COX IV线粒体内参抗体说明书

纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂是一种旨在通过极谱法检测系统（polarographic system）测定新鲜活体线粒体在ADP存在（III态呼吸）与否（IV态呼吸）的情况下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差异，即呼吸控制率（RCR），以评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

可以被用于线粒体生理功能和药物作用机制等的研究。

产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景线粒体是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心。

电子传递和ATP合成通过质子梯度偶联成一体。

线粒体结构完整，功能正常，底物充分，电子传递形成的质子梯度不断被消耗，电子得以顺畅传递，氧气快速消耗，其耗氧率大，为III态呼吸。

ADP耗竭，质子梯度不能消耗，阻碍电子传递，氧气消耗减少，为IV态呼吸。

呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又称呼吸调节比，是指III态（加入ADP）的呼吸速率与IV态（ADP耗竭）的呼吸速率之比。

正常线粒体的RCR为3至10：RCR降低意味着线粒体ATP 合成功能损伤，呼吸障碍；RCR增高意味着细胞活动旺盛，代谢加快。

产品内容介质液（Reagent A）毫升态底物液（Reagent B）微升态底物液（Reagent C）微升产品说明书 1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备CLARK氧电极仪：用于测定溶解氧浓度实验步骤实验开始前，制备好新鲜的线粒体置于冰槽里备用；同时将－20℃冰箱里的试剂融化，并预热氧电极仪到25℃。

然后进行下列操作。

1．加入xx毫升介质液（Reagent A）到反应玻璃槽2．使用微型磁力子搅拌，充分混匀3．密封反应槽4．开始记录氧浓度：起始饱和氧浓度值为0.240微摩尔分子氧/毫升（25℃）5．持续记录1分钟后，注射加入xx微升待测的线粒体（总量2毫克）（注意：氧浓度可能瞬时增加5％）6．持续记录1分钟后，注射加入xx微升态底物液（Reagent B）――开始IV态呼吸（注意：参见注意事项9）7．持续记录2分钟：出现氧浓度缓慢下降）（8．继续注射加入xx微升态底物液（Reagent C注意：氧浓度在10秒钟内开始下滑）――开始III态呼吸（注意：参见注意事项9）9．持续记录直至出现线性下行斜线出现拐点10．分别测算III态呼吸速率和IV态呼吸速率：氧浓度降低值÷实际时间（分钟）11．计算呼吸控制率：III态呼吸速率÷IV态呼吸速率注意事项1．本产品为20次操作2．操作时，须戴手套3．确保反应玻璃槽洁净，密闭，以免氧气流入4．线粒体样品须新鲜制备，建议不要冻存；制备的线粒体膜须完整，非常重要；建议使用GENMED线粒体分离试剂盒－GMS10006.15．注射加入反应槽时，避免气泡和空气注入6．避免乙醇污染；乙醇增加氧浓度；如果底物或抑制剂须使用乙醇溶解，则加注10微升7．保持反应槽温度恒定，温度降低，氧浓度升高8．反应液充分混匀，和环境氧保持平衡9．加注态底物液（Reagent B）和态底物液（Reagent C）前，须充分冻融和混匀10．严格按照规定加注试剂，切莫增加加注试剂容量11．本公司提供系列线粒体检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感。

货号: QS3303 规格：25管/24样线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。

测定原理：还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；试剂二： 5mL×1瓶，-20℃保存；试剂三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存；试剂四：液体10mL×2瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×2支，-20℃保存；试剂六：粉剂×2支，-20℃保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g，4℃离心5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（1）工作液的配制：临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支，将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；（3）在1mL玻璃比色皿中加入80μL样本和800μL工作液，混匀，记录550nm处初始吸光值A1和 37℃反应30min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

GENMED线粒体功能詹纳斯绿B染色试剂盒产品说明书范文(中文版)GMS10015v.A主要用途GENMED线粒体功能詹纳斯绿B染色试剂是一种旨在通过一种毒性较小的碱性染料特异性地使具有活性功能的线粒体呈现蓝绿色，从而判断线粒体功能的完整性的权威而经典的技术方法。

该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。

其适用于各种线粒体（动物、人体、植物、昆虫等）制备物的功能检测。

产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简捷，性能稳定。

技术背景线粒体是细胞中重要的细胞器，其主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。

线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌、肝、肾等器官和组织的细胞中。

大量制备线粒体就是从这些器官组织中提取，或从组织培养细胞中提取。

在光学显微镜下线粒体呈现为颗粒状、棒状或弯曲细线。

詹纳斯绿B（JanugreenB），是一种毒性较小的碱性染料。

它可以对活细胞进行直接染色，在细胞质内可以看到被染成蓝绿色的线状或颗粒小体的线粒体。

线粒体所以能显示出蓝绿色，是由于线粒体中具有细胞色素氧化酶系统，它是染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中的染料被还原呈无色。

产品内容毫升毫升毫升份保存方式保存在－20℃冰箱里；GENMED染色液(ReagentB)，避免光照；有效保证6月用户自备毫升离心管：用于线粒体染色的容器光学显微镜：用于线粒体染色观察分析实验步骤实验开始前，将℃冰箱里的试剂盒中的GENMED染色液（ReagentB）置于冰槽里融化，并放在暗室里。

然后进行下列操作。

一、纯化线粒体染色1．从纯化的线粒体样品中移出至微升（含细胞中提取的线粒体）到新的预冷的毫升离心管，置于冰槽里（注意：线粒体须均匀分布，没有聚集成团）2．加入等量微升的GENMED染色液（ReagentB），轻柔混匀3．放进暗室里，在室温下孵育1分钟4．即刻移取微升到载玻片上，放上盖玻片5．在光学显微镜油镜下进行观察：功能完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或椭圆形颗粒（注意：可见蓝绿色渐渐变淡现象）6．篮绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失二、活体细胞染色1．将待测细胞（某细胞）移入到1.5毫升离心管2．放进微型台式离心机离心1分钟，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf5415）3．小心抽去上清液4．加入微升GENMED清理液（ReagentC）或GENMED保存液（ReagentA）5．加入微升GENMED染色液（ReagentB），充分混匀6．放进暗室里，在冰槽里孵育分钟7．即刻移取微升到载玻片上，放上盖玻片8．在光学显微镜油镜下进行观察：功能完整的线粒体呈现蓝绿色线状或颗粒小体9．篮绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失注意事项1．本产品为20次（活体细胞）或400次（纯化线粒体）操作2．所有操作均须无菌状态下进行3．线粒体样品操作须在低温下进行，且操作快速4．操作时，须戴手套5．建议染色完成后，即刻进行显微镜观察分析6．孵育时，须避免光照7．本公司提供系列线粒体试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能长期稳定2．本产品经鉴定显色清晰使用承诺友情提醒IFITDOESN’TWORK，RECHECKYOURE某PERIMENTTOSEEWHATYOUDIDWRONG。

WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。

例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。

二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。

然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。

WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。

在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。

为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。

内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。

此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。

当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。

WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。

例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。

内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。

Loading Control–WB不可或缺的武器内参的使用――WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！在WB试验中中，最重要和最不可或缺的对照就是内参照（Loading Control，Internal Control）。

内参照的使用有两个方面的作用：1.是检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不料阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下），那么这个体系就是存在问题的了2.半定量的标准：内参一般选择的管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准。

Rabbit polyclonal to beta actin (ab8227) at 1/5000.Lane 1: HeLa whole cell extract (20ug);Lane 2: yeast cell extract (20ug)Lane 3: mouse brain tissue lysate (20ug).Developed using Goat anti-rabbit IgG (HRP) (ab6721) at 1/2000.Don’t be a cowboy, use a Loading Control!WB常用内参及其技术参数：内参名称分子量大小适用范围beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞VCDA1/Porin 31kDa 线粒体COXIV 16kDa 线粒体TBP 38kDa 细胞核Abcam作为全球最大抗体供应商，拥有非常齐全的Loading Control，绝对能满足您WB的需求！WESTERN BLOT 常见问题解答(2007-07-12 16:09:27)分类：转载文章AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

进口内参抗体——在WB实验中为什么需要使用内参抗体？
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"皇冠"抗体因为验证，所以承诺结合完整的标签与内参抗体产品线，我们针对热门核心研究领域，如信号通路、神经科学、细胞骨架、癌症、表观遗传等，精心挑选具有文章热度的关键靶标，推出经过层层严苛质控和品质承诺的“皇冠”抗体。

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样品类型内参抗体理论分子量全细胞/胞浆蛋白β-Actin43 kDaGAPDH37 kDaβ-Tubulin55 kDaα-Tubulin55 kDaCyclophilin B24 kDaCofilin19 kDaVinculin116 kDa线粒体COX IV16 kDaHSP6060 kDaVDAC1/Porin31 kDa核蛋白PCNA29 kDaHistone H315 kDaHDAC156 kDaLamin B166 kDaTBP/TATA38 kDa膜蛋白NaK ATPase113 kDa血清Transferrin77 kDa1产品名称产品货号应用类型Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody (1C7) A01010WB, IHC HRP Conjugated Anti-beta Actin Mouse Mab (1C7) A01015WBAnti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody (2B5) A01020WB, IHC HRP Conjugated Anti-GAPDH Mouse Mab (2B5) A01025WBAnti-β-Tubulin Mouse Monoclonal Antibody (3G6) A01030WB, IHC Anti-PCNA Mouse Monoclonal Antibody (1D7)A01040WB, IHC Anti-Plant Actin Mouse Monoclonal Antibody (3T3)A01050WBAnti-COX IV Mouse Monoclonal Antibody (14Y2)A01060WBAnti-Histone H3 Mouse Monoclonal Antibody (2D10)A01070WB, IF, IP Anti-α-Tubulin Monoclonal Antibody (3G5) A01080WB, IHC, IF, IP Anti-Lamin B1 Monoclonal Antibody (15T1) A01090WB, IPAnti-Rubisco (Large Chain) Monoclonal Antibody (9Y6) A01110WBAnti-TBP/TATA Binding Protein Mab (2C6) A01120WBAnti-Cyclophilin B Monoclonal Antibody (7B2) A01130WB Histone H3 Monoclonal Antibody (1G1)ABM40038WB, IHC, IF, IP Cofilin Polyclonal Antibody ABP51018WB, IHC, IF Histone deacetylase 1 Polyclonal Antibody ABP51519WB, IHC, IF HSP60 Polyclonal Antibody ABP51585WB, IHC, IF Na+/K+-ATPase α1 Polyclonal Antibody ABP51894WB, IHC, IF Vinculin Polyclonal Antibody ABP52701WB, IHC, IF Transferrin Polyclonal Antibody ABP52968WB, IHC VDAC1 Polyclonal Antibody ABP53121WB Na+/K+-ATPase α1 Polyclonal AntibodyWB：使用Na+/K+-ATPase α1检测293细胞裂解液。

WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。

例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。

二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。

然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。

WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。

在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。

为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。

内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。

此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。

当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。

WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。

例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。

内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。

衰老过程中线粒体顺乌头酸酶活性变化对能量合成的影响叶薇;陈赛慧;郝东杰;郑屹;曹建明;吕建新【摘要】AIM:To investigate the effect of mitochondrial aconitase (ACO2) on energy synthesis during aging in male SD rats and D-galactose-induced cell aging model.METHODS:D-galactose at concentration of 55 mmoL was used to establish MRC-5 cell aging model.Intact mitochondria in the rat brain and MRC-5 cells were isolated by a sucrose density gradient centrifugation.The formation of NADPH was used to represent the ACO2 activity and determined by observation of the absorbance at 340nm.Fluorescence quantitative PCR and Western blotting were applied to detected ACO2 expression.Superxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content were measured by the commercial assay kits.The tissue iron content was detected by ferrozinemethod.Mitochondrial membrane potential was detected by JC-1mitochondrial membrane potential detection kit.The content of ATP,ADP and AMP was measured by HPLC analysis,and the energy charge was then calculated by theformula.RESULTS:ACO2 activity and iron content presented age-related decline and increase,respectively,while the expression level of ACO2 kept stable.ACO2 activity significantly declined when the cells were treated with hydrogen peroxide at different concentrations.In the aging cells,SOD activity and ACO2activity were decreased and MDA content was increased significantly,while the expression level of ACO2 was unchanged.During aging,mitochondialmembrane potential,ATP synthesis and energy charge presented significant reduction.CONCLUSION:The activity of ACO2,which is sensitive to oxidative stress,declines during aging,and may affect the efficiency of the Krebs cycle.At the same time,mitochondrial membrane potential decreases,thus reducing the energy synthesis in mitochondria.%目的:利用自然衰老雄性SD大鼠和D-半乳糖(D-Gal)诱导的细胞衰老模型,研究在衰老细胞中线粒体顺乌头酸酶(mitochondrial aconitase,ACO2)活性的变化及其对能量合成的影响.方法:利用55 mmol/L D-Gal诱导人胚肺成纤维细胞MRC-5衰老,并采用蔗糖连续密度梯度离心法分离大鼠脑组织和MRC-5细胞的线粒体；ACO2活性根据反应产物NADPH在340 nm的吸光度变化率进行检测,其表达水平分析分别用荧光定量PCR和Western blotting完成；利用试剂盒检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量以反映细胞氧化还原状态；组织铁含量的检测则通过菲咯嗪法进行；线粒体膜电位及腺苷酸含量分别应用JC-1荧光探针法和高效液相色谱法检测,并计算能荷.结果:随着大鼠月龄增加,ACO2活性逐渐下降,表达水平无明显差异,组织铁水平逐渐升高；体外氧化应激实验显示ACO2活性随H2O2处理浓度和时间增加而下降；细胞衰老模型中,SOD活性降低,MDA含量升高,ACO2活性下降而表达水平未变；自然衰老大鼠和细胞衰老模型中,线粒体膜电位、ATP 合成与能荷呈明显下降趋势.结论:衰老过程中,随着氧化压力增加,氧化应激敏感的ACO2活性下降,影响三羧酸循环效率,同时伴线粒体膜电位下降,进而使得能量合成降低.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2013(029)007【总页数】8页(P1275-1282)【关键词】衰老;线粒体;顺乌头酸酶;能量合成;氧化性应激【作者】叶薇;陈赛慧;郝东杰;郑屹;曹建明;吕建新【作者单位】温州医学院检验医学与生命科学学院,浙江温州325035;温州医学院检验医学与生命科学学院,浙江温州325035;温州医学院检验医学与生命科学学院,浙江温州325035;温州医学院检验医学与生命科学学院,浙江温州325035;温州医学院环境与公共卫生学院,浙江温州325035;温州医学院检验医学与生命科学学院,浙江温州325035【正文语种】中文【中图分类】R34线粒体不仅是真核细胞能量合成和活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的主要场所，线粒体内DNA、蛋白质和脂质更易成为ROS作用的位点。