实验四 植物细胞悬浮培养与同步化

细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。

但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。

随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。

应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。

细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。

Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。

随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。

Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。

2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。

人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。

植物细胞悬浮培养一、实验目的及意义植物悬浮培养的细胞具有生长迅速、代谢均匀一致的特点，同时生长环境易于控制。

由于培养的细胞对外界的各种反应比较灵敏，植物悬浮培养细胞已成为代谢、生理生化、分子生物学研究的理想材料，同时还可用于突变体筛选、次生代谢产物的生产等领域。

通过学习，使学生了解和掌握植物细胞悬浮培养的原理和操作技术。

烟草（Nicotiana tubacum Linn.）为茄科经济作物，同时也是植物分子生理生化研究一种重要的模式植物。

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科药用植物，建立悬浮体系，对构建分离纯化其药用物质体系具有重要意义。

二、实验原理植物细胞悬浮培养（plant cell suspension culture）是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基中进行培养。

用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官中获得。

本实验所用的悬浮培养细胞来自疏松的愈伤组织。

植物细胞悬浮培养系统要求：①细胞培养物分散性好，细胞团较小；②细胞形状和细胞团大小均匀一致；③细胞生长迅速。

所采用的液体振荡培养具有以下重要作用：①振荡可以对培养液中的细胞团施加一种缓和的流变力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；②振荡有利于细胞在培养基中均匀分布，有利于培养基与细胞间的物质交换；③培养液的流动有利于培养基和容器内的空气通过气液界面之间进行气体交换，保证细胞呼吸所需的氧气，使细胞能迅速生长，同时也有利于二氧化碳的排除。

三、实验仪器与药品超净工作台，恒温振荡器（摇床），高压灭菌锅，培养室（培养箱），封口膜，油性标记笔，无菌蒸馏水四、实验材料烟草愈伤组织五、操作步骤与方法将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后冷却。

2.培养前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。

洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。

毕业论文(设计)中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (3)关键词 (3)Abstract (3)Key words (3)前言 (4)1.细胞悬浮培养的定义 (4)2.单细胞制备的方法 (4)2.1 机械法 (4)2.2酶解法 (4)2.3 愈伤组织诱导法 (4)3.悬浮培养的条件 (5)4.细胞初始培养 (5)5.细胞悬浮培养的类型 (5)5.1分批培养 (5)5.2连续培养 (6)6.悬浮培养细胞的同步化 (6)6.1 物理方法 (6)6.1.1 体积选择法 (6)6.1.2低温处理法 (6)6.2 化学方法 (6)6.2.1 饥饿法 (6)6.2.2抑制法 (6)7.规模化培养 (7)8.存在问题与前景展望 (7)8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)8.3前景展望 (7)参考文献 (8)致谢 (8)植物细胞的悬浮培养技术摘要悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。

但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。

随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.1 细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。