分子印迹技术及其应用.ppt

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分子印迹技术的分类
根据印记分子和功能单体之间作用的不同，可将制备MIPs 的方法分为以下四种： （1）预组装法（pre-organized approach)——共价 键 作用
共价键法是由Wulff等人创立发展起来的。该方法中印迹分子（目 标分子）和功能单体一共价键的形式结合成印迹分子的衍生物，该聚 合物进一步在化学条件下打开共价键是印记分子脱离。功能单体一般 采用小分子化合物。
共价键结合作用包括：硼酸酯、席夫碱、缩醛酮、酯 和螯合物等。 该方法主要应用于制备各种具有特意识别功能的聚合 物，如糖及其衍生物，甘油酸及其衍生物，氨基酸及其衍 生物等。
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分子印迹技术的分类
（2）自组装法（self-assembly approach)— —非共价键作用
该方法由Mosbach等人发展起来的。即把适当比例的 印迹分子与功能单体和交联剂混合，通过非共价结合在一 起生成非共价键印迹分子聚合物。 非共价键包括：氢键，静电引力，金属螯合作用，电 荷转移作用，疏水作用以及范德华力等。 该法主要应用与下列物质的分离：燃料，二胺，维生 素，氨基酸衍生物，多肽，肾上腺素功能药物阻聚剂，茶 碱，二氮杂苯等。
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分子印迹技术概论和历史发展
分子印迹技术的发展
1949年 Dickey 专一性吸附
1972年 德国Heinrich Heine大学的Wulff研究小组报道了
人工合成分子印迹聚合物
1993年 瑞典Lund大学的Mosbach等在《Nature》上发表有
关茶碱分子印迹聚合物的研究报道
1997年 在瑞典Lund大学成立了国际性的分子印迹学会
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分子印迹技术机理
• 分子印迹热力学
热力学过程控制分子印迹的识别分离过程是目前被研究者 普遍接受的理论，人们大多通过研究分离过程的熵变，焓 变和自由能等热力学参数的变化等来对热力学过程进行描 述。 从分子印迹聚合物的制备过程可以看出，在引发聚合之前， 模板分子与功能单体在溶液中经预组织排列形成复合物， 这是一个动态平衡过程，在平衡中形成的复合物的稳定程 度受吉布斯自由能的变化控制，这样焓变和熵变决定了平 衡态势，即模板分子-功能单体复合物的稳定性。

非共价法(自组织法,self-assembling)
印迹分子与功能单体之间预先自组织排列,以非共价键形成多重作用位 点,聚合后这种作用保存下来.
常用的非共价作用有氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水 作用以及范德华力等,其中以氢键应用最多.
二种方法的优缺点比较
共价法：由于共价键作用力较强,在印迹分子自组装或识别过程中结合和解 离速度较慢,难以达到热力学平衡,不适于快速识别,而且识别水平与生物识别 相差甚远.因此,共价法发展较为缓慢.
分子印迹技术
组员：赵一纳 骆荧 裘倍蕾
分子印迹技术
分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique,MIT)是近
年来集高分子合成、分子设计、分子识别、仿生生物工程等众多 学科优势发展起来的一门边缘学科分支。
基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶 劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点。因 此，分子印迹技术在许多领域，如色谱分离、固相萃取、仿生传 感、模拟酶催化、临床药物分析等得到日益广泛的研究和开发， 有望在生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等行业形成产 业化规模的应用。
CONTENTS
分子印 迹技术
原理 类型 特点 应用
分子印迹的原理
分子印迹技术，又称分子烙印技术，是将模板分
子(印迹分子、目标分子)与交联剂在聚合物单体溶液 中进行聚合得到固体介质,然后通过物理或化学方法 洗脱除去介质中的模板分子,得到“印迹”有目标分 子空间结构和结合位点的MIPs.
分子印迹的原理
共价法(预组织法,preorganization)
印迹分子先通过共价键与单体结合,然后交联聚合,聚合后再通过化学途 径将共价键断裂而去除印迹分子.

2.4 分子印迹技术的特点
MIT之所以发展如此迅速，主要是因为它有三大特点： ●预定性（predetermination）
根据不同的目的制备不同的MIPs，以满足不同的需要。 ●识别性（recognition）
MIPs是按照模版分子定做的，可以专一地识别印迹分 子。 ●实用性（practicability）
它可以与天然的生物分子识别系统相比拟，例如，酶 和底物；抗原与抗体等。
3 分子印迹聚合物的制备
分子印迹聚合物是由印迹分子、功能基单体在交联剂等物质作用下 形成作用位点，相互聚合，发生反应，形成的一类具有特异选择识别 功能的物质。
图3.1 分子印迹聚合物制备过程示意图
3.1 分子印迹聚合物的制备要素
• 预组织法（共价法） Wulff 结合方式：可逆共价键 优点：空间精确固定排列 缺点：识别能力不够理想 形成复合物的过程缓慢
• 自组装法 （非共价法）Mosbach 结合方式：非共价键 优点：简单易行 模板容易除去 近似天然 缺点：印迹过程的轮廓不清晰
• 牺牲空间法 （两者兼备）Vulfson
2.2 分子印迹技术的分类
制备材料 模板分子 溶剂 功能单体
交联剂
强极性基团 高效MIPs 氢键基团 高选择性MIPs
促进作用 减小干扰 共价键型 含有乙烯基 非共价型 含有乙烯基和羧基 乙二醇二甲基丙烯酸酯
3.2 MIPs的聚合形式和方法
聚合形式主要有热化学聚合和光化学聚合两种 形式。 分子印迹聚合物的制备方法： ❖本位聚合 ❖原位聚合 ❖沉淀聚合 ❖悬浮聚合 ❖表面印迹 ❖电聚合
分子印迹技术优秀课件
1 背景介绍
分子印迹技术（MIT）的发展
1997年 Lund University 成 立分子 印迹学会

斑点杂交（Dot blot）
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
.
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流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
.
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菌落原位杂交
（Colony in situ hybridization）
菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝 酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌 以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标 记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信 号，并与平板上的菌落对位。
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实验步骤如下：
①将滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单 菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相 同。
1.Extract DNA from cell
Extract RNA from cell
Extract protein from cell
2.Cut with restriction enzyme
3.Run on gel(usually agarose) Run on gel(usually agarose) Run on gel(usually poly -
斑点杂交（Dot blot）
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
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六、分子印迹聚合物的应用
（1）有效成分的分离：
朱全红等，以长春碱为模板分子制备了长春碱MIP，并作为固相萃取的吸 附剂用于分离长春花提取物中的长春碱。结果表明，通过选择和优化上样、 淋洗及洗脱等条件，长春花提取物中的主要成分长春碱得到高效富集及分离。
（2）有效组分群的分离：
徐筱杰等以槲皮素为模板分子通过非共价印迹方法制备了槲皮素MIP， 该聚合物对槲皮素表现出特殊的识别能力，能将银杏叶提取物水解液中的槲 皮素及山柰酚分离，能从沙棘提取物的水解液中得到槲皮素及异鼠李素。说 明槲皮素印迹的聚合物不仅对模板分子具有很高的亲和性，对与其结构类似 的化合物山柰酚、异鼠李素也表现出较高的结合能力。
四、分子印迹聚合物的合成
印迹 聚 萃取
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与天然的生物分子识别系统相比，
五、分子印迹聚合物的特性 MIP是用化学合成的方法制备的， 因此还具有天然分子识别系统所不
具备的抗恶劣环境的能力，从而表
由于聚合物上预留的
现出高度的物理、化学稳定性，如
空穴与模板分子完美匹配，
耐高温、高压，能抵抗很强的机械
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六、分子印迹聚合物的应用
分子印迹聚合物的应用领域包括： 1、中药研究 2、分析化学 3、天然药物化学 4、医药学 5、生物学
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六、分子印迹聚合物的应用
1、在中药研究上的应用
以中药活性物质为模板制备的MIP，正是具有其他 分离材料所不具备的强特异性和高选择性，因此在中药 活性成分的分离、分析中具有很好的应用前景。目前用 MIT研究的中药有效成分包括黄酮、生物碱、香豆素、 木脂素等。主要应用在以下几个方面： （1）有效成分的分离； （2）有效组分群的分离； （3）活性成分的筛选； （4）复杂样品的预处理以及目标分子的测定；

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2 、分子印迹技术基本原理
分子印迹就是将模板分子与功能单体通过共价、非共价 或金属协同作用形成预聚合物，在交联剂的作用下功能单体 发生聚合，将模板分子固定在聚合物中，最后脱除模板分子， 即聚合物材料上留下与模板分子在大小、形状和官能团的方 向上都互补的空穴结构。空穴不仅保留了与模板分子化学结 构互补的官能团的有序排列，也维持了它的整个空间构象， 所以当材料再次遇到模板分子时，可发生特异性的结合。
Tan 等以甲基丙烯酸甲酯为功能单体, 乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂, 用微乳液 (W/O/W 复乳)聚合法制备了印迹RNase A 的纳米粒。该法中 使用了较高浓度的SDS 和聚乙烯醇作为乳化剂。作者认为, 当两亲性的蛋 白被加入预聚合微乳液后, 蛋白会吸附于表面活性剂形成的胶束中并被分 配到油-水两相的界面上。聚合反应引发后,蛋白便被“束缚”在胶束的表 面了。研究表明, 蛋白和表面活性剂的相互作用有助于蛋白停留在纳米粒 表面, 然而太剧烈的作用却会导致蛋白明显的构象变化, 甚至变性, 造成错 误的印迹。
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3.2 表面印迹 在聚合物的表面或近表面构造模板蛋白的结合位点称为“表面印迹”。与
整体印迹旨在构造蛋白特异性三维结构不同的是，表面印迹的特点是在材料 的表面构建蛋白的“二维印迹”。这样的二维阴极材料从某种程度上解决了 生物大分子难以进出聚合物材料的问题，可大大缩短蛋白扩散进入材料并达 到平衡的时间。然而，与“三维印迹”材料性比，“二维印迹”材料可能会 出现对模板蛋白选择性降低的问题。
Tan 等[19]用微乳液聚合法制备超顺磁性亚微粒。预先制备Fe3O4 磁性纳米粒, 将功能单体甲基丙烯酸甲酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯 酸分散在油相中, 用微乳液聚合法制备表面印迹核糖核酸酶 A(ribonuclease A, RNase A) 的亚微粒。与非印迹材料相比, 印迹 材料在混合蛋白溶液中对模板蛋白有很好的选择性。

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（二）待测DNA样品的电泳分离
1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶
分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子
DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交
所用分子量标准可用核素标记
（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在 68℃杂交
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5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长
度
（2）复性速率与反应体系中核酸复杂性成反比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交 率取决于DNA的相对复杂性
底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸
纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高
③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
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2、Southern印迹的常用方法
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程 当前你正在浏览到的事第三十四页PPTT，共六十五页。
（一）待测核酸样品的制备
1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
分子杂交和印迹技术PPT课件
当前你正在浏览到的事第一页PPTT，共六十五页。
第一节 核酸分子杂交的基本原理

二、分子印迹技术的产生和发展
1、分子印迹技术最初出现源 于20世纪40年代的免疫学。 Pauling首次提出抗体形成 学说。
二、分子印迹技术的产生和发展
2、1972年，wulf研究小组首 次
成功制备出分子印迹聚合物 （MIPs)，使MIT的研究产生 了突破性进展。
二、分子印迹技术的产生和发 展
主要内生和发展 三、分子印迹的基本原理 四、分子印迹的分类 五、分子印迹的步骤 六、分子印迹技术的特点 七、分子印迹技术的应用 八、展望
主要内容
一、什么是分子印迹技术 二、分子印迹技术的产生和发展 三、分子印迹的基本原理 四、分子印迹的分类 五、分子印迹的步骤 六、分子印迹技术的特点 七、分子印迹技术的应用 八、展望
3、1993年，Mosbach等人报道了有 关茶碱分子印迹聚合物的研究，分 子印迹聚合物以其通用性和惊人的 立体专一识别性，越来越受到人们 的青睐，同时非共价型模板聚合物 引起了人们极大的兴趣；
二、分子印迹技术的产生和发 展
4、目前，该技术已广泛应用于色谱分离、抗体或
受体模拟、生物传感器以及生物酶模拟和催化合 成等诸多领域；全世界至少有包括瑞典、日本、 德国、美国、中国在内的10多个国家、100个以 上的学术机构和企事业单位在从事这一技术的研 究与开发。
大自然中的分子印迹 现象
• 细胞内受体与激素 • 抗体-抗原 • 酶-底物
特征相互作用
人工的接受体
• 环糊精 • 冠醚
主要内容
一、什么是分子印迹技术 二、分子印迹技术的产生和发展 三、分子印迹的基本原理 四、分子印迹的分类 五、分子印迹的步骤 六、分子印迹技术的特点 七、分子印迹技术的应用 八、展望
共价印迹 法
1、联结：功能单体和模板分子通过共价结合； 2、聚合：联结产物在保持共价联结不变的情况下进行聚合反应； 3、分解：聚合后的联结产物通过分解反应（共价键断裂）使模板分子从

什么是分子印迹聚合物？
受到抗体的启发，人们开始想到合成某些类似 抗体具有高选择性的分离基质
分子印迹（molecular imprinting)是近年来 基于分子识别理论而迅速发展起来的一个新的 研究领域。因此分子印迹技术也被称为制造 “塑料抗体”的技术。
04.06.2020
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分子印迹聚合物（MIP) 的特点
04.06.2020
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展望
纵观分子印迹聚合物研究发展和成就,从 作为液相固定相材料,选择性催化剂到人 造受体,化学传感器应用,反映了分子印 记技术是集高分子合成,物化分子设计, 分析分离测试,生物和医学等众多相关学 科相互渗透的边缘学科.尽管发展很快, 但仍存在许多需要进一步解决的问题.首 先是分子印记过程和分子识别过程的机 理和表征问题.其次,目前所使用的功能 单体,交联剂应用
在生物样品分析上的应用:
生物样品中某种成分的测定在疾病诊断,药物 动力学分析,法医学,动物食品检验等领域得到 广泛的应用.在生物样品分析中,许多内源性的 物质的存在使得样品的净化成为不可缺少步骤. 而分子印记固相提取显示了巨大的优越 性.Sellergren采用分子印记固定相选择性地富集 尿样中的喷他脒,用PH为9的流动相除去尿样中 的碱性化合物,然后以 PH为3的流动相洗脱待 测物,直接进行紫外定量检测.
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生物模拟传感器
近来，生物传感器技术的发展极为迅速。但是，用于生物传感器 的生物分子却因为性能不稳定易被破坏，且种类太少而不能满足 实际应用的需要。由于分子印迹聚合物具有可设计性，种类极其 丰富，且坚固耐用，有很强的抗酸、碱能力，环境适应性很强， 故科学家们设法用MIPS来替代生物分子以适应生物传感器技术发 展的要求。自分子印迹技术用于膜传感器以来，MIPS在生物传感 器上的应用就一直是研究热点，尤其是近两年来，该技术发展极 为迅速，Malitesta,Haupt, Yano, Ansel等人在这一方面都作了 广泛的研究。98年在波士顿召开的有关化学传感器的国际性会议 对分子印迹技术在生物传感器中的应用的现状和未来作了全面而 系统的探讨，为分子印迹技术和传感器技术的发展开辟了新的道 路.