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荧光分光光度计的工作原理在激发阶段，样品被激发光源发出的激发光照射。
激发光通过光源产生，并经过单色器产生具有特定波长和能量的单色激发光。
这个单色激发光通过一个镜片聚焦到样品上。
在这个过程中，样品吸收光的一个部分，将其激发到激发态。
在发射阶段，样品的激发态荧光发出。
样品中的分子经过激发态转换成能量较低的荧光发射态。
发射光的波长较激发光长，且具有比激发光显著更低的能量。
发射光通过样品室中样品表面进入分光器。
在分光器内，发射光被分为不同波长的成分。
分光器的主要作用是将光按波长分散成不同的光束，方便探测器进行接收和处理。
分光器将不同波长的发射光分别引导到探测器上。
探测器接收并检测发射光的强度。
常见的探测器包括光电二极管（Photomultiplier Tube, PMT）和光电二极管阵列（Photodiode Array）。
探测器可以测量发射光的强度，并将结果传输到计算机上进一步处理和分析。
通过测量样品荧光发射光的强度和特定波长下的荧光发射光，我们可以确定样品中特定成分的存在和浓度。
具体而言，对于有荧光标记的样品，其荧光发射强度与其浓度成正比关系。
因此，我们可以通过测量发射光的强度来测定样品中特定成分的浓度。
1.高灵敏度。
荧光分光光度计能够检测非常微量的荧光发射光，因此对于低浓度样品的检测非常敏感。
2.宽波长范围。
荧光分光光度计能够检测多个波长范围内的光，因此适用于多种样品的测量。
3.选择性。
通过选择特定的激发波长和检测波长，可以选择性地测量特定组分的浓度。
4.可定量分析。
荧光分光光度计能够通过测量荧光发射光的强度来定量分析样品中特定成分的浓度。
总结起来，荧光分光光度计是一种基于样品在吸收光激发下发出荧光发射的光学仪器。
通过测量样品发射光的强度和特定波长下的发射光，我们可以确定样品中特定成分的存在和浓度。
荧光分光光度计具有高灵敏度、宽波长范围、选择性和可定量分析等优点，因此在科学研究和化学分析等领域得到了广泛应用。
ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计使用说明书美国Perkin Elmer公司王国强黄建权编译２００２年４月一、理论基础荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。
现将其原理简介如下：室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。
处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。
激发态不稳定，将很快衰变到基态。
若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。
每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。
图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。
图１荧光的能级图１、荧光的产生当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。
２、磷光的产生从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。
由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
图２磷光的能级图３、化学发光及生物发光的产生某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。
化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。
二、仪器简介１、仪器原理图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图用于测量荧光／磷光／发光的ＬＳ４５／５５是由图３所示的五个主要部件组成的：光源、激发光单色器、样品池、发光单色器及检测器。
分子荧光分析法发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一局部能量而产生的光谱称为荧光、磷光。
根据物质承受的辐射能量的大小与与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种：1. X射线荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内〔10-8s〕发射波长在X 射线X围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内〔10-8s〕，局部将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进展定性，根据谱线强度进展定量。
荧光的波长如与激发光一样，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；假如短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光〔或红外光〕照射时，也能发射波长在紫外、可见〔红外〕区荧光，根据其波长与强度可进展定性和定量分析，这就是通常的〔分子〕荧光分析法。
•根本原理一. 分子荧光的发生过程〔一〕分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性 M =2S +1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗〔反〕磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态〞；图1 单线基态〔A 〕、单线激发态〔B 〕和三线激发态〔C 〕当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即ÄS=0，如此激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态〞； 如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1 其多重性： M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态〞；“三线激发态〞 比 “单线激发态〞 能量稍低。
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计是一种用于测量物质荧光强度的仪器。
它利用激发光源激发样品产生荧光，然后测量样品发射的荧光强度。
荧光分光光度计的基本原理是荧光分光。
它首先通过一个激发光源产生激发光，该激发光与样品之间的相互作用激发样品分子的电子跃迁到高能级，从而产生荧光。
然后，荧光发射光由样品发射到光度计器件中进行测量。
在激发光源产生激发光的过程中，通常使用的光源有氘灯、汞灯和钨丝灯等。
其中，氘灯和汞灯主要用于紫外荧光的激发，而钨丝灯则用于可见光荧光的激发。
在荧光分光的过程中，需要使用一个光栅或光圈来分离发射光的不同波长组分，以便进行定量和定性分析。
光栅或光圈将荧光发射光分散成不同波长的光，并通过一个光学系统将其聚焦到光度计器件中。
光度计器件中通常采用光电二极管（Photodiode）或光电倍增管（Photomultiplier）来检测和测量荧光发射光。
光电二极管是一种直接转换光信号为电信号的装置，而光电倍增管则是一种通过电子倍增过程来放大光信号的装置。
在测量荧光强度时，需要将样品放置在荧光分光光度计的样品池中，通过调节激发光源的强度和样品与激发光之间的距离，可以控制激发光的强度和样品的激发程度。
然后，荧光发射光经过光栅或光圈分离后，由光电二极管或光电倍增管检测和测
量。
最后，荧光分光光度计会将测量到的荧光数据进行分析和处理，例如计算荧光强度、绘制荧光光谱等。
总之，荧光分光光度计利用激发光源激发样品产生荧光，再测量样品发射的荧光强度。
它的原理包括激发光源产生激发光、荧光发射光的分散和检测。
通过荧光分光光度计可以实现对样品荧光性质的研究和分析。
f98荧光分光光度计说明书概述1. 引言：概述：本文是《f98荧光分光光度计说明书》的概述部分。
本部分将简要介绍该说明书的结构、目的以及主要内容，以便读者更好地理解并使用该荧光分光光度计。
文章结构：本说明书主要包括引言、正文、f98荧光分光光度计的使用指南、常见问题解答和故障排除、结论和展望等几个部分。
引言部分为整篇文章的开头，为读者提供了对全文内容的基本了解。
目的：该说明书旨在向用户详细介绍f98荧光分光光度计及其工作原理、特点和功能。
同时，通过使用指南和常见问题解答，帮助用户正确操作仪器，并解决在实验过程中可能遇到的问题和故障。
接下来，我们将逐一介绍“1. 引言”中所列出的各小节内容。
2. 正文:2.1 什么是f98荧光分光光度计:f98荧光分光光度计是一种专门用于测量和分析样品中的荧光特性的仪器。
它通过激发样品中的荧光物质并测量其产生的荧光信号来获取关于样品的信息。
f98荧光分光光度计可以广泛应用于许多领域，如生物学、化学、医学等。
2.2 f98荧光分光光度计的工作原理:f98荧光分光光度计使用一定波长范围内的激发源来激发样品中的荧光物质。
这些激发源可以是可见或紫外线的灯管或激光器。
当样品被激发时，其中的荧光物质会吸收能量并重新辐射出以较长波长的荧光信号。
f98荧光分光仪通过检测和记录这些荧光信号的强度来测量样品中所含有的荧-4.3 数据处理与结果解读”: {不要使用markdown,不要包含网址亮物质。
该仪器还可以根据用户需求进行专门设置和调整，以提高测量的准确性和灵敏度。
2.3 f98荧光分光光度计的主要特点和功能:- 高灵敏度：f98荧光分光光度计具有极高的灵敏度，可以检测到样品中微量的荧光物质，并提供准确的测量结果。
- 宽波长范围：该仪器可在可见光至紫外线范围内进行测量，适用于不同波长下的荧光样品。
- 多种测量模式：f98荧光分光仪支持多种不同的测量模式，如荧光强度、寿命等，方便用户根据需求进行选择。
荧光分光光度法测定维生素B2的含量实验项目：荧光法定量测定维生素B2的含量实验目的：1.掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理含有荧光基团的化学物质维生素B2，在吸收光能而被激发以后发射荧光，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。
溶液中维生素B2被入射光（I0）激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度（I f）。
在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。
标准曲线法是取一定已知量的维生素B2的对照品与待分析试样溶液经过相同的处理后，将对照品配制成一系列浓度的对照溶液，测定其荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，以对照溶液浓度为横坐标绘制工作曲线，然后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度，由工作曲线求出维生素B2片试样中荧光物质的含量。
2.了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，基本操作荧光分光光度计的基本原理：由氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接收，然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光.。
荧光分光光度计的主要部件：①光源：为高压汞蒸气灯或氙灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
②激发单色器：置于光源和样品池之间的为激发单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品池和检测器之间的为发射单色器，常采用光栅为单色器，筛选出特定的发射光谱。
④样品池：通常由石英池组成。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器，可将光信号放大并转为电信号。
光源发射的激发光通过入射狭缝，经激发单色器分光后照射到被测物质上，发射的荧光再经发射单色器分光后用光电倍增管检测，并经信号放大系统放大后记录。
实验一 荧光分光光度计的使用一、实验目的1.通过实验强化对荧光分光光度法的理解。
2.了解荧光分光光度计的结构和使用方法。
二、实验原理荧光分析法适宜一定强度的激发光经第一单色器分光，选择最佳波长的光去激发液池内的荧光物质。
该物质发出的荧光可射向四面八方，但通过液池后的激发余光是沿直线传播的。
为了准确的进行荧光测定，检测器不能直接对准光源通常在液池的一边，与激发光成直角关系。
1. 荧光激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度)(F ，作λ-F 光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex λ，选用 ex λ可得到强度最大的荧光。
2.荧光发射光谱：选择ex λ作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 λ-F 光谱图称为荧光发射光谱。
荧光发射光谱中荧光强度最强的波长为em λ。
ex λ与 em λ一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三、仪器与试剂1.仪器：Cary Eclipse 型荧光分光光度计2.试剂：核黄素试剂四、实验步骤1.试剂配制：取适量核黄素加水配置成溶液。
将溶液加入荧光比色皿，再将比色皿放入荧光分光光度计中。
2.测定（1）荧光发射光谱打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Emission，则Excitation 固定，设为350nm。
再将扫描波长设定为400~600nm。
狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光发射光谱。
如下图。
（2）荧光激发光谱打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Excitation，则Emission 固定，设为370nm。
再将扫描波长设定为200~500nm。
狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光激发光谱。
如下图。
五、注意事项1.荧光比色皿四面均透光，用手拿取时应拿棱边，避免碰到透光面。
分子荧光分析法发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。
根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种：1. X射线荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
•基本原理一. 分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即ÄS=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
图2 分子吸收和发射过程的能级图2. 内转换：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。
（“ 内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）3. 外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用（如碰撞）而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称“外转换” 。
4.系间跨跃：当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的S—T 跃迁，这一过程称为“系间跨跃” 。
（含有高原子序数的原子如Br2、I2 的分子中，由于分子轨道相互作用大，此过程最为常见。
）5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为“荧光发射”。
如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8秒。
（它代表荧光的寿命）由于不同电子激发态（S）的不同振动能级相重叠时，内转换发生速度很快（容易），在10-11~1013秒内完成，所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发射荧光的几率大的多，因此，尽管使分子激发的波长有短（λ1）有长（λ2），但发射荧光的波长只有λ3（>λ1>λ2）。
6. 磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。
（磷光的波长λ4较荧光的波长λ3稍长，发生过程较慢 约 10-4~10s ）由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的，三线态寿命比较长，（10-3~10s 左右），若没其它过程同它竞争时，磷光的发生就有可能；由于三线态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。
因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。
总之：处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较快，则荧光发生几率高，强度大。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较慢，则荧光很弱或不发生。
（三）荧光量子效率：物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。
吸收激发光的光子数发射荧光的光子数=Φ (1) Φ 数值在 0~1 之间。
他的大小取决于物质分子的化学结构及环境（t 0c 、pH 、溶剂等）。
二. 激发光谱与荧光（发射）光谱1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F )，作F —λ光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex ，选用 λex 可得到强度最大的荧光。
2. 荧光光谱：选择λex 作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 F- λ 光谱图称为荧光光谱。
荧光光谱中荧光强度最强的波长为 λem 。
λex 与 λem 一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三. 荧光与分子结构的关系1. 分子结构与荧光具有 π、 π 及 n 、 π 电子共轭结构的分子能吸收紫外和可见辐射而发生 π -π* 或 n - π* 跃迁，然后在受激分子的去活化过程中发生 π*- π或 π*- n 跃迁而发射荧光。
发生 π - π* 跃迁分子，其摩尔吸光系数（å）比 n - π* 跃迁分子的大100—1000倍，它的激发单线态与三线态间的能量差别比 n - π* 的大的多，电子不易形成自旋反转，体系间跨越几率很小，因此， π - π* 跃迁的分子，发生荧光的量子效率高，速率常数大，荧光也强。
所以——只有那些具有 π- π 共轭双键的分子才能发射较强的荧光；π 电子共轭程度越大，荧光强度就越大（ λex 与 λem 长移）大多数含芳香环、杂环的化合物能发出荧光，且 π 电子共轭越长， Φ 越大。
2. 取代基对分子发射荧光的影响（1）（苯环上）取代 给电子基团，使 π 共轭程度升高 荧光强度增加：如–CH 3，–NH 2 ，–OH ，–OR 等。
（2） (苯环上）取代吸电子基团，时荧光强度减弱甚至熄灭：如： ，–COOH ，–CHO ， –NO 2 ，–N=N –。
（3）高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭。
如：Br ，I 。
3. 共面性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射。
例如：荧光素呈平面构型，其结构具有刚性，它是强荧光物质；而酚酞分子由于不易保持平面结构，故而不是荧光物质。
• 溶液的荧光强度一.荧光强度与溶液浓度的关系荧光是由物质吸收光能后发射而出，因此，溶液的荧光强度 F 和溶液吸收光能的程度以及物质的荧光频率有关：F ∝（I 0-I t ）→ F = K ’（I 0-I t ） (2) K ’ 为常数，取决于荧光物质的量子效率Φ，根据L —B 定律：bct I I ε-=100bc t I I ε-⋅=100所以 F = K’ ( I 0-I 010-εbc ) = K’ I 0 ( 1-10-εbc ) = K’ I 0 ( 1-e -2.303εbc ) (3) 将式中 e -2.303εbc 展开，得)!3)303.2(!2)303.2(303.2('320Λ++-=bc bc bc I K F εεε (4) 当 2.303εbC ≤ 0.05 时(浓度很小，溶液较稀时)，上式括号内第一项以后的各项均可忽略不计，所以：F = K’I 02.303εbc （5）对于一荧光物质的稀溶液，当 I 0 及 b 一定时，F = K·c （6）即在低浓度（2.303εbc ≤ 0.05）时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈（线性）正比关系。
二. 定量分析方法1. 工作曲线法：配制一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，同空白溶液，使样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F s 、F 0、F x ，然后作（ F s - F 0）— c 曲线，根据（F x –F 0)，从工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。
2. 直接比较法 ：如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定：F s¯F 0 = Kc S ， F x¯F 0 = Kc x s s x x c F F F F c ⋅-==0 （7） 三. 影响荧光强度的外界因素1. 激发光源：一般选用λex 最大但对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长，低 I 0 及短时间光照2. 温度：大多数分子在温度升高时，分子与分子之间，分子与溶剂分子之间的碰撞频率升高，非辐射能量转移过程升高，Φ 降低，因此，降低温度，有利于提高 Φ 。
3. 溶液的 pH ：带有酸性或碱性环状取代基的芳香组化合物的荧光一般都与 pH 值有关，有些化合物在离子状态时不显荧光。
为此，在用荧光强度进行定量测定时，严格控制溶液pH值是非常重要的。
4. 溶剂：对π—π共轭的荧光物质在极性溶剂中，∆E 减小↓→跃迁几率升高↑→Φ↑（波长长移）溶剂粘度↓→Φ↓5. 内滤：当荧光波长与荧光物质或其它物质的吸收峰相重叠时，将发生自吸收使荧光物质的荧光强度下降，此现象称“内滤” 。
6. 散射光的影响（溶剂的二种散射）（1）瑞利散射光：物质（溶剂或其它分子）分子吸收光能后，跃迁到基态的较高振动能级，在极短时间（10-12s）返回到原来的振动能级并发出和原来吸收光相同波长的光，这种光称为瑞利散射光。
（2）拉曼散射光：物质分子吸收光能后，若电子返回到比原来能极稍高（或稍低）的振动能级而发射的光称为拉曼散射光。
瑞利散射光波长与激发光波长相同，拉曼散射与激发光波长不同，而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关，因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分开。
