下载文档原格式
SHH-N基因腺相关病毒表达载体的构建及其对神经干细胞增殖相关基因的影响刘东升;崔岩;申仑;杜延平;李桂林;王任直;王岩;张波【摘要】Objective To construct and identify SHH-N gene adeno-associated virus vector and to detect its effect on genes controlling to proliferation in neural stem cells(NSCs). Methods The neural stem cells in the subventricular zone of postnatal rat brain were used to collect SHH-N. pSNAV2. 0-CMV-SHH-N-IRES-EGFP was established by enzyme cutting and ligation , and then transfected packaging cell line 293T. Real time PCR was performed after SHH-N transfection of neural stem cells by rAAV-SHH-N-EGFP vector for 48 hours, SHH-N gene expression of infected cells after 2 week examined by fluorescence microscopy. Results ( 1 ) SHH-N gene was coincident with NCBI report. (2) pSNAV2. 0-CMV-SHH-N-IRES-EGFP expression vector and rAAV-SHH-N-EGFP vector was successful established and packaged. (3)Real time PCR was performed after SHH-N infection for 48 hour, induction of Nmyc and Glil in rAAV-SHH-N-EGFP-treated group was enhanced compared to control group. Conclusion rAAV-SHH-N-EGFP vector has been successfully established and it can stably express in neural stem cells. Forced expression of SHH-N in NSCs resulted in enhanced induction of Nmyc and Glil.%目的构建rAAV-SHH-N-EGFP载体并检测其对神经干细胞增殖相关基因影响.方法分离并培养大鼠脑室下区神经干细胞,提取RNA、反转录、PCR得到SHH-N的cDNA,克隆入pSNAV2.0-CMV-IRES-EGFP,包装得到腺相关病毒rAAV-SHH-N-EGFP,感染神经干细胞48 h后,采用实时定量PCR检测SHH信号通路下游相关基因的mRNA水平变化,并观察rAAV-SHH-N-EGFP载体在神经干细胞内的表达情况.结果 (1)克隆得到SHH-N基因,测序结果与NCBI报道序列一致.(2)成功构建pSNAV2.0-CMV-SHH-N-EGFP表达载体并鉴定,包装得到rAAV-SHH-N-EGFP.(3)实时定量PCR 分析rAAV-SHH-N-EGFP感染神经干细胞48 h后,rAAV-SHH-N-EGFP处理组较感染rAAV-EGFP的对照组,Glil和Nmyc的mRNA水平上调.(4)rAAV-SHH-N-EGFP可有效感染神经干细胞,在感染14 d后稳定表达SHH-N.结论成功构建rAAV-SHH-N-EGFP过表达载体并使其在神经干细胞内稳定表达.过表达SHH-N 可使神经干细胞内SHH信号通路相关基因Glil转录水平上调,并使细胞增殖相关基因Nmyc转录水平上调.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2011(031)003【总页数】6页(P291-296)【关键词】神经干细胞;SHH信号通路;Nmyc基因【作者】刘东升;崔岩;申仑;杜延平;李桂林;王任直;王岩;张波【作者单位】大连医科大学附属第一医院,神经外科,辽宁,大连,116011;大连医科大学附属第一医院,神经外科,辽宁,大连,116011;大连医科大学附属第一医院,神经外科,辽宁,大连,116011;大连医科大学附属第一医院,神经外科,辽宁,大连,116011;中国医学科学院北京协和医院,神经外科,北京,100730;中国医学科学院北京协和医院,神经外科,北京,100730;清华大学玉泉医院,神经外科,疼痛病区,北京,100730;大连医科大学附属第一医院,神经外科,辽宁,大连,116011【正文语种】中文【中图分类】R394.3音猬蛋白(sonic hedgehog,SHH)分泌蛋白在神经系统的发育时期中调节神经管腹侧的发育和脑背侧部神经管前体的增殖发育[1]。
转录因子在神经发育过程中的功能转录因子作为一类重要的调控蛋白，在神经发育过程中扮演着关键角色。
它们通过结合特定的DNA序列，调控基因的表达，从而影响神经细胞的增殖、分化和功能。
以下是关于转录因子在神经发育过程中的功能的详细探讨。
一、转录因子在神经发育中的调控作用转录因子通过多种机制参与神经发育的调控。
首先，它们可以作为细胞命运决定的关键因子，指导神经前体细胞向特定类型的神经元或神经胶质细胞分化。
例如，转录因子Neurogenin和NeuroD在神经前体细胞的分化过程中起到决定性作用。
其次，转录因子还参与神经细胞的增殖和凋亡过程，通过调控细胞周期相关基因的表达，影响神经细胞的数量和质量。
此外，转录因子还参与神经突触的形成和功能的调控，通过影响突触相关蛋白的表达，调节神经信号的传递和神经网络的构建。
1.1 神经前体细胞的分化调控神经前体细胞的分化是一个复杂的过程，涉及多种信号通路和转录因子的相互作用。
转录因子如Olig、Nkx2.2和Pax6在神经管的发育中发挥着重要作用，它们通过结合特定的DNA序列，激活或抑制下游基因的表达，从而影响神经前体细胞的命运。
例如，Olig家族的转录因子在少突胶质细胞的分化中起到关键作用，而Nkx2.2则参与了运动神经元的发育。
1.2 神经细胞增殖与凋亡的调控神经细胞的增殖和凋亡是神经发育过程中的两个重要环节。
转录因子如Id家族成员、Hes家族成员和Bcl-2家族成员在这个过程中发挥着调控作用。
Id家族转录因子通过与基本螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子相互作用，抑制其DNA结合活性，从而影响神经细胞的增殖。
Hes家族转录因子则通过Notch信号通路参与神经前体细胞的维持和增殖。
Bcl-2家族转录因子则通过调控线粒体途径，影响神经细胞的凋亡。
1.3 神经突触形成与功能的调控神经突触的形成和功能是神经网络构建的基础。
转录因子如CREB、c-Fos和Neurexin在突触可塑性中发挥着重要作用。
孤儿核受体Nurr1腺病毒过表达载体的构建摘要】目的：构建Nurr1腺病毒表达载体。
方法：设计带有酶切位点的Nurr1引物，采用PCR法从Nurr1基因载体中扩增目的基因，经限制性酶切后与pHBAd-EF1-MCS-GFP连接，转化感受态细胞。
验证后，与骨架质粒pHBAd-BHG共同转染293细胞，通过反复冻融传代提高病毒载体滴度。
结果：成功构建具有目的基因NURR1的过表达腺病毒载体。
【关键词】NURR1；过表达；载体【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）29-0126-02Nurr1属于孤儿核受体NR4A亚家族成员之一，被认为是生物体内调控发育、代谢、炎症和免疫等生物作用的转录因子，是迅速的早期反应基因，其表达水平很大程度上决定其转录活性。
一般认为，Nurr1能以单体形式与NGFI-B反应元件（NBRE，AAAGGTCA）结合，或以同二聚体形式与NR4A1反应元件结合，或以异二聚体形式与维甲类X受体（RXR）反应元件结合激活DNA的转录[1，2]。
研究表明Nurr1在细胞水平主要与增殖、凋亡和分化有关[3，4]。
本研究从Nurr1载体中扩增Nurr1表达序列，构建腺病毒过表达载体，为深入研究该基因在动脉粥样硬化中的调控机理打下基础。
1.材料方法1.1 材料HEK293细胞株（人胚肾细胞系）由购自国家实验平台共享服务平台；Nurr1基因载体购自上海恒大生物科技有限公司，载体pHBAd-EF1-MCS-GFP购自Hanbio，大肠埃希菌株DH5α购自Invitrogen，限制性内切酶和DNA ladder Marker购自Fermentas Inc.，One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，小量以及大量质粒核糖核酸提取试剂盒购自康为世纪，凝胶回收试剂盒购自Axygen Inc.，琼脂粉，高级琼脂糖等购自上海生工。
DMEM 购于Hyclone公司；LipofiterTM转染试剂购自汉恒生物；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA购于Hyclone公司；60mm细胞培养皿、10cm细胞培养皿、96微孔培养板、一次性移液管（5ml和10ml）、15ml及50ml离心管均购自NEST公司；双抗购自invitrogen公司；滤膜滤器购自Millipore Inc。
腺病毒介导ＮＵＲＲＩ基因转染Ｃ１７．２神经干细胞移植治疗实验性局灶性脑梗死硕士学位论文腺病毒介导ＮＵＲＲｌ基因转染Ｃ１７．２神经千细胞移植治疗实验性局灶性脑梗死专业：神经病学研究生：黎祥喷导师：邢诒刚教授摘要脑梗死（ｃｅｒｅｂｒａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＣＩ）又称缺血性脑卒中（ｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉｃｓｌｘｏｋｅ，ＣＩｓ），是指由于脑局部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化。
年发病率约２００／１０万。
在发展中国家，脑血管疾病（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓ，ＣＶＤ）——主要是脑梗死——己经成为致死致残的最主要原因之一。
除了脑梗死超早期应用溶栓治疗有可能成为一种有前途的治疗方法外，目前各种脑保护治疗方案，并没有被证实具有确切和明显的临床疗效。
因此发展一种有效的，能减轻脑梗死幸存者神经功能和认知功能缺损的治疗策略很有必要。
神经移植（ｎｅｕｒａｌⅡ龃ｓｐｌａＩｌｔａＩｉｏｎ）和基因治疗（ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）正是深受关注、极具前途的治疗策略。
１．神经移植治疗脑梗死的现状神经移植作为一种神经系统疾病的可能治疗方式，大约从２５年前开始得到广泛研究，在动物模型研究和临床研究上都取得了不同程度的成功。
使用的供体组织包括有胚胎组织、肿瘤来源细胞系和干细胞等。
胚胎组织移植因为受限于胎龄、胚胎来源、论理学等问题，难以为继；肿瘤来源细胞系由于难以确保安全性而使其应用大受限制。
所以，近１０几年来研究的热点主要集中在神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）及祖细胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ）对脑梗死等中枢神经系统疾病的治疗潜能上。
ＮＳＣｓ是一类原始的、具有多分化潜能和自我更新能力的细胞。
应用ＮＳＣｓ治疗脑梗死主要有三种方法：一是通过投入外源性细胞因子等方法增强自身的ＮＳＣｓ激活，促进其移行、增殖及分化；二是将ＮＳＣｓ在体外增殖分化后进行移植；三是将ＮＳＣｓ作为转基因治疗的载体。
miR-99a对帕金森病细胞模型作用研究张敏;刘国荣【摘要】目的:探讨miR-99a对帕金森病细胞模型的体外作用.方法:利用MPP+诱导的PC12细胞模型,采用Real-time PCR和Western blotting方法研究miR-99a及其靶基因FZD5的表达水平,采用CCK-8方法检测细胞的存活能力.结果:MPP+显著抑制PC12细胞存活,并下调miR-99a的表达.过表达miR-99a可以显著缓解MPP+对PC12细胞存活的抑制作用.MPP+通过调控miR-99a/FZD5轴抑制PC12细胞的存活.结论:在帕金森病细胞模型中,miR-99a具有缓解MPP+引起的PC12细胞存活抑制的作用,而该作用是通过靶向并下调FZD5来实现的.【期刊名称】《包头医学院学报》【年(卷),期】2018(034)011【总页数】3页(P87-89)【关键词】帕金森病;MPP+;miR-99a;FZD5;PC12细胞【作者】张敏;刘国荣【作者单位】包头市中心医院,内蒙古包头 014040;包头市中心医院,内蒙古包头014040【正文语种】中文帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，多发于老年人，严重影响老年人的生活质量。
帕金森病最主要的病理学改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡[1]。
现在帕金森病的治疗方式主要为对症治疗，缺乏有效的预防和其他治疗方式，因此研究帕金森病的发病机制进而探索新的治疗方式具有非常重要的意义。
1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy-4-phenylpyridinium，MPP+)是一种常用的多巴胺神经元毒素，其可以引起PC12细胞中活性氧水平的升高、细胞凋亡和线粒体功能丧失，常用于帕金森病研究的体外细胞模型[2-3]。
miRNA是一类长度为19-24个核苷酸的非编码RNA，其通过结合靶基因的3’UTR引起mRNA降解或蛋白质翻译抑制，最终引起靶基因下调[4]。
研究发现，miR-181c能够通过靶向降低BCL2L11，促进MPP+处理下PC12细胞的存活，并抑制MPP+引起的细胞凋亡[5]。
构建携带 nurr1基因的慢病毒表达载体及转染人脐带间充质干细胞的实验研究胡棠生;简雯;蔡婵;涂怀军【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(056)002【摘要】目的：构建携带核受体相关因子-1（nuclear receptor related factor 1，nurr1）基因的慢病毒表达载体，并测定其对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的感染效率。
方法使用PCR 技术克隆目的 nurr1基因，将 nurr1基因重组到慢病毒表达载体，筛选阳性克隆，将携带 nurr1基因的质粒用脂质体介导法转染入293T 细胞，获得携带nurr1基因的重组慢病毒，再用重组慢病毒感染 hUCMSCs，通过荧光显微镜及流式细胞术检测其感染效率。
结果成功构建了携带 nurr1基因的重组慢病毒载体，并获得病毒滴度为2×108 TU·mL－1的慢病毒浓缩液。
成功转染重组慢病毒的hUCMSCs 可表达绿色荧光蛋白，当病毒感染复数（mul-tiple of infection，MOI）值为60时转染效率最高为90．8％。
结论携带 nurr1基因的慢病毒载体成功构建并成功转染入 hUCMSCs，当 MOI 值为60时转染效率最高。
【总页数】4页(P35-38)【作者】胡棠生;简雯;蔡婵;涂怀军【作者单位】南昌大学第二附属医院神经内科，南昌 330006;南昌大学第二附属医院神经内科，南昌 330006;南昌大学第二附属医院神经内科，南昌 330006;南昌大学第二附属医院神经内科，南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R-331【相关文献】1.携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定 [J], 谭刚;王家瑞2.携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化 [J], 李世龙;刘毅;惠玲;3.携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化*◆ [J], 李世龙;刘毅;惠玲4.人硫氧还蛋白基因重组慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究 [J], 王明辉;徐曼;张斌;陈虎5.构建携带nurr1基因的慢病毒表达载体及转染人脐带间充质干细胞的实验研究[J], 胡棠生;简雯;蔡婵;涂怀军;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Nurr1基因与帕金森病的相关性研究的开题报告一、研究背景帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为肌肉僵硬、不由自主的震颤和运动迟缓等症状。
该疾病是由于多种因素的共同作用导致的，其中基因因素是一个非常重要的因素。
近年来，研究发现Nurr1基因可能与帕金森病的发病有一定的关联，因此开展相关研究具有重要的理论和应用价值。
二、研究目的本研究旨在探究Nurr1基因与帕金森病之间的相关性，分析Nurr1基因在帕金森病发病机制中的作用和意义，为预防和治疗帕金森病提供理论依据和参考。
三、研究内容和方法1.研究内容：（1）收集与帕金森病和Nurr1基因相关的相关文献，对Nurr1基因与帕金森病之间的相关性进行综述和归纳。
（2）通过对大量帕金森病患者和正常人群的基因测序，探究Nurr1基因的表达水平和基因型在人群中的分布情况。
（3）通过小鼠模型的构建，研究不同类型的Nurr1基因表达对小鼠运动功能的影响，并探究其与帕金森病模型的关系。
2.研究方法：（1）文献综述法：收集Nurr1基因和帕金森病相关的文献，系统整理和归纳相关知识。
（2）基因测序法：采集帕金森病患者和正常人群的DNA样本，通过基因测序技术对Nurr1基因进行测序，分析基因在人群中的表达水平和基因型分布情况。
（3）小鼠模型法：建立小鼠帕金森病模型，通过基因敲除或基因转染的方式，改变Nurr1基因在小鼠体内的表达水平，检测小鼠的运动功能。
四、预期结果本研究将从不同角度探究Nurr1基因与帕金森病之间的相关性，以期得到以下结果：（1）进一步明确Nurr1基因在帕金森病发病机制中的作用和意义。
（2）探讨Nurr1基因的表达差异和基因型分布对帕金森病发病的影响，为预防和治疗帕金森病提供理论依据和参考。
（3）揭示Nurr1基因与帕金森病的关联性，为研究帕金森病的病理生理机制提供新的理论支持。
五、研究意义本研究将深入探究Nurr1基因与帕金森病之间的相关性，有以下几点意义：（1）揭示Nurr1基因在帕金森病发病机制中的作用和意义，为开发帕金森病的预防和治疗方案提供理论依据。
中山大学博士学位论文构建含ＮＵＲＲＩ基因的腺病毒对Ｃ１７２神经干细胞调控厦其对帕金森病治疗构建含ＮＵＲＲｌ基因腺病毒对Ｃ１７．２神经千细胞调控及其对帕金森病治疗专业神经病学博士研究生李庆军指导教师邢诒刚摘要帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ＳＤｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）又名震颤麻痹（ＰａｒａｌｙｓｉｓＡｇｉｔａｎｓ），是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，６０岁以上人群患病率为１０００／１０万，并随着年龄增长而增高，两性分布差异不大。
１ＰＤ的研究现状ＰＤ的病理改变主要位于黑质，无论是原发性或继发性ＰＤ，黑质几乎都必受累。
ＰＤ时，黑质、纹状体内ＤＡ（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）含量显著减少，ＤＡ的抑制作用降低，而乙酰胆碱（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ。
Ａｃｈ）含量相对增加，两者动态平衡遭到破坏，从而出现ＰＤ症状。
因此设法补充体内丢失和保护残存的多巴胺能神经元，使其与所支配的脑区内神经元重建有效的突触联系，恢复原来多巴胺能神经支配，是治疗ＰＤ的最佳途径。
２神经干细胞治疗ＰＤ的研究现状自从帕金森病的病理和生化比较明了后，许多学者就开始摸索细胞移植治疗帕金森病可能性。
初期报道有效的肾上腺髓质细胞移植现已废弃。
胚胎多巴胺能细胞移植因胎龄限制、胚胎来源、论理学等问题，难以为继。
近年来神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＮＳＣ）的研究进展迅速。
神经干细胞具有未成熟的特性、表型可塑性、免疫原性低和可复制等特性。
用外源基因对体外培养的神经干细胞进行调控后，再移植到已有退行性的病变黑质内，即有可能最大程度的促使神经千细胞分化为与移植部位相适应的神经元。
！！查兰堡圭兰竺竺圭塑塞鱼！！！竺！苎里塑壁堕童翌！！！！塑兰三塑璺塑笙墨苎翌塑垒查堕塑生３基因治疗ＰＤ的研究现状国内外对ＰＤ进行的基因治疗，已取得一定效果。
帕金森病患者脑合成ＤＡ所需的ＴＨ、ＡＡＤＣ酶活性明显不足，因此提供外源性ＴＨ和ＡＡＤＣ基因有助于增加ＤＡ合成。
但单纯补充ＴＨ、ＡＤＣＣ等基因治疗和某些保护多巴胺能神经元的神经营养因子基因治疗不能阻滞ＰＤ进展，也没解决多巴胺能神经元减少这一根本问题。
ＮＵＲＲｌ属于核受体超家族，几乎完全表达在中枢神经系统内。
基因敲除实验表明，ＮＵＲＲｔ与多巴胺能神经元发生、发展和生存关系密切。
随着年龄老化，ＮＵＲＲｌ基因表达逐渐减少，黑质内ＴＨ基因表达随之下调，两者表现为随年龄增长而下降的一致性。
因此构建高效表达Ｎｕｒｒｉ载体，诱导神经干细胞分化后进行体内移植是治疗ＰＤ的理想选择。
然而既往构建的含有ＮＵＲＲＩ质粒载体，受操作技术、插入基因片断、外源基因表达和转染效率等限制，影响了对ＮＵＲＲＩ基因进一步研究。
重组腺病毒载体．有插入外源基因片段大、转染和表达效率高、带有标记基因等优势。
因此本课题组构建Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒后，观察其在体外对Ｃ１７．２神经干细胞诱导分化和两者结合体内移植后对ＰＤ的治疗效果。
第一部分Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒载体的构建和鉴定１实验方法将ｐＭｎ—ＮＵＲＲＩ测序后用ｔｔｆｎｄ［１Ｉ和Ｙｂａ１双酶切回收，与用同样酶切回收的ｐａｄｔｒａｃｋ－ＣＭＶ质粒连接为ｐａｄｔｒａｃｋ—ＣＭＶ—ＮＵＰ讯Ｉ，连接质粒用Ｐｉｎｅ１酶切回收目的片段后与ｐＡｄｅａｓｙ共转化大肠杆菌ＢＪ５１８３、ＤＨ５ａ，鉴定后用忍ｃ』酶切回收转染ＨＥＫ２９３Ａ细胞进行包装。
约１０天细胞病变比较完全和细胞内绿色荧光较强时，回收、反复冻融ＨＥＫ２９３Ａ细胞，离心回收上清。
电观察病毒颗粒，ＰＣＲ鉴定，病毒滴度测定。
２结果测序示ｐＭＤ—ＮＵＲＲｌ质粒序列正确，ＰＣＲ鉴定ｐａｄｔｒａｃｋ—ＣＭＶ—ＮＵＲＲｌ穿梭质粒、ｐＡｄｅａｓｙ～ＣＭＹ－ＮＵＲＲＩ整合质粒和重组腺病毒基因组内包含ＮＵＲＲＩ基因。
细胞病变、细胞内荧光表达和电镜示病毒颗粒包装成功，ＰＣＲ结果示病毒基因组内有ＮＵＲＲｌ基因，病毒滴度约为Ｔｔｌ×１０“ｐｆｕ／Ｌ。
第二部分Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒在Ｃ１７．２神经干细胞内的表达和其保护作用１实验方法将Ｃ１７．２神经干细胞在３７。
Ｃ，５％Ｃ０２条件下培养。
Ｃ１７．２神经干细胞爬片后固定行ｘ—ｇａｌ染色、免疫组化检测ｎｅｓｔｉｎ和原位杂交检测ＮＵＲＲｌｍＲＮＡ。
将Ｃ１７．２神经干细胞接种在２５ｃｍ２培养瓶中，分对照组Ｉ组和试验组ＩＩ、ＩＩＩ、Ⅳ组，每组ｌＯ只，其中５只加有含Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒０．５ｍｌ（ＭＯＩ＝２０）；对照组加入生理盐水，试验组加入６－ＯＨＤＡ，浓度分别为２０、４０、６雎咖ｌ，孵育６ｈ后收集细胞，流式细胞仪检测细胞坏死和凋亡。
２结果ｎｅｓｔｉｎ染色示９５％细胞呈阳性，Ｘ－ｇａｌ染色示９０％以上细胞着色。
原位杂交表明，ＮＵＲＲＩ在细胞浆和细胞核内均有表达。
不同浓度６一羟基多巴对ｃ１７．２神经干细胞影响不同，随着６－ＯＨＤＡ浓度增加，细胞凋亡和坏死明显增加，当６－ＯＨＤＡ为６阻咖ｌ时，细胞凋亡明显减少，细胞坏死明显增加，Ａｄ—ＮＵＲＲｌ重组腺病毒能降低６－ＯＨＤＡ诱发的细胞凋亡和坏死。
第三部分ＮＵＲＲｌ基因对Ｃ１７．２神经干细胞分化影响及其旁分泌效应１实验方法在Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒加入Ｃ１７．２神经干细胞内６小时后，更换为无血清培养液继续培养７２ｈ，收细胞上清和未转染病毒的细胞上清后，裂解细胞并回收，ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定细胞上清中和细胞内ｎｕｒｒｌ蛋白。
在Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒加入培养细胞６小时后，分别消化、收集加和未加Ａｄ—ＮＵＲＲｌ重组腺病毒的细胞，两者按细胞数１：０、１：１、０：１的比例混合爬片７２ｈ，固定，免疫组化检测ｎｕｒｒｌ、ＮＳＥ阳性细胞。
对ｎｕｒｒｌ阳性细胞比例进行统计学分析，并与ＮＳＥ阳性细胞比例相比较，观察两者之间是否存在相关性。
２结果ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示转Ａｄ．ＮＵＲＲｌ重组腺病毒的细胞上清液和细胞内均有ｎｕｒｒｌ蛋白的存在。
ｎｕｒｒｌ免疫组化示，在转染和未转染Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒的混合细胞中大部细胞为阳性细胞，未转染病毒的细胞中偶有阳性细胞。
ＮＳＥ染色示，随转染与未转染Ａｄ－ＮＵＲＲＩ重组腺病毒的细胞的比例下降，ＮＳＥ阳性细胞数目随之降低，与ｎｕｒｒｌ阳性细胞比例呈线性相关。
第四部分Ｎｕｒｒｌ基因联合神经干细胞移植对ＰＤ模型的治疗１．实验方法移植前３天，在Ｃ１７．２神经干细胞加入Ａｄ－ＮＵＲＲｌ（ＭＯＩ＝２０），无菌收集，部分用Ｄｉｌｌ８染色后立体定向注射到ＰＤ模型纹状体内。
取合格的ＰＤ模型２７只，分为ＰＤ模型对照组８只；单纯Ｃ１７．２神经干细胞移植治疗组１０只，分为移植后１０ｄ（２ａ组）、４ｗ（２ｂ组）两组；含Ａｄ—ＮＵＲＲＩ＋ＮＳＣ治疗组９只，分为移植后１０ｄ（３ａ组）、４ｗ（３ｂ组）两组，其中治疗组各有４只作荧光示踪实验，模型组在移植后１０ｄ、４ｗ做完阿朴吗啡诱发的旋转实验后，断头取脑作荧光示踪和ＴＨ染色实验。
２结果Ｃ１７．２神经干细胞移植后１０天，治疗组ＰＤ模型转圈数明显减少，Ｐ＜０．０５；Ａｄ—ＮＵＲＲＩ＋ＮＳＣ治疗组ＰＤ模型转圈数较ＮＳＣ组更少，Ｐ＜０．０５；在４ｗ时治疗组和对准组、治疗组之间仍有统计学差异，Ｐ＜０．０５；在神经干细胞移植后的第ｌＯ天和４ｗ时，两组治疗组内比较，Ｐ＞０．０５，差异没有显著性，表明神经干细胞移植后效果持续时间较长。
在荧光显微镜观察，移植后１０ｄ时，移植细胞主要集中在注射针道附近，但已开始向周围移行，部分移植细胞已与临近细胞建立突触联系；４ｗ后移植细胞已明显移行至远离注射部位，并与周围细胞建立明显的突触联系。
免疫组化示ＰＤ模型纹状体内ＴＨ阳性细胞明显减少；神经干细胞移植１０ｄ后，Ｔｉｆｆ阳性细胞明显增多，４ｗ后ＰＤ模型的病理改善仍然非常明显（Ｐ＜０．０５）；神经干细胞移植结合ＮＵＲＲｌ基因治疗ＰＤ模型的病理改善更加明显，ＴＨ阳性细胞增加更多（Ｐ＜Ｏ．０５）。
结论：１本实验构建了Ａｄ－ＮＵＲＲｌ重组腺病毒载体，该载体转染效率高，对ＮＵＲＲｌ基因表达效率高。
２ＮＵＲＲｌ基因可以保护神经干细胞拮抗外源性神经毒素，减少外源性神经毒素诱导的神经干细胞凋亡和坏死。
３Ａｄ—ＮＵＲＲｌ重组腺病毒载体不仅可直接促进神经干细胞分化，还可以通过旁分泌的形式促进神经干细胞的分化。
４ＮＵＲＲｌ基因结合神经干细胞是治疗ＰＤ模型行之有效的途径，可有效改善了ＰＤ模型症状，修复ＰＤ模型病理改变，在一定的程度恢复原来的多巴胺能神经支配。
关键词：帕金森病，神经干细胞，腺病毒，ＮＵＲＲｌ中山大学博士学位论文构建含ＮＵＲＲｌ基因的腺病毒对Ｃ１７２神经干细胞调控及其对帕金森病治疗ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗｉｔｈＮＵＲＲｌＧｅｎｅａｎｄｉｔｓＣｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｔｏＣ１７．２ＮｅｒｖｅＳｔｅｍＣｅｌｌａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｔｏＰａｒｋｉｎｓｏｎＤｉｓｅａｓｅｂｙＴｈｅｍＭａｊｏｒ：ＮｅｕｒｏｌｏｇｙＰｈＤ：ＱｉｎｇＪｕｎＬｉＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＹｉＧａｎｇＸｉｎｇＡＢＳＴＲＡＣ。
Ｉ’Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ），ａｌｓｏｎａｍｅｄｐａｒａｌｙｓｉｓａ百ｔａｎｓ，ｗａｓｔｈｅｓｅｃｏｎｄｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎ１１ｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｏｆｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ（ＣＮＳ）．Ｉｔｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄｏｌｄ．ＡｎｄｔｈａｔＰＤｈａｄｂｅｅｎａｆｆｅｃｔｅｄａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ１ｐｅｒｃｅｎｔｐｅｏｐｌｅｏｖｅｒ６０ｙｅａｒｓａｎｄｗｏｍａｎｗｈｉｌｅｉｔｋｅｐｔｔｌｌｅｒｅｗａ５；ｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｍｏｒｂｉｄｉｔｙｏｆＰＤｂｅｔｗｅｅｎｍａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｗｉｔｈａｇｅｓ．１ｓｔａｔｕｓｑｕｏｏｆＰＤｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａＰＤｗａｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓｉｎａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｏｆｍｉｄｂｒａ恤．Ｔｈｅｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａｗａｓｍｏｓｔｌｙｄａｍａｇｅｄｉｎｂｏｔｈｐｒｉｍａｒｙｔｈａｎｉｎｔｅｒｉｏｒｒｅｔｉｃｕｌａｒｚｏｎ。
・ＰＤ．Ｔｈｅｄａｍａｇｅｏｆｌａｔｅｒａｌｃｏｍｐａｃｔｚｏｎｅｗａｓｍｏｒｅｓｅｖｅｒｅｃａｕｓｅｄｂｙｄｅｓｔｒｏｙｏｆｄｙｎａｍｉｃｂａｌａｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｄｏｐａｍｉｎｅ锄ｄＳｙｍｐｔｏｍｓｏｆＰＤｗｅｒｅａｎｄｃｏｒｐｕｓｓｔｒｉａｔｕｍｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄａｃｅｔｖｌｃｈｏｌｉｎｅ（Ａｃｈ），ｆｏｒｔｈｅＤＡｉｎｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａｍｅａｎｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＡｃｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｅｆｆｅｃｔｏｆＤＡｄｅｓｃｅｎｄ，ｗｈｉｃｈｒｅｌａｔｉｖｅｌｖ．ＴｈｅｎｔｈｅｂｅｓｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｏＰＤｗａｓｔｒｙｉｎｇｔｏｐｒｏｔｅｃｔｔｈｅｒｅｌｉｃＤＡｎｅｕｒｏｎａｎｄｓｕｐｐｌｙｉｎｇｔｈｅｌｏｓｅｄＤＡｎｅｕｒｏｎｉｎＰＤｔｏｓｅｔｕｐｔｈｅａｖａｉｌａｂｌｅｓｙｎａｐｓｅｓｃｏｎｔａｃｔａｎｄｒｅｓｔｏｒｅｔｈｅｎｅｒｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｄｏｐａｍｉｎｅｎｅｕｒｏｎ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ２ＴｈｅｓｔａｔｕｓｑｕｏｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｏＰＤｂｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｎｅｕｒａｌＭａｎｙｓｃｈｏｌａｒｓｓｔａｒｔｅｄｔｏｔｒｙｃｕｒｉｎｇＰＤｂｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇｓｏｍｅｋｉｎｄｓｏｆｃｅｌｌｓｉｎｔｏ！生垄兰苎圭兰竺竺圭塑堕童！坚！！苎里竺苎要兰翌！！！：！塑竺王竺璺塑篓墨苎翌堕兰墅堑堕！！ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａａｎｄｃｏｒｐｕｓｓｔｆｉａｔｕｍｏｆＰＤｓｉｎｃｅｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｈａｄｕｓｅｄｔｏｂｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｗａｓｕｎｄｅｒｓｔｏｏｄ．ＴｈｅａｄｒｅｎａｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｔｏＰＤ，ｗｈｉｃｈｂｅｌｉｅｖｅｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，ｈａｄａｌｓｏｂｅｅｎｄｉｓｃａｒｄｅｄ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆｆｅｔａｌｄｏｐａｍｉｎｉｃｈｍｉｍｄａｇｅ，ｓｏｕｒｃｅｎｅｕｒｏｎｗａｓｄｉｆｆｉｃｕＲｔｏｐｅｒｓｉｓｔｂｅｃａｕｓｅｏｆｓｏｍｅｐｒｏｂｌｅｍｓ，ｓｕｃｈａｓｏｆｅｍｂｒｙｏｓ，ｅｔｈｉｃｓｅｔｃ．Ｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＮＳＣ）ｗｅｒｅｖｅｒｙｑｕｉｃｋ－ＮＳＣｈａｄｔｈｅｉｍｍａｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｈｙｐｏ—ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｎｄｄｕｐｌｉｃａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒ．ａｎｄｓｏｏｎ．ⅡｍｉｇｈｔｂｅｔｈｅｂｅｓｔｔｈｅｒａｐｙｆｏｒＰＤｂｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇＮＳＣ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｏｍｅｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｓｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｏｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｔｏｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏｎｓ，ｉｎｔｏｉｔｓｒｅｔｒｏｇｒａｄｅｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａ・３ＴｈｅｓｔａｔｕｓｑｕｏｏｆｇｅｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｏＰＤＦｏｒｔｈｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｙｒｏｓｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）ａｎｄＡｒｏｍａｔｉｃＬ－ａｍｉｎｏａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＡＡＤＣ）ｉｎＰＤ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＤＡｍｉｇｈｔｂｅａｎｄＡＡＤＣ．ＡｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｏｍｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｓｕｐｐｌｙｉｎｇｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｏｆＴＨｅｆｆｅｃｔｉｖｅ．ＨｏｗｅｖｅｒｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈａｔｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒＰＤｗａｓｊｕｓｔｓｕｐｐｌｙｉｎｇＡＡＤＣａｎｄＴＨａｎｄｓｏｍｅｏｔｈｅｒｓｎｅｕｒｏｔｒａｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓｃｏｕｌｄｎｏｔｂｌｏｃｋｏｆＰＤａｎｄｃｏｕｌｄｎｏｔｒｅｓｏｌｖｅｔｈｅｂａｓｉｃｐｒｏｂｌｅｍｏｆｔｈｅｕｐｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎｒｅｄｕｃｔｉｏｎ－ｄｏｐａｍｉｎｉｃｎｅｕｒｏｎＮＵＲＲｌ，ａｍｅｍｂｅｒｏｆｏｒｐｈａｎｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍａｊｏｒｒｏｌｅｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｍｏｓｔｌｙｉｎｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｅｓｙｓｔｅｍ．ＮＵＲＲｌｐＮｙｅｄａｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｄｏｐａｍｉｎｉｃｎｅｕｒｏｎ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＨｇｅｎｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆＮＵＲＲｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈａｇｅｓ．ＡｎｄｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆＮＵＲＲｌａｎｄＴＨｓｈｏｗｅｄａｃｃｏｒｄａｎｃｅｗｉｔｈａｇｅｓ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｒａｐｙｆｏｒＰＤｂｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｏｔｈｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｍｉｇｈｔｂｅＮＳＣ．ｗｈｉｃｈｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｃａｒｒｉｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＮＵＲＲｌｇｅｎｅｏｆＮＵＲＲｌｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｆｉｎｅｄｂｙｓｏｍｅａｎｉｄｅａｌｃｈｏｉｃｅ．ＨｏｗｅｖｅｒｔｈｅｓｔｕｄｙｉｎｇＮＵＲＲｌｇｅｎｅ，ｎｅｅｄｏｆｒｅｐｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓ．ｓｕｃｈａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｐｌａｓｍｉｄｃａｒｒｙｉｎｇｐｌａｓｍｉｄａｎｄｃｏｎｆｉｎｅｄｌｅｎｇｔｈｏｆｉｎｓｅｒｔｅｄｇｅｎｅｓｅｇｍｅｎｔ，ａｎｄＳＯｏｎ．Ｔｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ（Ａｄ）ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍａｌｌｏｗｅｄｆｏｒｉｎｓｅｒｔｉｏｎｏｆａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃａｓｓｅｔｔｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｇｅｎｅｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓｕｐｔｏ７．５ｋｂ（ｔｈｅｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＡｄｃｏｕｌｄｉｎｓｅｒｔａｇｅｎｅｏｒｎｍｌ卸ｌｅｇｅｎｅｓｕｐｔｏ３４ｋｂ）ａｎｄｃｏｕｌｄｅｘｐｒｅｓｓｈｉｇｈｌｙｔｈｅｉｎｓｅｒｔｅｄｇｅｎｅａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｔｓｙｉｅｌｄ．ＳｏｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎＡｄｖｅｃｔｏｒｃａｒｒｙｉｎｇＮＵＲＲｌｇｅｎｅ（Ａｄ－ＮＵＲＲｌ）．ＡｆｔｅｒＣ１７．２ｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＡｄ－ＮＵＲＲｌ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｎｔｏＰＤｍｏｄｅｌｓａｎｄｔｈｅｉｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅｆｆｉｃａｃｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｐａｒｔ１ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｗｉｔｈＮＵＲＲｌｇｅｎｅ１ｍｅｔｈｏｄＡｆｔｅｒｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄｐＭＤ—ＮＵＲＲｌａｎｄｐａｄｔｒａｃｋ—ＣＭＶｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｃｕｔｂｙｔｈｅｒｅｔｒｉｅｖｅｄａｎｄｌｉｇａｔｅｄｔｏａｓａｎｌｅｅｎｚｙｍｅ，Ｈｉｎｄ口ａｎｄＸｂａｔｔｈｅｙｗｅｒｅｐａｄｔｒａｃｋ—ＣＭＴＶ－ＮＵＲＲｌｐｌａｓｍｉｄ．ＴｈｅｌａｔｅｒｃｕｔｂｙＰｍＰｌｗｅｒｅｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｄＤＨ５ａｔＯｆｏｒｍａｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｉｔ．ｐＡｄｅａｓｙｉｎｔｏＢａｃｉｌｌｕｓｃｏｌｉＢＪ５１８３ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｃｏｍｂｉｎａｍｃｕｔｂｙＰａｃｌｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３ｃｅＨｓｔＯｐａｃｋｉｎｔｏａｎＡｄ．Ｗｈｅｎｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｉｃｅｆｆｅｃｔｏｆ２９３ｃｅｌｌｓｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙａｎｄｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｗａｓｅｖｉｄｅｎｔｌｙｉｎｔｅｎｄａｙｓ，ｔｈｅｃｅｎｓｗｅｒｅｒｅｔｒｉｅｖｅｄａｎｄｐｅｒｆｏｒｍｅｄｆｒｅｅｚｅ—．ｔｈａｗｅｄｆｏｒｆｏｕｒｔｉｍｅｓａｎｄｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄｔＯｇｅｔｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔ．Ａｄｗａｓｗａｔｃｈｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ＤＮＡｏｆＡｄｗａｓｒｅｔｒｉｅｖｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．ＴｈｅｔｉｔｅｒｏｆＡｄｗａｓａｌｓｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．２ｒｅｓｕｌｔＴｈｅｐＭＤ－ＮＵＲＲｌｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｒｉｇｈｔ．Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｓｈｕｔｔｌｅｐｌａｓｍｉｄｏｆｐａｄｔｒａｃｋ－－ＣＭＶ—－ＮＵＲＲｌａｎｄｃｏｍｂｉｎｅｄｐｌａｓｍｉｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ．ＴｈｅＣＰＥａｎｄＧＦＰｉｎ２９３ｃｅｌｌｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｐａｃｋａｇｅｏｆＡｄ，ａｎｄｔｈｅｖｉｒａｌｓｈｏｗｅｄｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｐａｃｋａｇｅｏｆＡｄ，ｐａｒｔｉｃｌｅｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｅｄＮＵＲＲｌｇｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．ＴｉｔｅｒｏｆＡｄｗａｓｌｘｌ０１１ｐｆｕ／Ｌ．ｗｉｔｈＮＵＲＲｌｇｅｎｅｉｎＰａｒｔ２ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｄＣ１７．２ＮｅｒｖｅＳｔｅｍｃｅｌｌｓ１ｍｅｔｈｏｄＣ１７．２ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｗａｓｍｍｎｍｉｎｅｄａｔ３７ｏＣａｎｄ５％Ｃ０２．Ｃ１７．２ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｆｉｘｅｄｗｅｒｅｄｙｅｄｂｙＸ－ｇａｌａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｆｏｒｎｅｓｔｉｎｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｆｏｒＮＵＲＲｌｍＲＮＡｂｙｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ．ＴｈｅＣ１７．２ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｉｎ２５ｃｍ２ｃｕｌｔｕｒｅｆｌａｓｋｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆｌａｓｋｓ．Ｆｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ１ａｎｄｔｅｓｔｇｒｏｕｐｓ口、习、巴，ａｎｄｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｅｎｆｌａｓｋｓｉｎｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐｗｅｒｅａｄｄｅｄｗｉｔｈ０．５ｍｌＡｄ（ＭＯＩ＝２０）．ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅａｄｄｅｄｗｉｔｈ２０、ｊｕｓｔａｄｄｅｄｗｉｔｈ０．５ｒｎｌｎｏｒｍａｌｓｏｄｉｕｍ，ａｎｄｔｈｅｔｈｒｅｅｔｅｓｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅ６－ＯＨＤＡ．Ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎ６ｈ，ｔｈｅｃｅｌｌｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＣ１７・２４０、６０ｐｇ／ｍｌｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．２ｒｅｓｕｌｔＭｏｒｅ９５％ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｄｙｅｄｂｙｎｅｓｔｉｎａｎｄｍｏｒｅ９０％ｃｅｌｌｓｂｙＸ—ｇａｌ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＵＲＲｌｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄｃｅｌｌｎｕｃｌｅｕｓｂｙｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｎｓｉｔｙｏｆ６－ＯＨＤＡｈａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｏｎＣ１７．２ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＣ１７・２ｎｅｕｒａｌＩｎｃｒｅａｓｉｎｇｄｅｎｓｉｔｙｏｆ６－ＯＨＤＡ，ｔｈｅｔｏｔａｌｏｆｎｅｃｒｏｓｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｗｈｅｎｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆ６一ＯＨＤＡｗａｓ６０１ａｇ／ｍｌ，ｔｈｅｎｅｃｒｏｓｉｓｏｆＣ１７．２ｓｔｅｒｎｃｅｌｌｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｒａｉｓｅｄａｎｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．ＴｈｅＡｄｃｏｕｌｄｄｅｐｒｅｓｓｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｉｎｄｕｃｅｄｂｙ６－ＯＨＤＡ．Ｐａｒｔ３ＮＵＲＲｌＩｎｄｕｃｉｎｇＣ１７．２ＮＳＣＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓＰａｒａｃｒｉｎｅＥ馑ｅｅｔｉｖｅｎｅｓｓ１ｍｅｔｈｏｄＷｈｅｎＮＳＣｗｅｒｅｒｅｐｌａｃｅｄｉｎｆｌｅｅ—ｓｅｒｕｍｍｅｄｉｕｍａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｅｄｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅｆｏｒａＩｌｏｔｈｅｒ７２ｈａｆｔｅｒＮＳＣｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｏｒｗｉⅡｌｏｍＡｄｆｏｒ６ｈ，ｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔｏｆｃｅＩＩｍｅｄｉｕｍｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｎｔｈｅｒｅｍａｉｎｉｎｇｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｐｌｉｔｅｄａｎｄｒｅｃｌａｉｍｅｄ．Ｔｈｅｓｕｐｅｍａｔａｎｔａｎｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｏｄｅｔｅｃｔｎｕｒｒｌｐｒｏｔｅｉｎ・ＣｏｌｌｅｃｔｅｄＮＳＣｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈＡｄ，ａｎｄｍｉｘｅｄｔｈｅｍａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎ１：０ａｎｄ１：１ａｎｄ０：１ａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｅｄｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｔｈｅｍｆｏｒａｎｏｔｈｅｒ７２ｈ．ＴｈｅｎｎｕｒｒｌａｎｄＮＳＥｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｎｕｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＡｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｎｕｌｌｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＮＳＣｐｏｆｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｔｏａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅｄｅｐｅｎｄａｂｉｌｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ．２ｒｅｓｕｌｔＴｈｅｒｅｗｅｒｅｎｕｒｒｌｐｒｏｔｅｉｎｉｎｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｍａｔａｎｔｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｍｏｓｔｃｅｌｌｓｓｈｏｗｎｕｒｒｌｐｏｆｉｔｉｖｅｉｎｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅｏｆｃｅｌｌｓ．ＦｅｗｏｆｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔＡｄｓｈｏｗｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎＮＵＲＲｌｍＲＮＡａｎｄｎｕｒｒｌｐｒｏｔｅｉｎ．ｃｅｌｌ．ＴｈｅｒｅｗｅｒｅＴｈｅｒｅｗｅｒｅｍｏｒｅＮＳＥｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｍｉｘｔｕｒｅｏｆａｎｄｎｕｒｒｌｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｒａｔｉｏｎ．ｄｅｐｅｎｄａｂｉｆｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎＮＳＥｐｏｓｉｔｉｖｅＰａｒｔ４ＴｒｅａｔｍｅｎｔｔｏＰＤｂｙＮＳＣｗｉｔｈＮＵＲＲｌＧｅｎｅ１ｍｅｔｈｏｄＢｅｆｏｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ，Ａｄ（ＭＯＩ＝２０）ｗｅｒｅｐｕｔｉｎｔｏｔｈｅＣ１７．２ｃｅｌｌｓｉｎｔｈｒｅｅｄａｙｓ．ＴｈｅｎｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｎｄｐａｒｔｏｆｔｈｅｍｗａｓｄｙｅｄｂｙＤｉｌｌ８ｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｒｉａｌｔｅｓｔ．２７ｒａｔｓｏｆＰＤｍｏｄｅｌｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ８ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｄｔｅｓｔｇｒｏｕｐｗｈｉｃｈｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏＰＤ＋ＮＳＣｇｒｏｕｐｗｉｔｈ１０ｍｏｄｅｌｓ，ａｎｄＰＤ＋ＮＳＣ＋Ａｄｇｒｏｕｐｗｉｔｈ９ｍｏｄｅｌｓ．Ｅｖｅｒｙｔｅｓｔｇｒｏｕｐｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｗｏｓｕｂ—ｇｒｏｕｐｓ（ＰＤｍｏｄｅｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｗｉｔｈｃｅｌｌｓｉｎ１０ｄａｎｄ４ｗ）．Ｅｖｅｒｙｔｅｓｔｇｒｏｕｐｈａｄ４ＰＤｍｏｄｄｓｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｒｉａｌｔｅｓｔ．Ａｆｔｅｒｆｉｎｉｓｈｅｄｔｈｅｃｉｒｃｌｉｎｇｔｅｓｔｉｎ１０ｄａｎｄ４ｗ，ＰＤｍｏｄｅｌｓｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｂｒａｉｎｓａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｒｉａｌｔｅｓｔ．ｗｅｒｅｔａｋｅｎｔｏｄｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｄｙｅｉｎｇ２ｒｅｓｕｌｔＴｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄＮＳＣｉｎ１０ｄａｙｓ，ｔｈｅｃｙｃｌｅｓｏｆＰＤｍｏｄｅｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ６－ＯＨＤＡｔｕｒｎｅｄｄｏｗｎｔｈａｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓｆＰ＜Ｏ．０５）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｍｏｄｅｌｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｗｉｔｈＮＳＣ＋Ａｄ－ＮＵＲＲｃｉｒｃｌｅｄｌｅｓｓ（Ｐ＜ｏ．０５）．Ａｆｔｅｒ４ｗｅｅｋｓ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｔｉｌｌｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ中山大学博士学位论文构建吉ＮＵＲＲｌ基因的腺病毒对Ｃ１７２神经干细胞调控及其对帕金森病治疗ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｅｓｔｇｒｏｕｐｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓａｎｄｗｉｔｈｉｎｔｅｓｔｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｎ１０ｄ，ＮＳＣｍａｉｎｌｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｎｅａｒｔｈｅｐｉｎｈｏｌｅｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｂｕｔｔｈｅｙｂｅｇａｎｔｏｍｉｇｒａｔｅａｒｏｕｎｄａｎｄｓｏｍｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｒｏｍｐｉｎｓｙｎａｐｓｉｓｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｏｔｈｅｒｃｅｌｌｓ．Ａｆｔｅｒ４ｗｅｅｋｓ，ＮＳＣｍｉｇｒａｔｅｄａｗａｙｈｏｌｅａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｅｖｉｄｅｎｔｌｙｓｙｎａｐｓｉｓｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓａｒｏｕｎｄｔｈｅｍ．ＴＨ＋ｎｅｕｒｏｎｏｆＰＤｍｏｄｅｌｓｉｎｓｔｒｉａｔｅｃｏｒｐｏｒａｏｂｖｉｏｕｓｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＴＨ＋ｎｅｕｒｏｎｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒＮＳＣｗｅｒｅｇａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｎ１０ｄａｙｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅＰＤａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄｖｅｒｙｍｕｃｈ，ａｎｄＴＷｐａｔｈｏｌｏｇｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｗｉｔｈＮＳＣ＋Ａｄ－ＮＵＲＲＮｅｕｒｏｎｓｗｅｒｅｍｏｒｅ（Ｐ＜０．０５）ｔｈａｎｉｎＰＤｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｗｉｔｈＮＳＣ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：１ＴｈｅＡｄ．ＮＵＲＲｌｖｅｃｔｏｒｃｏｕｌｄｅｘｐｒｅｓｓＮＵＲＲｌｇｅｎｅａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔＣ１７．２ｓｔｅｍｃｅｌｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．ａｎｄ２Ａｄ—ＮＵＲＲｌｇｅｎｅｃｏｕｌｄｐｒｏｔｅｃｔＮＳＣｆｒｏｍｔｈｅｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆ６－ＯＨＤＡｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｎｅｃｒｏｓｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＮＳＣｉｎｄｕｃｅｄｂｙ６－ＯＨＤＡ．３Ａｄ—ＮＵＲＲｌｖｅｃｔｏｒｃｏｕｌｄｎｏｔｏｎｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｉｒｅｃｔｌｙｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＮＳＣ，ｂｕｔｅｎｈａｎｃｅｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＮＳＣ．４ＮｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅＮＵＲＲｌｇｅｎｅｗａｓａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒＰＤ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄａｍｅｌｉｏｒａｔｅｔｈｅＰＤｓｙｍｐｔｏｍｓ，ａｎｄｒｅｐａｉｒｔｈｅｐａｔｈｏｌｏｇｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：ＰａｒｋｉｎｓｏｎＤｉｓｅａｓｅ；Ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ；Ａｄｅｎｏｖｉｍｓ；ＮＵＲＲｌ士出苎茔煎±生焦煎塞担熊盘丛堡曼！薹固照馥垂盟￡！！：２盐堑王塑照翊控丑基型蝗垒盎瘟擅痘构建含ＮＵＲＲｌ基因腺病毒对Ｃ１７．２神经干细胞调控及其对帕金森病治疗博士研究生李庆军指导教师邢诒胃口中山大学附属第二医院神经内科，广州，５１０１２０前言帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ＳＤｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）又名震颤麻痹（ＰａｒａｌｙｓｉｓＡｇｉｔｎｓ），是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，６０岁以上人群患病率为１０００／１０万，并随着年龄增长而增高，两性分布差异不大。
