第六章 蛋白质定量和定性分析

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蛋白质定性
蛋白质定性分析是根据蛋白质相关性质对蛋白质的种类进行分析，定性蛋白质组学指在组学水平上进行蛋白质定性分析。

百泰派克生物科技提供蛋白质定性分析以及蛋白质组学定性分析服务。

蛋白质定性分析
蛋白质定性，指通过非量化的手段分析蛋白质性质以确定蛋白质的种类。

蛋白质分子非常复杂，与其性质相关的特征参数有很多，包括蛋白质的分子量、等电点、氨基酸序列（一级结构）、高级结构、以及蛋白质间的相互作用等等。

利用蛋白质的这些性质参数，可以借助相关的仪器设备进行蛋白质定性分析。

蛋白质定性的常见方法包括有电泳（如SDS-PAGE）、层析、ELISA、western blot、图像分析技术、测序（如基于Edman降解的N端测序）以及质谱法等。

蛋白质定性检测有助于推断蛋白质的功能和作用机理，且在对蛋白质进行定量之前可先进行定性分析。

蛋白质定性。

蛋白质组学定性分析
蛋白质组学定性分析指在组学水平上对蛋白质进行定性分析，也称为定性蛋白质组学。

定性蛋白质组学研究的方法有多种，其中基于质谱的方法是蛋白质组定性检测的主要方法之一。

质谱可以通过分子量测定、N/C端测序、全序列分析以及翻译后修饰分析等大规模、高通量地进行蛋白质组定性。

蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。

原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。

然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。

优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。

缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。

1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。

原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。

优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

1.3 Folin酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。

同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。

在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。

优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。

缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。

1.4 紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。

此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。

利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。

优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。

缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。

蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。

为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。

一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。

该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。

这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。

2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。

常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。

这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。

比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。

3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。

分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。

二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。

在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。

蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。

蛋白质定量与定性分析报告蛋白质定量分析与定性分析报告此次“蛋白质定量分析与定性分析”报告总共包括蛋白定量、蛋白简单定性、蛋白功能定性三个部分组成。

师兄的报告内容翔实，介绍生动，让我受益匪浅。

1. 蛋白质定量分析蛋白质定量分析是确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白的含量。

蛋白质的定量分析一般可从三个方面入手，一是基于蛋白质的元素组成特点，二是基于蛋白质的化学显色反应，三是基于蛋白质的光吸收特性。

蛋白质定量分析的方法有:280紫外吸光比色法、经典Bradford与Lowry检测法、BCA(二喹啉加酸)检测法、疏基测定检测法。

280紫外吸光比色法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分及其含量，通常用于柱层分析过程中检测蛋白质的洗脱峰。

如下图，蛋白质中的Trp、Tyr、Cys残基含有共轭双键，在280nm有一紫外吸收高峰。

在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度成正比，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。

可以通过A280与A260的差值来计算出蛋白质浓度，如:蛋白质浓度(mg/l)=1.45×A280-0.74×A260。

蛋白质的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽键引起。

可通过214nm与225nm的差值来计算出蛋白质的含量。

较为精确的公式为: ε(280) (M-1 cm-1)= (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125).1.2 经典Bradford与Lowery检测法1.2.1 Bradford检测法这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。

该法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。

在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当于蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。

蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白的含量。

蛋白质组学定量分析的方法
蛋白质组学定量分析的方法主要有两种：定性分析和定量分析。

1. 定性分析：常用的定性分析方法有蛋白质质谱技术，如蛋白质液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）。

这些方法能够对样品中的蛋白质进行分离、鉴定和定性分析，可以确定蛋白质的氨基酸序列和特定的修饰情况。

2. 定量分析：常用的定量分析方法有标记蛋白质定量和非标记蛋白质定量。

标记蛋白质定量方法包括同位素标记法和化学标记法。

同位素标记法主要包括稳定同位素标记法（如氘代谱标法）和放射性同位素标记法（如放射性同位素测量法）。

化学标记法主要包括功能分子标记法（如荧光标记法和生物素标记法）和反应性标记法（如对硝基苯甲酸标记法和丙煮醛标记法）。

非标记蛋白质定量方法常用的有相对定量法和绝对定量法。

相对定量法主要通过蛋白质相关的性质，在样品中不同蛋白质的含量所具有的差别来进行定量。

常用的相对定量方法有比较蛋白质的荧光标记法、差减荧光凝胶法和差异凝胶电泳法等。

绝对定量法主要使用内标法，通过加入已知浓度的内标蛋白质来计算目标蛋白质的浓度。

常用的绝对定量方法有多重反应监测法（MRM）和定量蛋白质标准曲线法等。

蛋白质定量分析方法蛋白质定量是蛋白质研究中非常重要的一项工作，它用于确定样品中蛋白质的浓度。

在蛋白质研究中，常常需要确定样品中蛋白质的浓度，以便进行后续的实验和数据分析。

当前常用的方法包括光谱法、比色法、生物学活性测定法和质谱法等。

下面将对这些方法进行详细阐述。

光谱法是一种常用的蛋白质定量方法，它是通过测量蛋白质溶液在特定波长下的吸光度来确定蛋白质的浓度。

在这种方法中，常用的波长是280nm，因为大部分蛋白质在这个波长下有较高的吸光度。

通过测量蛋白质溶液的吸光度值，可以使用比色法或者标准曲线法来计算蛋白质的浓度。

光谱法的优点是操作简单，不需要复杂的设备和试剂，而且可以同时测定多种蛋白质。

但是，光谱法对于一些特殊蛋白质和杂质的检测有一定的局限性。

比色法是蛋白质定量中常用的一种方法，它是通过比较样品和标准溶液的颜色差异来确定蛋白质的浓度。

比色法的原理是，蛋白质与某些特定试剂反应后，可以形成有颜色的复合物。

一般来说，蛋白质和某种染料或金属离子反应会产生特定的吸光峰，通过测量这个吸光峰的强度，可以确定蛋白质的浓度。

比色法的优点是快速、准确，适用范围广，且可以同时测定多种样品。

然而，比色法也存在一些问题，比如可能受到样品中其他物质的干扰，以及对试剂的选择和操作有一定的要求。

生物活性测定法是一种基于蛋白质的生物学活性特性来确定蛋白质浓度的方法。

在这种方法中，通过测定蛋白质的生物学活性，如酶活性、生物修复能力等，来推断蛋白质的浓度。

生物活性测定法在一些特定情况下非常有用，比如检测蛋白质的功能状态或者酶的活性。

但是，生物活性测定法也存在一些问题，如操作复杂、结果受到其他因素的干扰等。

质谱法是一种高灵敏度的蛋白质定量方法，它是通过测定样品中蛋白质产生的质荷比来确定蛋白质的浓度。

质谱法可以使用质谱仪来进行分析，通过电离和分离蛋白质，然后测定质荷比，计算样品中蛋白质的浓度。

质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优点，能够检测到非常低浓度的蛋白质。

蛋白质定量和定位技术蛋白质是构成生命体的基本组成部分之一，其功能涉及到生命的各个方面。

而蛋白质的定量和定位对于理解和掌握生命体系的运作机制至关重要。

本文将介绍蛋白质定量和定位技术。

一、蛋白质定量技术1. Bradford法Bradford法是蛋白质浓度定量的一种常用方法，基于蛋白质与Bradford试剂(Folin试剂改进版)间的相互作用。

试剂中所含的酸性染料与氨基酸中的游离氨基结合，导致吸收峰的变化量与蛋白质浓度成比例。

这种方法的优点是响应灵敏，测量范围广，但缺点则是受蛋白质成分的影响较大。

2. 比色法比色法是一种通过与标准品比较，测定样品中蛋白质浓度的方法。

常用的比色法试剂有Lowry试剂和Biuret试剂。

在Lowry试剂中，蛋白质发生与Cu2+ 氧化还原反应，可测量出吸光度，从而得到样品中蛋白质浓度。

Biuret试剂则是用含有铜离子的碱性蓝色溶液加热处理，产生紫色蛋白质-铜离子络合物，其吸收峰与蛋白质浓度成比例。

比色法响应较迅速，测定范围广泛，但需要标准品浓度的准确度。

3. BCA法BCA法是通过Cu2+-蛋白配合物催化四偏磷酸钠还原成紫色络合物，从而测量蛋白质浓度的一种方法。

这种方法响应灵敏、低成本，对于某些蛋白质（如胶原蛋白）也非常准确。

二、蛋白质定位技术1.免疫印迹法免疫印迹法通过将分离出来的蛋白质经SDS-PAGE凝胶电泳分离，再将其转移到PVDF膜或者nitrocellulose膜上，用特异性的第一抗体结合到蛋白质上，再用辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶作为第二抗体进行检测。

这种方法广泛用于测定单个蛋白质的存在量，并且可以该寻找和鉴定肿瘤标记物，抗原表达差异和突变蛋白。

2.荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是对细胞基因组探针进行荧光标记，通过与特定蛋白质的结合实现定位。

这种方法广泛用于研究某些肿瘤基因定位，病毒颗粒定位和加速器束流束团的定位。

3.三维结构分析三维结构分析是通过解析多个组分（如抗体和蛋白质）的原子坐标定位蛋白质的方法。

蛋白质定性、定量分析蛋白质定性定量分析（图片来源：百泰派克生物科技）蛋白质定性、定量分析随着质谱技术的飞速发展，利用质谱技术进行蛋白质（组）的定性和定量分析得到更为广泛的应用和研究。

1. 蛋白质定性分析：确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质。

蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。

蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。

目前，bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。

Bottom-Up（自底向上）和Top-Down（自顶向下）两种策略“自底向上”策略是指通过分析由蛋白质酶解生成的肽段来鉴定蛋白质。

当应用该策略来分析蛋白质组混合物时，因其类似于基因组测序的鸟枪法，所以又被称为鸟枪法蛋白质组学（Shot-gun Proteomics)。

“自顶向下”策略直接鉴定完整蛋白质，在翻译后修饰和蛋白质同素异构体鉴定方面有一些潜在的优势。

可是该策略的缺陷是蛋白质在气相中分离、电离及碎裂都十分困难。

而鸟枪法蛋白质组学由于将蛋白质酶解成肽段，使其在气相中更容易被分离、电离和碎裂。

2. 蛋白质定量分析：确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量。

蛋白质相对定量分析相对定量的目的是测定目的蛋白在两个或多个样本中的表达量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的表达量。

例如，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本做为对照组，经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的蛋白含量相对于对照组样品的百分比。

蛋白质绝对定量分析目前基于质谱的绝对定量蛋白质组学研究主要是指靶向蛋白质组学。

靶向蛋白质组学分析，是指对目标蛋白质（或修饰肽段）进行定性和/或定量分析，或者用于验证大规模蛋白质组学的结果。

基于质谱的靶向蛋白质组学分析方法，由于没有物种限制并具备多目标同时分析能力等优势，受到越来越多的关注和应用。

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蛋白质质谱定性定量
对蛋白质进行定性定量鉴定即对目标蛋白的种类和含量进行鉴定是蛋白质组学研究中最基本的研究内容。

质谱技术是目前常用的蛋白质组学分析技术，它基于蛋白肽段离子的质荷比（m/z）和离子峰强度信息可实现蛋白质的定性和定量鉴定。

在质谱分析中，蛋白质先被酶解消化为小分子的肽段，小分子肽段在离子源中电离成肽段母离子，再利用质量分析器检测肽段母离子的质荷比和离子峰强度。

将肽段离子的质荷比数据与理论数据库进行比较、匹配可以确定其分子质量，进而获得该肽段的氨基酸组成，通过各肽段之间的拼接最后确定完整蛋白的分子量和氨基酸组成信息以实现定性鉴定。

肽段母离子的浓度与样品量成正相关，样品量越多，其产生的肽段离子就越多，相应的离子峰信号强度就越大，因此可以利用离子峰信号强度进行蛋白的含量测定。

若引入已知浓度的标准品（内标肽）还可以对蛋白进行精确的含量测定。

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蛋白质的定量分析方法
检测蛋白质含量的方法有多种，常见的包括凯氏定氮法、生物素标记法、吸光光度法等。

1.凯氏定氮法（Kjeldahlmethod）：这是一种经典的蛋白质定量方法，主要通过测定样品中氮元素的含量来计算蛋白质含量。

凯氏定氮法包括消解、蒸馏和滴定三个步骤，其原理是将样品中的氮元素转化为氨氮，然后通过滴定测定氨氮的含量，进而计算蛋白质含量。

2.生物素标记法（Biotin-labelingmethod）：这是一种利用生物素（Biotin）与蛋白质特异性结合的方法来检测蛋白质含量。

首先将生物素标记到目标蛋白质上，然后利用亲和层析法（如生物素-亲和素系统）进行定量分析。

3.吸光光度法（Absorbancemethod）：这是一种基于蛋白质在紫外光区域的吸收特性进行定量分析的方法。

蛋白质中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）具有在紫外光区域（如
280nm）的吸收特性，通过测量样品在这一波长处的吸光值，可以计算蛋白质含量。

各种方法适用于不同的实验条件和要求，选择合适的方法需要根据实际情况来判断。

在实际操作过程中，还需注意遵循实验规程，确保实验结果的准确性。