实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定

蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。

二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。

在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。

在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。

对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。

最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。

根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。

其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。

由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。

离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。

其余反离子则构成扩散层。

滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。

滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。

固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。

ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。

一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。

对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。

蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。

2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。

3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。

二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。

水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。

因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。

蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。

蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。

当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。

盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。

但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。

2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。

若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。

3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。

这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。

4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。

实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定一、目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。

2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。

二、原理蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。

调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。

当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。

在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。

三、试剂和器材1.试剂0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；0.04%溴甲酚绿指示剂；0.02N盐酸；0.1N醋酸溶液；0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；0.02N氢氧化钠溶液2.器材试管及试管架；滴管；吸量管（1、5ml）四、操作方法1.蛋白质的两性反应（1）取1支试管，加0.5%酪蛋白溶液20滴和0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。

观察溶液呈观的颜色，并说明原因。

（2）用细滴管缓慢加入0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。

观察溶液颜色的变化。

（3）继续滴入0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。

（4）再滴入0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。

继续滴入0.02N氢氧化钠溶液，为什么沉淀又会溶液？溶液的颜色如何变化？说明了什么问题？2.酪蛋白等电点的测定（1）取9支粗细相近的干燥试管，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂。

加入每种试剂后应混合均匀。

试管编号9蒸馏水（ml）2.43.2—1.60.8———2.03.03.51.52.753.38————————加1N醋酸溶液入0.1N醋酸溶液—的0.01N醋酸溶液—试酪蛋白醋酸钠剂溶液最终PH沉淀出现情况4.02.01.00.5—————2.51.250.621.01.01.01.01.01.01.01.01.03.53.84.14.44.75.05.35.65.9（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以—，+，++，+++，++++符号表示沉淀的多少。

蛋⽩质的两性电离及等电点
（⼀）两性电离
蛋⽩质既含有能解离成带正电荷的氨基，⼜含有能解离成带负电荷的羧基，可以进⾏两性电离。

蛋⽩质在溶液中的游离状态受溶液pH值的影响，在酸性环境中，蛋⽩质分⼦电离成阳离⼦，在碱性环境中，则电离成阴离⼦，蛋⽩质在某⼀pH值的溶液中所带正、负电荷的量相等时，被称为兼性离⼦（两性离⼦）。

（⼆）等电点（pI）
蛋⽩质以兼性离⼦状态存在时溶液的pH值即为该蛋⽩质的等电点。

⾎浆的pH为7.4.⽽⾎浆中各种蛋⽩质的等电点都⼩于7.4.故在⾎浆中以阴离⼦形式存在。

　考试⼤站整理
（三）电泳
蛋⽩质阴、阳离⼦在电场中分别向正、负电极移动。

这种带电荷的蛋⽩质，在电场中向电性相反的电极移动的现象称为蛋⽩质电泳。

电泳的速度与带电粒⼦电荷多少、分⼦的⼤⼩、形状以及电场强度等多种因素有关，故可⽤电泳法来分离纯化、鉴定和制备蛋⽩质。

蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。

2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。

3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。

当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。

在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。

利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。

本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。

醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。

在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。

当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。

三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。

用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。

2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。

3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。

在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。

接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。

4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。

取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。

5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。

蛋白质的性质实验【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质的方法及其原理。

2. 了解蛋白质的两性解离性质。

初步学会测定蛋白质等电点的方法。

3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。

【实验原理】（一）蛋白质的呈色反应蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。

1. 双缩脲反应『实验原理』：尿素被加热至180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。

双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。

此反应称为双缩脲反应。

所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。

蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。

『实验试剂』：1.蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，通过2-3层纱布滤去不溶物）2. 0.1%的甘氨酸溶液 3. 0.01%精氨酸溶液4. 10%NAOH溶液5. 1%CuSO4溶液6.尿素结晶『实验流程』：双缩脲的制备少许尿素结晶于干燥试管中——（微火加热）尿素融解至硬化——（停止加热）看到有白色气体——（冷却）加10%氢氧化钠溶液约1ml——（震荡）加入1%硫酸铜溶液2滴——（震荡）观察颜色的变化『注意事项』●尿素结晶不要取多，约火柴头大小。

●在操作过程中试管不能冲向他人以防烫伤。

●控制加热时间既不能过长也不能过短。

●加热时火不能过大，防止碳化。

●铜离子不能加多，否则与氢氧化钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰实验结果。

2. 茚三酮反应[实验原理]：蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。

除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。

除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。

该反应灵敏度达1：1500 000（pH5-7）。

现已广泛地用于氨基酸定量测定。

蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。

蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。

蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。

本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。

一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。

这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。

1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。

因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。

2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。

因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。

3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。

此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。

由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。

二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。

测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。

常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。

在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。

可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。

2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。

3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。

蛋白质的两性性质及等电点的测定1 实验目的1.1 了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。

1.2 掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。

2 实验原理蛋白质是两性电解质。

蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。

因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阳离子两性离子阴离子pH < pI pH = pI pH > pI电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。

在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。

3 主要仪器与试剂3.1 器材试管架；试管1.5×15cm（×8）；移液管1mL（×4），2mL（×4），10mL（×2）；胶头滴管（×2）。

3.2 试剂1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875mL，加水至50mL。

0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。

0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。

0.2mol/L NaOH：称取NaOH2.000g，加水至50mL，配成1mol/L NaOH。

然后量取1mol/L NaOH 10mL，加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。

0.2mol/L HCl：吸取37.2%（比重1.19）HCl 4.17mL，加水至50mL，配成1mol/L HCl。

然后吸取1mol/L HCl 10mL，加水至50mL，配成0.2mol/L HCl。

0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29mL 1mol/L NaOH，然后加水至50mL。

实验原理
蛋白质的变性：
在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性。

热变性：由于加热而导致的蛋白质变性。

蛋白质在50℃～60℃以上的溶液中，由于热的作用，多肽链的运动加强，导致次级键的破坏，蛋白质由紧密有序的构象，变成松散无规律的构象。

此时蛋白分子中某些疏水基团外露，失去原有的亲水性，成为溶解度很低的变性蛋白。

凝固：若在等电点情况下加热（或加乙醇），则蛋白质可凝固而沉淀析出；若将蛋白质加热（或加乙醇）后将溶液的pH值调到等电点，变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物析出，称为结絮。

结絮的蛋白质再加热则可凝固。

盐析：溶液的蛋白质胶体分子在高浓度中性盐作用下，蛋白质脱去水化膜并中和所带的电荷，使蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。

特点：沉淀出的蛋白质仍保持其天然蛋白质性质，若降低盐的浓度蛋白质仍可溶解。

实验步骤
蛋白质变性
取一支干净的试管，加0.5%酪蛋白液10滴，再滴加1滴15%三氯醋酸，混匀，观察结果解释其现象。

取一支干净的试管，加0.5%酪蛋白液10滴，再滴加0.01%溴甲酚绿指示剂3滴，混匀。

再逐滴加入0.02M HCl溶液，边滴加边混匀，至有明显大量的沉淀发生时放入沸水中加热2~3min，继续滴加0.02M HCl溶液，观察实验结果，并解释现象。

盐析
1.另取两支干净的试管，0.5%酪蛋白液各10滴，再滴加饱和硫酸铵溶液各20滴，静置3min，观察结果。

然后向其中的一支试管中滴加蒸馏水边滴加边混匀，滴加20滴，观察现象。

两支试管进行对照，解释其现象。

蛋白质的性质实验【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

2. 了解蛋白质的两性解离性质。

初步学会测定蛋白质等电点的方法。

3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。

【实验原理】（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白…【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。

2. 了解蛋白质的两性解离性质。

初步学会测定蛋白质等电点的方法。

3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。

【实验原理】（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。

1. 双缩脲反应尿素被加热至180℃左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。

双缩脲在碱性条件下可与Cu2+结合生成复杂的紫红色化合物。

此反应称为双缩脲反应。

所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。

蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。

2. 茚三酮反应蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。

除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。

除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。

该反应灵敏度达1：1500 000（pH5-7）。

现已广泛地用于氨基酸定量测定。

3. 黄色反应凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。

芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。

苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色反应。

(二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。

调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。

实验二蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的（1）了解蛋白质的两性解离性质。

（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。

二、实验原理蛋白质是两性电解质。

在蛋白质溶液中存在电离平衡。

蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。

不同蛋白质各有其特异的等电点。

在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。

可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。

最常用的方法是测其溶解度最低时的pH值。

本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。

向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。

三、实验材料、器材与试剂1、材料酪蛋白。

2、器材（1）水浴锅；（2）温度计；（3）200mL锥形瓶；（4）100ｍＬ容量瓶；（５）吸管；（６）试管及试管架；（7）乳钵；（8）记号笔。

3、试剂（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL取0.4g酪蛋白，加入少量水在乳钵中仔细研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。

加入10mL1mol/L醋酸钠溶液。

把锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻璃塞，混匀。

（2）1.00mol/L醋酸溶液；（3）0.10mol/L醋酸溶液；（4）0.01mol/L醋酸溶液；（5）0.5%酪蛋白溶液（以0.01mol/L NaOH作溶剂）；（6）0.01%溴甲酚绿指示剂；（7）0.02mol/L氢氧化钠溶液；（8）0.02mol/L盐酸溶液。

四、操作方法1、蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加入0. 5%酪蛋白溶液20滴和0. 01%溴甲酚绿指示剂5~7滴，混匀。