植物细胞悬浮培养技术PPT讲稿

[讲解]植物细胞悬浮培养现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。

比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。

基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。

正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。

总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。

第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养(in vitro culture)，就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。

?组织培养:是指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法。

?细胞培养:是指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。

?器官培养:是指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

二、体内、外细胞的差异和分化1.差异:细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。

因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。

实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

2.分化:体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。

细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞(小鼠红白血病细胞)在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。

进一步掌握细胞培养的操作技术。

实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。

为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。

从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。

2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。

3.首先观察培养板孔中培养液量。

用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。

再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。

4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。

5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。

吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。

6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。

7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。

8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。

9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。

二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。

一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。

毕业论文(设计)中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (3)关键词 (3)Abstract (3)Key words (3)前言 (4)1.细胞悬浮培养的定义 (4)2.单细胞制备的方法 (4)2.1 机械法 (4)2.2酶解法 (4)2.3 愈伤组织诱导法 (4)3.悬浮培养的条件 (5)4.细胞初始培养 (5)5.细胞悬浮培养的类型 (5)5.1分批培养 (5)5.2连续培养 (6)6.悬浮培养细胞的同步化 (6)6.1 物理方法 (6)6.1.1 体积选择法 (6)6.1.2低温处理法 (6)6.2 化学方法 (6)6.2.1 饥饿法 (6)6.2.2抑制法 (6)7.规模化培养 (7)8.存在问题与前景展望 (7)8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)8.3前景展望 (7)参考文献 (8)致谢 (8)植物细胞的悬浮培养技术摘要悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。

但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。

随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.1 细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

第二章(4)植物悬浮细胞培养技术1 单细胞的分离1.1由完整的植物器官分离单细胞1.1.1 机械法只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

1.1.2酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞。

1.1.3 机械法和酶解法比较机械法：①细胞不受到酶的伤害；②不用质壁分离；③细胞产量低；④细胞易破。

酶解法：①细胞受到酶的伤害；②要质壁分离；③细胞产量高；④细胞不易破。

1.2由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞1.2.1 诱导产生愈伤组织1.2.2 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；1.2.3 Subculture(将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物)。

2 Suspension culture2.1 概念是指一种在受到不断摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统。

2.2 特点2.2.1细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2.2.2能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

必须指出：悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。

2.3 起始悬浮液的制备2.4 悬浮培养的基本形式2.4.1分批培养（Batch culture）2.4.1.1 含义将细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。

在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。

它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。

2.4.1.2 特点①培养基体积固定；②当培养基中的营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长也停止；③必须适当搅拌。

2.4.1.3继代的方法和最佳时期继代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。

在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。

细胞的生长呈S形曲线。