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第二章 工业发酵菌种选育

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2-第2章--发酵工业菌种选育

2-第2章--发酵工业菌种选育
2016/12/13
2.1.1.2工业发酵常见微生物及其代谢产物
(4) 酵母菌及其代谢产物
发酵工业常用的酵母有啤酒酵母、卡尔斯伯酵母、德巴 利氏酵母、汉逊氏酵母、假丝酵母和毕赤氏酵母等。 酵母细胞本身含有丰富的蛋白质、维生素以及各种酶类， 工业上常通过培养酵母制造单细胞蛋白，以供食用或作 饲料蛋白，或用来制取核糖核酸、核苷酸、核黄素、细 胞色素c、辅酶A、凝血质、转化酶和乳糖酶等。 在发酵工业上，经常利用酵母的代谢进行啤酒、白酒、 黄酒和果酒等各种饮料酒的酿造，以及生产乙醇、甘油、 有机酸及麦角固醇等多种产品。
2016/12/13
菌种选育有何意义？
菌种选育的意义：
提供产量
提高产品质量 改善加工工艺和开发新产品。 在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种 的遗传学性质
2016/12/13
2.1 工业发酵生产菌种 2.1.1 工业发酵微生物及其代谢产物 在工业发酵工程中，经常用到的生产菌种 是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。
图2-1中简要阐明了初级代谢途径与次级代谢 途径的联系与区别。
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糖类
磷酸戊糖途径
核酸类 多糖类 糖苷类
核苷类抗生素 糖苷类抗生素 糖衍生物类抗生素
糖酵解
4-磷酸赤藓糖
图2-1 初级代谢与 次级代谢的关系
莽草酸 磷酸烯醇 式丙酮酸 芳香族氨基酸 丙酮酸 脂肪族氨基酸 乙酰CoA CO2 乙酰CoA 脂肪酸 大环内酯类抗生素 四环素 灰黄霉素 黄曲霉毒素 蛋白质 多肽类抗生素 β-内酰胺类抗生素 氨基酸衍生物类 氯霉素
此外，有的放线菌还用来生产维生素和酶制剂， 有的放线菌用于甾体转化。
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2.1.1.2工业发酵常见微生物及其代谢产物

发酵学第2章工业微生物菌种选育

发酵学第2章工业微生物菌种选育
4、从突变到突变型
表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变 分离型迟延 (基因杂合)
经诱变处理后，细胞中的基因处于 不纯的状态，突变型基因由于属于隐 性基因而暂时得不到表达，需经过复 制、分离，在细胞中处于纯的状态时， 其性状才得以表达。
生理性迟延
新的表型必须等到原有基因的产物 稀释到某一程度后才能表现出来。
第一节 概述 第二节 自然选育 第三节 诱变育种 第四节 杂交育种
第一节 概述
一、工业微生物 二、发酵工业对菌种的要求 三、菌种选育的目的 四、菌种选育的基本理论 五、菌种来源
第一节 概述
一、工业微生物 1.细菌
2.放线菌（单细胞原核微生物）
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
(CGMCC)
中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM——管理机构
订购程序
申请 生物安全性说明 确认 订货
第二节 自然选育
一、定义 二、方法 三、特点及应用
第二节 自然选育
一、定义
自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，
根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。
自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下
第三节 诱 变 育 种
三、诱变育种的主要环节
1.出发菌株的选择 2.诱变处理 举例 3.筛选 4.突变菌株高产基因的表达
1.出发菌株的选择
选择纯种菌株（排除异核体） 优良性状的菌株（产生孢子、生长速度） 对诱变剂敏感的菌株 同时选择几株不同的优良菌株
2.诱变处理
1）诱变剂的选择
2、菌种遗传特性的改变
1）异核现象--导致菌种这一微生物群体发生同
菌种遗传特性发生改变

《工业发酵菌种选育》PPT课件

《工业发酵菌种选育》PPT课件
应用：乳酸、干 酪、奶子酒、发 面、泡菜、酸奶 等的制作
枯草芽孢杆菌
应用：生产淀粉酶、
蛋白酶等
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2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母、毕赤氏酵母
应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡 和制取蛋白质、生产脂肪
7
面包酵母
啤酒酵 母
红酵 8 母
3、霉菌
曲霉属
应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶
第二章 工业发酵菌种来源及选育
第一节 工业发酵生产菌种
一、微生物工业对菌种的要求
微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界
中，其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野 生型，有的是通过诱变得到的突变体。
发展趋势： 从野生型
变异株
自然选育
代谢控制育种
诱变育种
基因工程定向育种
1
微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：
方法：控制一定的养分（碳源或氮源）；控制一定的培养 条件（温度、pH、底物等）。
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混 杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增 殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制 得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、 稀释分离法、组织分离法。
19
培养条件控制
营养成分控制、控制培养基的pH、添加抑制剂、热处理、 控制培养温度、控制通气量
问题？
1、如何控制营养成分，分离自养型微生物、固氮菌、纤 维素酶菌、几丁质酶菌？ 2、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉？ 3、分离放线菌、细菌、霉菌时，选择哪些抑制剂？ 4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么？厌氧培养 中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么？ 5、如何分离芽孢菌？

生物工艺学第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏

生物工艺学第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏

冷冻速度的控制
缓慢冷冻可使细胞内的水分逐渐移向细胞外，减 少冰晶形成时对细胞的损伤。
解冻过程
解冻时应缓慢升温，避免因温度骤升造成菌种死 亡。
干燥保藏法
干燥方式的选择
可选择自然干燥、真空干燥、 喷雾干燥等方法进行菌种干燥
。
菌种处理
在干燥前应对菌种进行适当处 理，如细胞破碎、离心分离等 ，以去除多余水分。
种子制备流程
种子质量对发酵的影响
种子质量的好坏直接影响到发酵产物 的产量和质量。
包括斜面菌种活化、扩大培养、种子 罐培养等步骤。
发酵过程控制
发酵参数
包括温度、压力、pH值、溶 氧浓度等，这些参数对发酵 过程和产物产生有重要影响
。
发酵过程控制策略
根据不同参数的变化情况， 采取相应的控制措施，如调 节温度、搅拌速度、通气量 等，以保证发酵过程的稳定
保存容器
选择适当的容器，如玻璃瓶、 金属罐等，以隔绝空气和水分 ，保持干燥状态。
保存环境
干燥保藏的菌种应置于干燥、 阴凉、通风良好的地方，避免
阳光直射和潮湿。
定期复壮法
接种培养
01
定期将保藏的菌种接种到新鲜培养基上，使其重新生长繁殖。
培养条件控制
02
保持适宜的培养温度、pH值、氧气等条件，促进ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ种的生长繁
100%
选育流程
从自然界中采集样品，分离纯化 菌株，进行培养和筛选，最终确 定优良菌株。
80%
应用范围
适用于传统发酵工业和自然环境 中存在的微生物。
诱变育种
选择标准
选择具有高产、高稳定性、高 耐受性等优良性状的突变菌株 。
选育流程
利用诱变剂处理微生物，诱发 基因突变，通过筛选和培养， 获得具有优良性状的突变菌株 。

第二章 发酵工业菌种选育及保藏

第二章 发酵工业菌种选育及保藏

生长谱测定的方法
将缺陷型菌株培养后，收集菌体，制备成
细胞悬液，与MM 琼脂培养基混合并倾注平 皿。凝固后，分别在平皿的5 ～ 6 个区间放 上不同的营养组合的混合物或其滤纸圆片。 培养后会在某组合区长出菌落，就可测得 所需营养。
缺陷型的浓缩：
恒温箱中培养。 二平皿相同方位进行比较，可发现在 MM
平皿上长出的菌落少于 CM 平板。 MM 上未 长而相应于 CM 上长出的那几个菌落就可 能是缺陷型。
要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应
有一定间隔。
(2)点种法
任意法。
用接种针或牙签将 CM上长出的菌落在 MM和
CM两平板上接种，依次在相应位置点种，然 后一起培养，观察其生长情况。 结果明确，但工作量大。
(3)夹层法
先在培养皿上倒一层 MM ，凝固 MM ， 培养 24h ，将出现的菌落标记，然后倒上 一层 CM ，再培养。第二批长出的菌落可 能是缺陷型。 缺点 : 结果有时不明确，将缺陷型菌落从 夹层中挑出并不很容易。
营养缺陷型生长谱的确定

验证确定是缺陷型后，需确定其缺陷的 因子，即生长谱测定。

方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小 时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几 代，以得到纯的变异细胞。 若不经液体培养基的中间培养，直接在平 皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在 于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造 成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
(5）分离和筛选
筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量

举例
一、紫外线的诱变育种

紫外线诱变一般采用 15W 紫外 线杀菌灯，波长为 2537A ．灯与 处理物的距离为 15 ～ 30cm ，照 射时间依菌种而异，一般为几秒 至几十分钟。一般我们常以细胞 的死亡率表示，希望照射的剂量 死亡率控制在70～80%为宜。

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育

2、大肠杆菌 (Escherichia coli)
➢ 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 ➢ 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸 的定量分析 ➢ 基因工程的很好材料
3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)
➢ 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧 ➢ 可生产乳酸 ➢ 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作
第一组 长宽比为1～2 细胞多为圆形、卵圆形； 主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包
第二组 长宽比为2 多供生产葡萄酒、果酒用
第三组 长宽比大于2 耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用
啤酒酵母在液体培养基中的生长行为有两类：
上面酵母—发酵度较高，不易凝集沉淀，浮于上面
下面酵母—发酵度较低，易凝集沉淀
➢ 与一般放线菌不同，菌丝体长入 培养基内，不形成气生菌丝，而在 基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端 生一个球形、椭圆形孢子。
➢ 菌落致密，与培养基紧密结合在 一起，表面凸起，多崎岖，疣状； 菌落常为橙黄色、红色、深褐色、 黑色和兰色。
➢ 可产多种抗生素，如产庆大霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

抑菌圈法
透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
举例:产植酸酶黑曲霉的分离
植酸酶是催化植酸及其盐类水解 成肌醇与磷酸的一类水解酶的总称 植酸即肌醇六磷酸脂。植酸及其 盐类是植物中磷的主要贮存形式。 植酸酶广泛存在于小麦、大麦、玉 米等植物的种子中，但含量较低。 细菌、酵母和丝状真菌等也是植酸 酶的重要来源。
5g 土样 45ml dH2O 玻璃珠
3、含微生物样品的采集
较复杂；应根据分离目的灵活掌握 土壤（ 丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）
食品 、海水、动物、植物、极端环境
根据微生物的营养类型采样
森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素， 肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶 适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。 产生菌。 根据微生物的生理特性采样 面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样 筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样 ；
分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈 法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产 酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明 圈
如何分离磷细菌？
聚赖氨酸产生菌 （带正电、加美兰、排斥 呈现透明圈）

第2章 发酵工业菌种

第2章 发酵工业菌种

（3）诱饵法： 将一些固体物质加到待分离的土壤或 水中做成诱饵富集目的菌。 2.2.3 富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营养 的要求不同，投其所好取其所抗，使目的 菌成为人工环境下的优势菌。
（1）控制培养基的营养成分：如唯一碳源 （2）控制培养条件：如T、DO、pH、添加 抑制剂等 2.2.4 菌种分离 常用的纯培养分离方法有： （1）平板划线法 （2）稀释分离法 （3）简单平板分离法 （4）涂布分离法 （5）毛细管分离法 （6）小滴分离法
5、液氮超低温保藏法 ①方法：准备安瓿管 制备菌悬液 分装和 熔封安瓿管 冷冻 保藏 复活 ②原理：超低温，M的所有代谢活动暂时停止 ③适用范围：除少数对低温损伤敏感的M外，该 法适用各类M ④保存期限：一般可达4—15年 ⑤优点：保存期长、变异小、适用范围广 ⑥缺点：需特殊设备，液氮消耗多、操作费用 高、操作复杂
从自然界分离筛选菌种的一般步骤： 样品采集 样品预处理 富集培养 菌种分离 初筛、复筛 性能鉴定 2.2.1 样品采集 总原则是：（1） 样品来源越广，获得新菌种 的可能性越大； （2）要了解目标产物的性质和可能产目标产 物的微生物种类及其生理特征。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本 相同，但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进 行次级代谢。 ②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生 长环境等。
第2章
发酵工业菌种
• 在发酵工业中，工业生产水平主要由三个 要素决定，即： 1、 生产菌种性能 2、发酵及提取工艺条件 3、 生产设备 其中，生产菌种是最重要的因素，是发酵 的灵魂。
2.1 发酵工业常用菌种
一、发酵工业对菌种的要求 1 菌种不能是病源菌 2 发酵周期短，生产能力强 3 发酵过程中不产或少产与目标产物性质相 似的副产物 4 原料来源广价格低廉，菌种能高效地将原 料转化成产品 5 对需添加的前体有耐受能力，且不能将前 提作为一般碳源利用

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育

发酵工程第二章 发酵工业菌种的选育
微生物工程工业生产 水平的三个决定要素:
生产菌种的性能 生产设备 发酵和提取工艺条件
优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生 产的第一环节。
第二章 发酵工业菌种的选育
2.1 发酵工业常用菌种 2.2 发酵工业菌种的分离筛选 2.3 发酵工业菌种鉴定 2.4 发酵工业菌种改良 2.5 发酵工业菌种保藏
• 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。
2.2发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离 将混杂着各种微生物的样品按需要和菌株的特性迅 速、准确、有效的方法对其进行分离、筛选，得到所需微生 物的过程。
菌种分离方法 依据生产需要、目的代谢产物性质、可能 产生所需目的产物的微生物种类、微生物分布、理化特性、 生活环境等，设计选择性高的分离方法。
➢ 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以用淀粉生产黄原胶
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
G-细菌，能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡 萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化； 有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（二） 放线菌
• 菌落呈放射状，原核微生物类 群，在自然界中分布很广，尤 其在有机质丰富的微碱性土壤 中较多。 • 大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素（12 000余种， 60%左右来自放线菌），经济 价值大。革兰氏阳性、高( G + C) mol% 含量( >55% )
近年来，利用啤酒酵母提取核酸、麦角固醇、 细胞色素C、凝血质和辅酶A等；生产单细胞蛋白 (SCP) 、药用和作为饲料；它的转化酶可用于转 化蔗糖，制造酒心巧克力。
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)

02 工业发酵菌种选育

02 工业发酵菌种选育

二、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高
效地合成产物
菌种可以在要求不高，易于控制的培养条件下迅
速生长和发酵。
生产菌种要纯粹，不易感染其它微生物或噬菌
体，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质 量的稳定性。
生产菌及其产物的毒性必须考虑
三、 工业上常用菌种
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌 醋酸杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。
物理：紫外线，快中子，X射线，γ 射线，激光
诱变剂
{
化学：碱基类似物、与碱基反应的物质
• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
确定出发菌株 ↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓ 制备单细胞（或单孢子）悬液 ↓←活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓ 诱变处理 ↓ 平板分离 ↓计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 ↓ 突变体的初步筛选 ↓←用简单快捷的方法 重复筛选 ↓←摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复 诱变处理）
①斜面低温保藏法（低温） 斜面菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代（一般保存
期为3~6个月 ） ②石蜡油斜面低温保藏法（低氧、低温）
橡皮塞取代棉塞、加石蜡油4℃冰箱保藏（可保藏 1年）。 ③沙土管保藏法（低温、缺氧、缺养、干燥） 将菌种灭菌干燥的沙土中，抽真空干燥后封口， 4℃冰箱保藏（保藏2~10年）。
生产性能测定
目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
（二）诱变育种
• 以微生物的自然变异作为基础的生产选种 的机率很低，一个基因的自然突变频率仅 10-6～10-10左右。 • 以诱发突变为基础的育种，是国内外提高 菌种产量、性能的主要手段。

工业发酵菌种选育

工业发酵菌种选育
进一步应用选择性控制条件分离
纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法等
现代发酵技术
稀释分离法
现代发酵技术
平皿划线分离法
a.分区划线分离法
b.连续划线分离法
现代发酵技术
菌种筛选（初筛+复筛）
（1）平板筛选（初筛）
从产物角度出发
根据产物的性质有目的地设计培养基来筛选菌种
从形态角度出发
现代发酵技术
抑菌圈法
测试菌苔 含药物滤纸
抑菌圈
琼脂培养基
现代发酵技术
其他鉴定—毒性试验
自然界天然微生物可能产生毒素
据规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲
霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作 为与食品工业有关的菌种，均需通过两年以上的毒性试验。
现代发酵技术
2、诱变育种
从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。
现代发酵技术
二、菌种选育的主要目的
提高产量
改进质量
增加新品种 改善工艺条件
现代发酵技术
实
例
工业生产菌
不再分泌黄色色素
原始产生菌 青霉素产生菌产黄色色素
土霉素产生菌产大量泡沫
泡沫减少
红霉素产生菌不耐噬菌体
2、工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单
遗传性能相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体
产生菌及其产物的毒性低
生产特性要符合工艺要求
现代发酵技术
3、理想的生产菌种
生长繁殖迅速； 产量高； 易培养； 发酵周期短； 耐噬菌体； 纯种。
如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。

发酵工程第2章_菌种选育

发酵工程第2章_菌种选育

• 脂肪酶产生菌的分离
• 为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色 圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作 为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性 的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明 B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。
• 乙醇产生菌的分离
• 通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙 醇的菌株。
4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、 2天。
5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调 节到与试样的生态系统参数值相近。
37
五、自然界中细菌的分离
（三）分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常 用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 淀粉酶产生菌的分离：
• 分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为 惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过 培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂， 根据菌落周围是否出现透明的水解圈来 区别产酶菌株。
• 碘可以杀菌，一旦染色就很容易把细菌杀死，而曲利 苯蓝只是对细菌有影响但不会杀死。，建议选用0.0050.01%含量。
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。
• 选择性地添加抗生素。 • 分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养
箱中存放3天。
• 在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层 含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和 NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的 电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡 白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。

第二章发酵工业菌种

第二章发酵工业菌种

B. 固体培养技术
常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质
2.1.4、菌种的分离
(一) 稀释涂布法 把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释， 取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培 养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取 需要的菌落移到斜面培养基上培养。
11.稀.稀释释平平皿皿分分离离法法
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。
形态、营养要求、生理生化特性、发酵周期、耐 受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值 等。
结果有两种可能：
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于
工业目的的优良菌株 ；
设计筛选方案时必须考虑两个要点
▪ 选择性 ▪ 灵敏度
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法
菌种的营养特征独特 生长特征独特
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从 而实现定向富集筛选。
菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性

发酵工程第二章发酵工业菌种ppt课件

发酵工程第二章发酵工业菌种ppt课件

样品充分混匀； 每支移液管及涂布棒只能接触 一个稀释度的菌液；
同一稀释度三个以上重复,取平 均值；
每个平板上的菌落数目合适， 便于准确计数；
①初筛
初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛 选出来的过程。初筛可分为两种情况进行：
a.平板筛选 对于在分离纯化阶段没有进行平板定性法挑选 出来的菌株，可以先进行平板定性筛选。在初筛时，使 用平板快速检测法，将复杂而费时的化学测定改为平板 上肉眼可见的显色或生化反应，可以减少筛选的工作量， 大幅度地提高筛选效率。
研究方法 1、模拟自然培养法：原位培养、培养条件优化、单细胞操作。
2、宏基因组分析法：测序分析未培养微生物的基因组，结合蛋白质组学， 了解其代谢途径、基因表达调控机制等。
第二节 发酵工业菌种的分离筛选
菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保 藏部门索取或购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微生
物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成
为人工环境下的优势种。
3. 富集培养
富集培养的策略 （1）控制培养基的营养成分 用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。 可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。
例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有 利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯 种分离就会顺利得多。
在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种的 遗传学性质
2.1 工业发酵菌种概述
10
1
微生物物种
100 已发现物种
被利用物种
细菌
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镁0.05%、硫酸亚铁0.001%
次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机
体初生级长与代繁谢殖与所次必级需代的物谢质的，关也系有：人把超出生理需求的过量初级
代谢产物也看作是次级代谢产物。
次1级、代存谢在产物范通围常及都产分物泌类到胞型外不，同有些与机体的分化有一定的关
系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用。
诱变选育 • 能对生产菌种进行合理保藏
第一节 工业发酵生产菌种
一、工业发酵微生物及其代谢产物
（一）微生物代谢产物的类型
1、初级代谢产物 初级代谢主要是把营养物质转化为机体结构和生理活
性物质以及提供能量的代谢作用。 微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖
所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。 初级代谢产物：中间代谢物、前体物、高分子物质以
可以从自然界中先分离出相 应的菌种，再用物理或化学 的方法使菌种产生突变，从 突变个体中筛选出符合生产 要求的优良菌种。
怎样才能得到 优良的菌种呢？
•如果生产的是一般微生物不能 合成的产品
可用基因工程、细胞工程的方法 对菌种的遗传特性进行定向改造， 以构建工程细胞或工程菌，从而 达到生产相应产品的目的
（2）控制一定的培养条件 如pH值、温度、压力、以及
抗生素等。
（三） 纯种分离
纯种分离的原因？ 微生物太多；杂菌没有完全死亡；细
菌的孢子存活力极强等。 常见的纯种分离方法：
（1）划线分离法 （2）稀释分离法 （3）组织分离法
划线分离法
将少许经增殖的含菌培养物于盛有无菌 水的试管内稀释，在固体培养基表面做规 则的划线，密集的含菌样品经多次划线稀 释，最后得到由单细胞发育成的单菌落。
（一） 采样 为什么选择土壤？
对象：土壤、植物、腐败物品或某些水域
采集的地点：根据微生物的营养要求和代谢 类型来选择。 比如：肉类加工厂附近和饭店排水 沟的污水污泥中，适合蛋白酶和脂肪酶产生 菌的生长。
（二） 富集培养
什么是富集培养？ 富集培养的方法：人为地添加限制因素
（1）控制一定的养分 如碳源、氮源等
③ 菌株生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。
④ 根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌 株、调节突变菌株或野生菌株。
⑤ 选择一些不易被噬菌体感染的菌株。
⑥ 生产菌株要纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产 品质量的稳定性。
菌种是基础，是基石，是发酵可以成功的关键！
三、工业发酵生产菌种的来源
次级用代于谢青产霉物菌虽的然二也种是培从养少基数：几种初级代谢过程中产生的中间体 或代谢产物衍生而来，但它的骨架碳原子的数量和排列上的微小 变R化au，lin如培氧养、基氮：、氯、硫等元素的加入，或在产物氧化水平上的 微葡小萄变糖化5%都、可酒以石导酸致0产.2生7%各、种酒各石样酸的铵次0级.27代%谢、产磷物酸，氢并二且铵每0.种04类% 型、的硫次酸级镁代0.谢02产7%物硫往酸往铵是0一.01群7%化、学硫结酸构锌非0常.0相05似%、的硫不酸同亚成铁分0的.0混05% 合有C葡物1z0萄a。多p糖e例种k5—如，%—，而、D目放硝o前线x酸培已菌纳养知素0基.2的有%：新2、0霉多磷素种酸有等氢4。二种钾，0杆.1菌%肽、、氯多化粘钾菌0.0素5%分、别硫有酸
次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且 代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由 于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物。
不同的微生物可产生不同的次级代谢产物
例 青P养0基产D相灰在.如霉eo5基水黄n同黄Rx×i某素中ca里杨青的青1iul些、培0ll培 酸 霉微i素i-u6n青杆养Mm养，在培生在霉菌则的u时但在养物Cr、肽不锌zt合可R基在iac芽和产a离pa成以上不ue孢柠青子lk在的合培i同n—杆檬霉的含中主成养条—菌酸酸C有培要大时件Dz和等。0养a次量则o下.px黑次5时e级的合培产×k曲级可—代龙成养生1霉代0以D谢胆褐基不-8在谢oM合产醇菌上同x的一产培成物、素培的锌定物养青是甲（养初离的。基霉基6f时级u-子条里氨酸l醌可代v的件培i基。c醇以谢C下养a水但和合产czi可时a杨在d棒成物p）以不e酸C曲灰k；z分合—，霉a黄p别成D但素霉eok合6在。x素—-氨培成含，—
从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优 良菌种
每次生产所选用的菌种经不同的处理方法也会发生 菌种的变异，我们选择那种跟自己期望结果相似的菌种， 使发酵生产和产品质量更优。
第二节 菌种的选育
要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量 等方面符合人们要求的产品，最重要的是要 有优良的菌种。
•如果生产的是微生物直接 合成的产物
5、相关酶的专一性不同
相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢 产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成 的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同 类型的次级代谢产物，
（二）工业发酵常用的微生物及代谢产物
1、细菌及其代谢产物
发酵工业上常用的细菌有醋酸菌、乳酸杆
初级代谢与初级代谢的关系： 1、存在范围及产物类型不同
2另、外对，产催化生次者级自代身谢的产重物合要成性的不酶同往往是一些诱导酶，它们是 3在 物、产积同生累微菌而对诱生数导物生机生长体长末合过期成程或的稳一的定种关生能系长催明期化显里次不，级由代同于谢某产种物中合间成代的谢酶产， 4这、些对酶环通常境因条环件境变条化件的变化敏而感不性能或合遗成传。稳定性上明显不同
（3）添加抑制剂
菌、芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、产氨短杆菌、谷 氨酸棒杆菌、链球菌、假单胞菌和黄单胞菌等。
大肠杆菌菌落
伊红美蓝培养基
2、放线菌及其代谢 产物
发酵工业常用的 放线菌主要是链霉菌 属。
A：诺尔斯氏链霉菌 B：皮疽诺卡氏菌 C：酒红指孢囊菌 D：游动放线菌 E：小单胞菌 F：马杜拉放线菌
放线菌的主要代谢产 物是抗生素、如链霉 素、土霉素、金霉素、 卡那霉素、争光霉素、 春雷霉素和灭瘟素等。
及能量代谢和代谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、 核苷酸、蛋白质等。
2、次级代谢产物
次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的 一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免在代 谢过程中某些代谢产物的积累造成的不利作用， 而产生的一类有利于生存的代谢类型。
次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，如抗 生素、生物碱、色素等。
A：卡特利链霉菌 B：弗氏链霉菌 C：吸水链霉菌金泪亚种 D：卡那霉素链霉菌 E：除虫链霉菌 F：生磺酸链霉菌
3、霉菌及代谢产物
常用的霉菌有曲霉属、青霉属、根霉 属和红曲霉属等。
曲霉
霉菌菌落
青霉
4、酵母菌及代谢产物
发酵工业常用的酵母有啤酒酵母，卡尔斯伯酵母，德 巴利士酵母，汉逊氏酵母，假死酵母和毕赤酵母等。
从自然界分离
一般从自然界分离到的菌种，大多数不能立即适应 实际生产需要，因此我们从自然界分离到的菌种往往要 通过菌种改良——菌种选育，才能得到符合工艺要求的 菌种。
从菌种保藏机构获得
这种菌种离生产工艺要求已基本接近或接近，稍加 选育即获得优良菌种，可节省人力和时间。但不足之处 就是菌种价钱不菲。
稀释分离法
1mL含菌样品于9mL无菌水中做一系列梯度 稀释，分别取后三个梯度倒平板，倾入冷至45℃ 的琼脂培养基，凝固后保温培养，挑选单菌落。
组织分离法
以受病的植株或者组织、器官和某些孢子器 作为材料进行分离的方法就是组织分离法。
比如：如果要分离灵芝，可将野外生长的新 鲜灵芝采回来，取菌盖或菌板组织，经表面消毒 后，以无菌操作切取一小块，放入盛有马铃薯-蔗
糖琼脂培养基的培养皿内，在25℃左右的条件下
培养，当组织周围长出菌丝，立刻将其移植斜面 试管上进行培养和保藏。
三种纯种分离方法的异同：
划线分一均匀，获
得纯种的几率大 组织分离法适合分离高等真菌
具体问题，具体分析！
3、初级代谢与次级代谢的关系：
(1)存在范围及产物类型不同
初级代谢系统、代谢途径和初级代谢产物在各类生物中基本相同。 它是一类普遍存在于各类生物中的一种基本代谢类型。
象病毒这类非细胞生物虽然不具备完整的初级代谢系统，但它们 仍具有部分的初级代谢系统和具有利用宿主代谢系统完成本身的 初级代谢过程的能力。
纯培养时培养条件对筛选结果影响也较大， 主要有如下：
（1）营养成分的控制
微生物的营养成分主要指氮、碳、维生素和无 机盐等。
不同的微生物对这些营养物质的要求是不一样 的。例如，异养型微生物只能利用像葡萄糖、蔗 糖、麦芽糖等现成的有机碳源，自养型微生物则 可以以CO2为碳源。
由于各微生物对营养要求有差异，所以控制分 离培养基中的营养成分对提高分离效果是有好处 的。
工业发酵菌种选育
知识目标
• 了解工业发酵常见微生物及其代谢产物 • 了解各种菌种保藏原理以及主要菌种保藏机构 • 理解次级代谢产物与初级代谢产物的关系 • 理解工业发酵对生产菌种的要求及菌种来源 • 掌握自然选育、诱导育种的操作要点 • 掌握菌种保藏中常用方法的操作要点
能力目标
• 能利用自然选育技术对生产菌种进行纯种分离或复壮 • 能利用诱变育种技术对生产菌种进行紫外线诱变或化学
在发酵工业上，酵母经常为用来进行啤酒，白酒，黄 酒和果汁等各种饮料酒的生产，以及生产乙醇、甘油、有 机酸及麦角固醇的多种产品。
二、工业发酵对生产菌种的一般要求★
① 菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和繁殖，并 且生成所需的代谢产物要高。
② 菌种可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长 和发酵，且所需的酶活性高。
许2多、次对级产代谢生产者物自通身常的对重人类要和性国不民同经济的发展有重大影响。
初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体 以及由它们组成的各种大分子聚合物，蛋白质、核酸、多糖、 脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的 合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导 致机体发生突变或死亡。 次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机体生存所必需的物质 ，即使在次级代谢的某个环节上发生障碍。不会导致机体生长的 停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力。