, the
volume should be replenished with sterile water so that the density is not affected.
for up to 6minths at -18℃ • Preformed gradients can be stored for weeks without a change
in gradient shape, provided that the gradient is sterile and is not physically disturbed • If stored at -18°C, gradients form upon thawing, necessitating a mixing of the contents of the bottle before use.
2020/12/12
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，
没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
7
Percoll – physical properties
• Percoll is available from GE Healthcare.
• Composition silica sol with nondialyzable polyvinylpyrrolidone (PVP) coating（由聚乙烯吡咯烷酮包裹的硅胶颗粒）

2新细胞分离幻灯

• 2、分离所得的单个核细胞可满足许多实验的需要，可用于细胞的分类鉴定，及各种功能，也可用于进一步纯化淋巴细胞。
• 分离单个核细胞技术 • 是进行细胞免疫试验的重要技术之一。
思考题
• 1、免疫细胞的分离还可用哪些方法？试 • 比较各种方法的特点。 • 2、试述如何从单个核细胞中除去单核细 • 胞。
6. 1500r/min离心10min，弃上清，重复洗涤两次。
• 7.末次离心后，吸尽上清后，将细胞悬液 • 体积用HanK液还原至1ml。
• 8.取10ul细胞悬液+90ul白细胞稀释液,混匀，取1滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，计算单个核细胞数。
• 9. 细胞活力检测 • 取2滴细胞悬液加1滴台盼蓝染液混匀，
• 如：
•
红细胞比重为
1.093
多形核白细胞比重 1.092
血小板比重约为 1.032
单个核细胞比重为１.076~1.090
• 利用一种比重介于1.075-1.092之间等渗的聚蔗糖-泛影葡胺（ficollhypaque）混合分离液做密度梯度离心，
• 离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。
加盖玻片，显微镜高倍镜观察。
四、结果判断
• 活细胞不着色，折光强， • 死亡细胞被染成蓝色，体积略膨大。 • 正常情况下，活细胞数应在95%以上。
五、方法评价
• 1、密度梯度离心法是一种分离单个核细胞的常用方法，具有速度快、纯度高的优点，细胞得率可高于80%，淋巴细胞纯度也可达90%以上，但仅用该方法不能除去其中的单核细胞。
4．离心后管内容物分为三层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和多形白细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。

离心技术与细胞器分离课件

概述
制备性普通离心机冰冻离心机
分析性分析性超速离心机
台式（或地台式高、超大容量冰高速冰冻超速冰冻面式）普通速离心机冻离心机离心机离心机
离心机
0.6-10万转/ 小于0.6万 0.6-2.5万 2.5-8万或
分以上
转/分学习交流PPT
更高
7
离心机的结构
• 离心机的主要部件为转头、主轴、电动机和传动装置、制动器、外壳和机座。
• 离心力（centrifugal force，Fc） • 相对离心力（relative centrifugal force，RCF）
学习交流PPT
3
离心力（centrifugal force，Fc）
• 离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动时受到的一个向外的力。
• 离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转半径，即：
• 4．加入 0.5% TritonX-100 2.5ml, 混匀，振荡后静置3分钟. 5000rpm离心5分钟，去上清。
• 5．加入1ml CSK buffer 振荡混匀,可以用枪头轻轻吹打沉淀使其溶解.
学习, 去掉未裂解的原生质体及裂解的细胞膜内溶物等大块杂质，收集过滤液。
• 9. 然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分层现象。
• 10. 3200g离心32分钟，溶液梯度层重新分布。
• 11.分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检。观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的形态特征。
学习交流PPT
19
试剂
K3匀0H．浆2PbOu4f,f0er.3：M5m山M梨M醇E, 0S.,36M.8m甘M露C醇a,C0l.24,％11PmVMP-

密度梯度离心法PPT课件

即： 1S= 10-13秒例：某物质的沉降系数是10-12秒
可写成：10× 10-13秒表示为：10S
如：核蛋白体为 70S
细胞及细胞内某些成分的沉降系数及其离心条件
名称沉降系数/S
RCF/g
转速（rpm）
细胞
﹥107
﹤200
﹤1500
细胞核 4×106-7
600~800
3000
线粒体 2×104~ 7×104
三、沉降系数（sedimentation coefficient，S） 1924年Svedberg对沉降系数下的定义：
颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。
若ω用2πn/60表示，则
式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离； X2为离心后粒子离旋转轴的距离。
S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13 秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒。
1994 Avanti J全球独有,利用可变磁阻驱动系统的高效离心。 1996 Optima XL-I拥有两种检测系统的分析型超速离心机。 1998 Optima MAX全球首台超过一百万离心力的台式超速
离心。 1998 ARIES全球独有可以自我修正平衡的转头。 2002 Optiam L-XP全球首先采用触幕式操作的超速离心机。 2004 Allegra X-12全球唯一可处理细胞培台式离心机。
1979 L8 Series全球首先采用微机控制及感应电机驱动的超速离心机系列。
1982 J21-M全球首台采用感应电机驱动的高速离心机。 1984 TL-100全球首台微量台式超速离心机。 1989 Optima Series 首先采用半导体制冷的驱动系统的超
速离心机系列。
1989 NVT创新的近垂直转头,可快速提纯DNA样品。 1991 Optima XL-A重新设计的分析型超速离心机。

离心原理PPT课件

一、步骤
1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
Ø 分离、纯化样品; Ø 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
.
2
一、离心的一般原理
颗颗粒的密度、形状、大小
粒
运液体介质的密度、粘度和重力场
动
的的强度
方
向悬浮颗粒在液体介质的扩散运动
和
速
颗粒越小，则沉降越慢，
度
扩散. 现象越严重。
3
1、离心力和相对离心力
离心力(centrifugal force，F)
.
9
离心机的构造
†转头 †驱动装置 †速度控制系统 †冷却装置 †真空装置 †光学检测系统
preparative
ultracentrifuge
.
10
离心转头
a 水平转头
b 角式转头 c 垂直转头
角度在14-40℃ 之间
.
11
实验中常用的是普通离心机（转速一般不高于4000rpm），用于分离血清和沉淀细胞、大的沉淀物等。
等特性的影响。
†预计沉降时间；
†测定物质相对分. 子质量。
6
3、沉降速度（sedimentation velocity, v）
沉降速度是指在离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离。

密度梯度离心法取单个核细胞具体方法 ppt课件

• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
9
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
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方法
密度梯度离心法取单个核细胞具体
11
方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
密度梯度离心法取单个核细胞
密度梯度离心法取单个核细胞具体
1
方法
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。
密度梯度离心法取单个核细胞具体
密度梯度离心法取单个核细胞具体
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方法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞

密度梯度离心课件

样品装载
将准备好的样品装入离心管中，注意样品装填均匀，避免出
现空洞或偏心。
平衡液加盖
将平衡液加盖到离心管中，注意液面高度与样品一致，以保证离心效果和实验结果的准确性。
离心条件设置
根据样品特性和实验目的，设置合适的离心速度、时间和温度等条件。
离心操作
启动离心机，按照设定的条件进行离心操作。
平衡液不稳定
原因
平衡液不稳定可能是由于平衡液的成分不正确或离心过程中的温度变化引起的。如果平衡液的成分不正确，会导致样品在离心过程中出现沉淀或聚集。而温度变化则会影响平衡液的密度，进而影响样品的分离效果。
解决方案
在选择平衡液时，应确保其成分与样品相似，并且具有稳定的密度。此外，在离心过程中应保持稳定的温度条件，以确保平衡液的密度不会发生变化。
原理
密度梯度离心原理基于样品中各组分的质量和离心力场中的浮力之间的关系。在离心力场中，样品中的各组分会根据其质量和浮力差异进行迁移，质量较大的组分会向离心管底部迁移，质量较小的组分会向离心管顶部迁移。
密度梯度离心的应用
01
02
03
分离细胞器
密度梯度离心可用于分离细胞中的各种细胞器，如线粒体、叶绿体、溶酶体等。
清洗去除杂质，提高样品纯度和离心效果。
平衡液配制
选择合适的平衡液
根据样品特性和实验目的，选择合适的平衡液，以保证离心效果和实验结果的准确性。
平衡液配置
按照平衡液配方和比例，准确配置所需浓度的平衡液。
平衡液过滤
过滤去除平衡液中的杂质和颗粒物，确保离心效果和实验结果的准确性。
离心操作
在离心过程中不得随意打开离心腔盖子，以免气流冲击导致安全事故。

密度梯度离心PPT课件

Centrifugation techniques: (1) Differential centrifugation (差速离心) (2) Density-gradient centrifugation (密度梯度离心)
-
4
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation
5、沿离心管壁小心缓慢地加入0.6 mL叶绿体匀浆。
6、离心：8000r/min，20min；叶绿体在密度梯度液中间形成带。
7、取叶绿体悬液1滴（10～15uL）滴于载玻片上，加盖玻片后观察。
观察一：在普通显微镜下观察叶绿体形态（油镜）；
观察二：在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光（蓝光）。
8、取一滴悬液在载玻片上，加1滴0.1%吖啶橙荧光染料，加盖玻片。
材料新鲜菠菜10三实验流程min4层纱布过滤于烧杯中8000rmin20min制片菠菜叶洗净去叶梗和主脉匀浆介质50蔗糖溶液04ml15蔗糖溶液04ml06ml10ul111新鲜的嫩菠菜叶洗净擦干后去除叶梗及粗脉称30g于100ml匀浆介质中放入组织捣碎机
实验四叶绿体的分离与观察
实验五植物细胞液泡系与细胞骨架的染色与观察
0.4mL
Байду номын сангаас
0.4mL
匀浆介质
制片镜检
10 uL
-
8000r/min 20min
10
实验步骤
1、新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于100mL 匀浆介质中，放入组织捣碎机。

最新94 小鼠脾脏胸腺单个核细胞分离ppt课件

• 烂鳃病病原菌平板划线分离：取病鱼鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片
的边缘，10分钟，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养基上划线。 • 肠炎病病原菌划线分离：
用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，取病鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。 • 赤皮病病原菌划线分离：
用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料，在普通营养琼脂培养基上平板划线。28℃培养24h。
度法 4. 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 5. 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞对低渗敏感
4
T细胞表面标志及其亚群
➢ CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
➢ CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL）
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他细胞。
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细菌分离与鉴定方法 —嗜水气单胞菌分离鉴定
分离方法细菌的生长状况观察氧化酶试验 AHM鉴别培养吲哚试验革兰氏染色法糖发酵试验脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）
分离方法
用途:
• 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。
普通琼脂平板
牛肉膏
3.0g
蛋白胨
10.0g
氯化氯化钠（NaCL）
5.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g
琼脂
15.0g

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• 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油；
• 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
密度梯度离心可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。
密度梯度离心法
• 也称“平衡密度梯度离心法”：用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
蔗糖密度梯度离心法
• 采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。这是与密度梯度离心法不同的一种沉降速度法，除了以相同的目的被用于通常的沉降速度法外，在能取出分离物这点上是有优越性的。因多采用蔗糖密度梯度，所以亦称为蔗糖密度梯度离心法。按同样原理，也可使用分析超离心机进行测定。
27.6克 31.2克 1000毫升
71.6克
实验所需试剂的配置方法
PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
分离活细胞的介质要求
• 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
• 2）PH中性或易调为中性； • 3）浓度大时渗透压不大； • 4）对细胞无毒。
密度梯度离心法应用
• 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或 precoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞（PBMC）。
• 目前比较常用ficoll密度梯度法。
10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤
器过滤除菌。４℃冰箱保存备用。
实验所需试剂的配置方法
三、磷酸缓冲液(PB)
原液: A液: 0.2M NaH２PO４溶液 NaH２PO４或NaH２PO４·2H２O 蒸馏水溶解至 B液：0.2M Ha２HPO４溶液 Ha２HPO４·12H２O 蒸馏水溶解至1000毫升各种不同PH值PB的配法
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 4个大方格内细胞总数
4
×104×2 （稀释倍数）
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法
6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法
一、步骤 1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。
胞数。 • 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的
增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
• 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
实验所需试剂的配置方法
一、Hank‘s液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法
NaCl ： 8.0 克
KCl ： 0.4 克
Na２HPO４·12H２O ： 0.12 克
KH２HPO４：0.06克
葡萄糖
1.0克
双蒸水
1000毫克
1％酚红液
2毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅
15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.69％聚蔗糖
24份
34％泛影葡胺
人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。无菌干燥注射器针头。血球计数板、显微镜、水平式离心机。碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法
三、注意事项 • 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 • 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单
个核细胞(PBMC)的实验方法
4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的 Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
活细胞百分率＝
活细胞数总细胞数
×100％
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达 80～90％，活细胞百分率在95％以上。
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)的实验方法
二、试剂和材料比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞
分离液)。 Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋) 10％小牛血清RPMI1640 0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。肝素用Hank‘s液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝
密度梯度离心法
• 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。
密度梯度离心法
密度梯度离心原理
• 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。