小鼠胰岛素INS酶联免疫分析ELISA

大鼠血清胰岛素水平检测原理胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的多肽激素，对调节血糖水平起着重要的作用。

血清胰岛素水平的检测可以帮助了解机体的胰岛功能，对糖尿病等疾病的诊断和治疗具有重要意义。

本文将介绍大鼠血清胰岛素水平检测的原理。

大鼠血清胰岛素水平的检测主要通过酶联免疫吸附法（ELISA）来进行。

该方法利用特异性抗体与胰岛素分子结合，并通过酶的催化作用使底物发生染色反应，从而定量测定胰岛素的浓度。

具体而言，大鼠血清胰岛素水平检测的步骤如下：1. 样本处理：首先需要收集大鼠的血清样本，可以通过尾静脉抽血或其他适当的方式获取。

为了避免胰岛素的降解，需要迅速离心分离血清，并将样本储存在低温下，避免冻融循环。

2. 抗原包被：将提纯的胰岛素抗原溶液均匀涂覆在微孔板上，使其吸附在孔底。

然后，在孔底加入辅助蛋白，以提高抗原的吸附效率。

3. 样品加入：将预处理好的大鼠血清样本加入到微孔板中，与抗原结合。

一般来说，为了提高灵敏度，需要进行适当的稀释。

4. 洗涤：通过添加洗涤缓冲液，将未结合的物质洗去，以减少非特异性的背景信号。

5. 标记抗体加入：加入与胰岛素结合的酶标记二抗，使其与已结合的胰岛素形成抗原抗体复合物。

6. 洗涤：再次进行洗涤步骤，以去除未结合的酶标记抗体。

7. 底物加入：加入底物溶液，酶标记抗体结合的孔底会发生染色反应。

底物的选择取决于所使用的酶标记系统，一般常用的是TMB （3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物。

8. 反应终止：通过加入停止剂，停止底物的染色反应。

停止剂的选择与底物有关，一般为酸性溶液。

9. 读取测定：使用酶标仪读取吸光度，测定反应产物的光密度。

光密度与胰岛素的浓度成正比。

通过与标准品进行比较，可以计算出样本中胰岛素的浓度。

总结起来，大鼠血清胰岛素水平的检测主要通过酶联免疫吸附法。

该方法利用特异性抗体与胰岛素分子结合，并通过酶的催化作用使底物发生染色反应，从而定量测定胰岛素的浓度。

小鼠胰岛素(Insulin)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清,血浆及相关液体样本中胰岛素(Insulin)含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠胰岛素(Insulin)水平。

用纯化的小鼠胰岛素(Insulin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素(Insulin)，再与HRP标记的胰岛素(Insulin)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的胰岛素(Insulin)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠胰岛素(Insulin)含量。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

小鼠谷胱甘肽S转移酶（GST）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，组织及相关液体样本中谷胱甘肽S转移酶（GST）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠谷胱甘肽S转移酶（GST）水平。

用纯化的谷胱甘肽S转移酶（GST）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入谷胱甘肽S转移酶（GST），再与HRP标记的谷胱甘肽S转移酶（GST）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽S转移酶（GST）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠谷胱甘肽S转移酶（GST）浓度。

试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：450pg/ml ×1瓶×1瓶2-8℃保存标准品稀释液×1瓶×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

酶联免疫测定（ELISA）标准化的一般原则对酶联免疫测定标准化的目的就是通过这种标准化以改善实验室测定的准确度，从而提高不同的实验室间结果的可比性。

进行标准化的先决条件是，标准品和检测物应该是相同的，否则标准化就无从谈起。

这在目前的许多临床免疫测定项目中标准品往往没有达到这一要求。

涉及到免疫测定标准化的组织有世界卫生组织(WHO)生物学标准化专家委员会(ECBS)，其负责建立生物物质的国际标准及参比材料。

WHO通过国家生物学标准和质控物研究所(NIBSC)提供大多数多肽激素和一些肿瘤标志物的国际标准品。

一些区域和地区性组织也制备标准品，如美国的疾病控制中心(CDC)、美国病理学家协会(CAP)的国家委员会。

国家卫生研究所(NIH)提供尤其是用于研究目的的多肽激素标准品。

IFCC也已组织制备了一种脂蛋白和血清蛋白的标准品，可通过CAP得到。

国际癌发生生物学和医学学会已启动一个肿瘤标志物的决定计划。

在国内中国药品生物制品检定所提供一些多肽激素、肿瘤标志物等标准品。

卫生部临床检验中心则为全国各级医院血站实验室提供室内质控物。

尽管仅仅使用标准品并不能保证免疫测定结果的可比性，但标准品对保证免疫测定的重要性是不言而喻的。

目前在世界上有各种不同的科学协会如IFCC及国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)以及美国和加拿大临床化学协会(AACC和CSCC)等正致力于免疫测定的标准化工作，这些组织也制备一些标准品。

在美国，免疫测定必须有食品和药物管理局(FDA)的批准。

在德国的监督机构是医学实验室标准化和文件化研究所(INSTAND)。

在国内免疫诊断试剂的审批由国家药品监督管理局(SDA)负责。

卫生部临床检验中心也正在着手临床免疫检验标准化方面的工作。

第一代生物学标准品是在70多年前由Henry Dale制备的用于胰岛素(insulin)测定的标准品，该标准品被WHO的前身即国家卫生组织联合会(League Of National Health Organization)所采用。

ELISA测定错误结果的原因分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。

Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。

ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。

ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。

血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种：1．内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。

常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。

（1）类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。

RayBio® Mouse Insulin ELISA KitCatalog #: ELM-InsulinUser ManualLast revised June 14, 2021Caution:Extraordinarily useful information enclosedISO 13485 Certified3607 Parkway Lane, Suite 100Norcross, GA 30092 Tel: 1-888-494-8555 (Toll Free) or 770-729-2992, Fax:770-206-2393Web: , Email: *******************RayBiotech, Inc.________________________________________RayBio® Mouse Insulin ELISA Kit ProtocolTable of ContentsSection Page # I.Introduction3II.Storage4III.Reagents4IV.Additional Materials Required4V.Reagent Preparation5VI.Assay Procedure6VII.Assay Procedure Summary7VIII.Calculation of ResultsA. Typical DataB. SensitivityC. Spiking & RecoveryD. LinearityE. Reproducibility 8 8 8 9 9 10IX.Specificity10X.Troubleshooting Guide11Please read the entire manual carefully before starting your experimentI. INTRODUCTIONThe RayBio® Mouse Insulin ELISA kit is an in vitro enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative measurement of Mouse Insulin in serum, plasma (Collect plasma using EDTA and Citrate as an anticoagulant. Heparin is not recommended as anticoagulants for use in this assay) and cell culture supernatants. This assay employs an antibody specific for Insulin coated on a 96-well plate. Standards and samples are pipetted into the wells and Insulin present in a sample is bound to the wells by the immobilized antibody. The wells are washed and biotinylated anti-Mouse Insulin antibody is added. After washing away unbound biotinylated antibody, HRP-conjugated streptavidin is pipetted to the wells. The wells are again washed, a TMB substrate solution is added to the wells and color develops in proportion to the amount of Insulin bound. The Stop Solution changes the color from blue to yellow, and the intensity of the color is measured at 450 nm.Need your results faster? Try RayBiotech's SpeedE LISA platform for quantitative detection in just three hours.https:///speedelisa-kits/Short on sample, or need higher sensitivity? Check out the IQELISA™ Immuno-PCR platform. https:///immuno-pcr/II. STORAGEThe entire kit may be stored at -20°C for up to 1 year from the date of shipment. Avoid repeated freeze-thaw cycles. The kit may be stored at 4°C for up to 6 months. For extended storage, it is recommended to store at -80°C. For prepared reagent storage, see table below. III. REAGENTSIV. ADDITIONAL MATERIALS REQUIRED1.Microplate reader capable of measuring absorbance at 450 nm.2.Precision pipettes to deliver 2 µl to 1 ml volumes.3.Adjustable 1-25 ml pipettes for reagent preparation.4.100 ml and 1 liter graduated cylinders.5.Absorbent paper.6.Distilled or deionized water.7.Log-log graph paper or computer and software for ELISA data analysis.8.Tubes to prepare standard or sample dilutions.V. REAGENT PREPARATION1.Bring all reagents and samples to room temperature (18 - 25ºC) before use.2.Assay Diluent B (Item E) should be diluted 5-fold with deionized or distilled water before use.3.Sample dilution: Assay Diluent C (Item L) should be used for dilution of serum, plasma, and cell culture supernatant samples. The suggested dilution for normal serum/plasma is 2 fold. Collect plasma using EDTA and/or Citrate as anticoagulants. Heparin is not recommended as an anticoagulant for use in this assay. Note: Levels of Insulin may vary between different samples. Optimal dilution factors for each sample must be determined by the investigator.4.Preparation of standard: Briefly spin a vial of Item C. Add 400 µl Assay Diluent C (Item L) into Item C vial to prepare a 1,400 µIU/ml standard solution. Dissolve the powder thoroughly by a gentle mix. Add 180 µl Insulin standard (1,400 µIU/ml) from the vial of Item C, into a tube with 450 µl Assay Diluent C to prepare a 400 µIU/ml standard solution. Pipette 250µl Assay Diluent C into each tube. Use the 400 µIU/ml standard solution to produce a dilution series (shown below). Mix each tube thoroughly before the next transfer. Assay Diluent C serves as the zero standard (0 µIU/ml).180 µl250 µl 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl250 µlStd1Std2Std3Std4Std5Std6Std7Zero Standard Diluent volume Item C + 400 µl450 µl250 µl250 µl250 µl250 µl250 µl250 µl250 µlConc.1,400 µIU/ml 400 µIU/ml 200 µIU/ml 100 µIU/ml 50 µIU/ml 25 µIU/ml 12.5 µIU/ml 6.25 µIU/ml0 µIU/ml5.If the Wash Concentrate (20X) (Item B) contains visible crystals, warm to roomtemperature and mix gently until dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or distilled water to yield 400 ml of 1X Wash Buffer.6.Briefly spin the Detection Antibody vial (Item F) before use. Add 100 µl of 1X AssayDiluent B (Item E) into the vial to prepare a detection antibody concentrate. Pipette up and down to mix gently (the concentrate can be stored at 4ºC for 5 days). The detection antibody concentrate should be diluted 80-fold with 1X Assay Diluent B (Item E) andused in step 5 of Part VI Assay Procedure.7.Briefly spin the HRP-Streptavidin concentrate vial (Item G) and pipette up and down tomix gently before use, as precipitates may form during storage. HRP-Streptavidinconcentrate should be diluted 400-fold with 1X Assay Diluent B (Item E).For example: Briefly spin the vial (Item G) and pipette up and down to mix gently. Add30 µl of HRP-Streptavidin concentrate into a tube with 12 ml 1X Assay Diluent B toprepare a 400-fold diluted HRP-Streptavidin solution (don't store the diluted solution for next day use). Mix well.VI. ASSAY PROCEDURE1.Bring all reagents and samples to room temperature (18 - 25ºC) before use. It isrecommended that all standards and samples be run at least in duplicate.bel removable 8-well strips as appropriate for your experiment.3.Add 100 µl of each standard (see Reagent Preparation step 3) and sample intoappropriate wells. Cover wells and incubate for 2.5 hours at room temperature withgentle shaking.4.Discard the solution and wash 4 times with 1X Wash Solution. Wash by filling each wellwith Wash Buffer (300 µl) using a multi-channel Pipette or autowasher. Completeremoval of liquid at each step is essential to good performance. After the last wash,remove any remaining Wash Buffer by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.5.Add 100 µl of 1X prepared biotinylated antibody (Reagent Preparation step 6) to eachwell. Incubate for 1 hour at room temperature with gentle shaking.6.Discard the solution. Repeat the wash as in step 4.7.Add 100 µl of prepared Streptavidin solution (see Reagent Preparation step 7) to eachwell. Incubate for 45 minutes at room temperature with gentle shaking.8.Discard the solution. Repeat the wash as in step 4.9.Add 100 µl of TMB One-Step Substrate Reagent (Item H) to each well. Incubate for 30minutes at room temperature in the dark with gentle shaking.10.Add 50 µl of Stop Solution (Item I) to each well. Read at 450 nm immediately.VII. ASSAY PROCEDURE SUMMARY1.Prepare all reagents, samples and standards as instructed.2.Add 100 µl standard or sample to each well. Incubate 2.5 hours at room temperature.3.Add 100 µl prepared biotin antibody to each well. Incubate 1 hour at room temperature.4.Add 100 µl prepared Streptavidin solution. Incubate 45 minutes at room temperature.5.Add 100 µl TMB One-Step Substrate Reagent to each well. Incubate 30 minutes atroom temperature.6.Add 50 µl Stop Solution to each well. Read at 450 nm immediately.VIII. CALCULATION OF RESULTSCalculate the mean absorbance for each set of duplicate standards, controls and samples, and subtract the average zero standard optical density. Plot the standard curve on log-log graph paper or using Sigma plot software, with standard concentration on the x-axis and absorbance on the y-axis. Draw the best-fit straight line through the standard points.A. TYPICAL DATAThese standard curves are for demonstration only. A standard curve must be run with each assay.B. SENSITIVITYThe minimum detectable dose of Mouse Insulin was determined to be 5 µIU/ml.Minimum detectable dose is defined as the analyte concentration resulting in an absorbance that is 2 standard deviations higher than that of the blank (diluent buffer).C. SPIKING & RECOVERYRecovery was determined by spiking various levels of Mouse Insulin into the sample types listed below. Mean recoveries are as follows:D. LINEARITYE. REPRODUCIBILITYIntra-Assay CV%: <10%Inter-Assay CV%: <12%IX. SPECIFICITYThis ELISA antibody pair detects mouse, human, rat, porcine and bovine Insulin.X. TROUBLESHOOTING GUIDEProblem Cause SolutionPoor standard curve Inaccurate pipettingImproper standarddilutionCheck pipettesBriefly centrifuge Item C and dissolvethe powder thoroughly by gently mixingLow signal Improper preparation ofstandard and/orbiotinylated antibodyToo brief incubationtimesInadequate reagentvolumes or improperdilutionBriefly spin down vials before opening.Dissolve the powder thoroughly.Ensure sufficient incubation time. Assayprocedure step 3 may be doneovernight at 4°C with gentle shaking(note: may increase overall signalsincluding background).Check pipettes and ensure correctpreparationLarge CV Inaccurate pipettingAir bubbles in wellsCheck pipettesRemove bubbles in wellsHigh background Plate is insufficientlywashedContaminated washbufferReview the manual for proper wash. Ifusing a plate washer, ensure that allports are unobstructed.Make fresh wash bufferLow sensitivity Improper storage of theELISA kitStop solutionStore your standard at <-70ºC afterreconstitution, others at 4ºC. Keepsubstrate solution protected from light.Add stop solution to each well beforereading plateRayBio® ELISA KitsOver 4,000 ELISA kits available, visit /ELISA-Kits for details.This product is for research use only.©2020 RayBiotech, Inc。

仅供科研使用，不得用于临床检验。

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）说明书黄石市艾恩斯生物科技有限公司【产品名称】通用名称：小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）英文名称：Mouse Insulin-like growth factor binding protein 2（IGFBP2 ）ELISA KIT【包装规格】48人份/盒，96人份/盒【预期用途】仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）的浓度。

【检验原理】本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。

在预包被抗小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。

加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）的浓度正相关。

拟合校准品曲线，可以计算出样本中小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2 ）的浓度。

【主要组成成分】主要成分校准品检测范围：125-8000pg/ml。

校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材1、酶标仪2、精密移液器及一次性吸头3、蒸馏水4、洗瓶或者自动洗板机5、37℃水浴锅或恒温箱6、500ml量筒7、无粉一次性乳胶手套【储存条件及有效期】1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。

曲古抑菌素A促进小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞李佳萦;冯烈【摘要】AIM:To investigate whether trichostatin A ( TSA) , a new revulsant ,can induce mouse mesenchy-mal stem cells to differentiate into insulin-secreting cells and to explore the appropriate concentration of TSA .METHODS:The mesenchymal stem cell line from C57BL/6 mice was cultured in vitro and divided into 5 groups before treated with dif-ferent concentrations of TSA , ( group A:DMSO;group B~E:treated with 25 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L and 200 nmol/L of TSA, respectively).After exposed to different cultured media for 10 d during the 2 stages, the cells were detec-ted by the following methods:the insulin-secreting cells in each group were identified by dithizone staining and the results were calculated with immunohistochemical half quantitative analysis .The insulin secreted by insulin-secreting cells in each group was identified by immunofluorescence , and the mean fluorescence intensity of insulin was compared .The content of insulin in each group was quantified byELISA .The appropriate concentration of TSA was determined according to the above results .RESULTS:TSA treatment for 10 d promoted the mouse bone marrow mesenchymal stem cells to differenti-ate into insulin-secreting cells which produced insulin .The immunohistochemistry and immunofluorescence imaging analysis of insulin-secreting cells showed that the insulin staining positive area , positive ratio , total density ofinsulin expression and mean fluorescence intensity of insulin in group B were significantly higher than those in the other TSA -treatedgroups .When the concentrations of TSA gradually increased , the contentof insulin reduced accordingly .The content of insulin in group B was significantly higher than that in the other TSA-treatedgroups .CONCLUSION:TSA treatment for 10 d promotes bone marrow mesenchymal stem cells from C57BL/6 mice to differentiate into insulin-secreting cells and the appropriate concen-tration of TSA is 25 nmol/L.%目的：观察曲古抑菌素A（ TSA）诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的适宜浓度。

小鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒本试剂盒仅供科研使用。

用于体外定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的胰岛素浓度。

使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有疑问请与上海巧伊生物科技有限公司联系，我们将提供力所能及的帮助。

如您有其它需求，请登录上海巧伊生物科技有限公司网站或致电本公司。

胰岛素简介：胰岛素是糖代谢中最主要的激素之一。

胰腺的ß细胞岛细胞产生胰岛素前体蛋白，前体蛋白被加工成C肽和胰岛素。

它们以等摩尔浓度进入血循环中。

成熟的胰岛素由A、B两条链组成。

这两条链是通过两个二硫键桥接形成有功能的胰岛素分子。

血浆葡萄糖浓度的变化是胰岛素产生并分泌的最主要刺激因素，产生的胰岛素具有一些代谢调节作用。

其最主要的作用是，将外周血中糖转运到肝脏中贮存起来。

一些诸如肝糖生成障碍或在促进血糖升高的激素诸如胰高血糖素、肾上腺素、生长激素和皮质醇等作用下促进肝糖分解都可拮抗胰岛素的作用。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中胰岛素的浓度。

胰岛素捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的胰岛素会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

当加入与HRP耦连的抗胰岛素抗体后，抗小鼠胰岛素抗体与胰岛素接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

最后加入显色剂，若样本中存在胰岛素将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。

通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，胰岛素浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中胰岛素浓度。

小鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:组分 规格（96T/48T）小鼠胰岛素预包被板 12条/6条标准品稀释液 10ml/5ml小鼠胰岛素标准品 2支/1支(冻干)小鼠胰岛素抗体HRP结合物 10ml/5ml浓缩洗涤液 20× 30ml/15mlTMB底物 10ml/5ml终止液 5ml/3ml封板胶纸 3/2张说明书 1份标本收集:1.标本的收集请按下列流程进行操作；A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，D.标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

人胰岛素原（PI）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中胰岛素原（PI）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中PI水平。

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入PI抗原、生物素化的抗人PI抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的PI呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200pmol/l，做系列倍比稀释后，分别稀释200pmol/l，100pmol/l，50 pmol/l，25pmol/l，12.5pmol/l，6.25pmol/l，3.12pmol/l，样品稀释液直接作为标准浓度0pmol/l，临用前15分钟内配制。

如配制100pmol/l标准品：取0.5ml200pmol/l的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf 管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3.样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。

稀释方法同检测溶液A。

小鼠cgrp elisa说明书
小鼠CGRP ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测小鼠体
内CGRP（钙调素基因相关肽）水平的实验方法。

CGRP是一种神经肽，对于神经传导、炎症反应和血管舒张等生理过程起着重要作用。

ELISA是一种常用的实验技术，用于定量检测样本中特定蛋白质的
浓度。

该实验通常包括以下步骤：
1. 样本处理，收集小鼠血清或其他组织样本，并进行适当的处理，如离心，以获取清晰的样本液。

2. 样本预处理，将样本加入预先包被有CGRP抗体的微孔板中，使得CGRP能够与抗体结合。

3. 洗涤，洗涤去除未结合的物质。

4. 加入检测试剂，加入与CGRP结合的检测抗体，形成夹心式
结构。

5. 再次洗涤，洗涤去除未结合的检测抗体。

6. 底物反应，加入底物，使得酶与底物发生反应产生可测的信号。

7. 停止反应，加入停止液终止底物反应。

8. 测定光密度，通过光密度测定仪测定反应产生的颜色变化，从而确定CGRP浓度。

通过对比样本的光密度与标准曲线，可以计算出样本中CGRP的浓度。

这种实验方法可以帮助科研人员了解小鼠体内CGRP水平的变化，从而研究其在疾病发生和发展中的作用，以及评估药物对CGRP 水平的影响等。

需要注意的是，操作ELISA实验时需要严格按照说明书提供的步骤和条件进行，以确保实验结果的准确性和可重复性。

同时，实验中应注意生物安全和实验室规范，保护实验人员的安全。

小鼠胰岛素(Insulin)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清,血浆及相关液体样本中胰岛素(Insulin)含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠胰岛素(Insulin)水平。

用纯化的小鼠胰岛素(Insulin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素(Insulin)，再与HRP标记的胰岛素(Insulin)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的胰岛素(Insulin)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠胰岛素(Insulin)含量。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

㊃基础研究㊃基金项目:中医药防治糖尿病国际联合研究中心(2015B01022)作者单位:100078　北京中医药大学东方医院内分泌科[陈源(硕士研究生)];北京中医药大学教育部中医养生学重点实验室(吴悠㊁吴丽丽㊁刘铜华),科技处(秦灵灵)作者简介:陈源(1999-),2021级在读硕士研究生㊂研究方向:中医药防治内分泌代谢性疾病的临床与实验研究㊂E⁃mail:1095501378@通信作者:刘铜华(1963-),博士,教授,博士生导师㊂研究方向:中医药防治内分泌代谢性疾病的临床与实验研究㊂E⁃mail:thliu@滋肾丸对KKay 小鼠肝脏胰岛素抵抗以及PI3K⁃Akt⁃FOXO1通路的影响陈源　吴悠　吴丽丽　秦灵灵　刘铜华【摘要】　目的　探究不同剂量滋肾丸水提物对于糖尿病小鼠降糖效果及该药对肝脏胰岛素抵抗的作用机制㊂方法　21只KKay 小鼠随机分为模型组㊁滋肾丸高剂量组和滋肾丸低剂量组,每组7只;7只C57BL /6J 小鼠作为正常组㊂连续灌胃给药6周,滋肾丸高剂量组予2.8g /(kg㊃d),滋肾丸低剂量组予1.4g /(kg㊃d),模型组㊁正常组予等体积蒸馏水㊂观察每周空腹血糖(fasting bloodglucose,FBG),最后一周进行口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT),酶联免疫吸附法(enzyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组小鼠血清中的空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment⁃insulin resistance,HOMA⁃IR),qPCR 法检测胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)㊁磷脂酰肌醇3⁃激酶(phosphoinositide 3⁃kinase,PI3K)㊁蛋白激酶B(protein kinase B,PKB /Akt)㊁叉头框蛋白1(forkhead box O1,FOXO1)㊁磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)㊁葡萄糖⁃6⁃磷酸酶(glucose⁃6⁃phosphatase,G6pase)㊁葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表达水平;苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin staining,HE)染色和糖原过碘酸雪夫染色(periodic Acid⁃Schiff staining,PAS)观察肝脏病理情况和糖原分布㊂结果　与模型组相比,滋肾丸高剂量组和滋肾丸低剂量组小鼠FBG㊁HOMA⁃IR㊁OGTT 曲线下面积明显下降,肝脏形态学改变部分减少,脂滴减少,糖原分布增加,FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase 基因表达均明显下降,滋肾丸高剂量组GCK 基因表达水平显著上升,差异有统计学意义㊂结论　滋肾丸对于KKay 小鼠降糖效果显著,能明显改善肝脏胰岛素抵抗,其机制可能是降低FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase 的转录水平,提高GCK 的转录水平,从而抑制糖异生,促进糖原合成有关㊂【关键词】　滋肾丸;　小鼠;　肝胰岛素抵抗;　磷脂酰肌醇3⁃激酶通路;　糖代谢【中图分类号】　R285.5　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2024.03.001Effects of Zishen pill on hepatic insulin resistance and PI3K⁃AKT⁃FOXO1pathway in KKay mice CHEN Yuan ,WU You ,WU Lili ,QIN Lingling ,LIU TonghuaDongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100078,China Corresponding author :LIU Tonghua ,E⁃mail :thliu@【Abstract 】　Objective To evaluate the hypoglycemic effect of the traditional Chinese medicinedecoction Zishen pill on diabetic mice and the mechanism of the drug on hepatic insulin resistance.Methods 21KKay mice were randomly divided into Zishen pill high⁃dosage group and Zishen pill low⁃dosage group,a model group,and 7C57mice as the normal group.After continuous administration for 6weeks,the fasting blood glucose was observed weekly,and the oral glucose tolerance test (OGTT)was performed in the last week of treatment.The enzyme⁃linked immunosorbent assay (ELISA)was used todetect the fasting insulin(FINS)in the serum of the mice in each group and homeostasis model assessment⁃insulin resistance(HOMA⁃IR)was calculated.RT⁃qPCR was applied to detect the mRNA expression of insulin receptor substrate(IRS),phosphoinositide3⁃kinase(PI3K),protein kinase B (PKB/AKT),forkhead box O1(FOXO1),phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK),glucose⁃6⁃phosphatase(G6pase),glucokinase(GCK).Hematoxylin⁃eosin staining(HE)and periodic acid Schiff staining(PAS)were used to observe the liver morphology and glycogen distribution.Results　Compared with the C group,the FBG,HOMA⁃IR,and area under curve(AUC)of OGTT in groups H and L decreased significantly,the changes in liver morphology of C group was partially diminished in Zishen pill treated groups,with fewer lipid droplets and more glycogen distribution.The gene expression of FOXO1, PEPCK,and G6pase decreased significantly,and the expression of GCK gene in group H increased significantly.Conclusion　The Zishen pill has obvious hypoglycemic effect on KKay mice,and can significantly improve hepatic insulin resistance.The mechanism may be due to its effect of reducing the transcription of FOXO1,PEPCK,G6pase and increase the transcription of GCK,thereby inhibiting gluco⁃neogenesis and promoting glycogen synthesis.【Key words】　Zishen pill;　mouse;　hepatic insulin resistance;　PI3K pathway;　glucose me⁃tabolism 糖尿病是一类以高血糖和糖脂代谢障碍为特征的代谢性疾病,中医认为其核心病机为 阴虚燥热”[1⁃2]㊂滋肾丸是一首中医经典名方,方中只有知母㊁黄柏㊁肉桂三味药,常用于淋证㊁癃闭等肾系疾病㊂方中知母㊁黄柏滋阴清热,肉桂反佐,基本符合糖尿病病机㊂前期动物实验已经证实滋肾丸具有一定的降糖效果,如郭晓媛[3]用滋肾丸醇提取物对db/db小鼠干预四周后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平开始下降,并能减轻糖尿病肾病肾小管早期肾损害,改善肾功能㊂Tang 等[4]将db/db小鼠分成滋肾丸三个剂量组,发现其显著降低小鼠血糖及糖化血红蛋白水平,并改善其糖耐量,其降糖效果可与罗格列酮不相上下㊂实验室前期研究发现滋肾丸可通过增加Occludin 和ZO⁃1蛋白在肠道中的表达来增强肠道屏障功能和降低全身炎症,改善骨骼肌形态,调节骨骼肌胰岛素信号通路[5]㊂肝脏也是胰岛素的重要靶器官之一,本研究将基于肝脏胰岛素通路,进一步验证其在自发性糖尿病动物模型KKay小鼠中的降糖作用,以及探讨其改善肝脏胰岛素抵抗的机制㊂1　材料与方法1.1　实验动物KKay小鼠21只,5周龄;C57BL/6J小鼠7只,5周龄,由北京华阜康生物科学有限公司提供,饲养于北京中医药大学SPF级动物房,室温(25±2)℃,相对湿度(50±5)%,昼夜循环12小时/12小时人工光照条件下,自由饮水,正常维持饲料喂养㊂普通饲料为小鼠全价营养颗粒饲料,KKay小鼠专用高脂饲料由北京华阜康生物科学公司提供(货号:1042)㊂1.2　伦理审查本研究的动物实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准(伦理号:BUCM⁃4⁃2019031003⁃1089)㊂1.3　实验药物知母㊁黄柏㊁肉桂中药饮片购买于北京同仁堂制药公司㊂滋肾丸水提物提取:将中药饮片知母300g㊁黄柏300g㊁肉桂45g混合,浸泡在10倍药重的蒸馏水中1小时,煮沸45分钟后收集药液㊂再次加入相同体积的水煮沸45分钟,将两次的煎剂一起放入旋转蒸发仪中浓缩至645mL,得到1g/mL浸膏㊂将浓缩的浸膏分装收集在50mL的EP管中并保存在-20℃冰箱中,每次灌胃前纯水稀释㊂1.4　实验仪器与试剂便携式血糖仪(GLUCOCARD01-min plus,日本爱科来医疗科技有限公司,型号:GT⁃1970);酶联免疫检测仪(美国,Promega,型号:E9032);凝胶成像系统(美国,Bio⁃RAD公司,型号: ChemiDocTMXRS);研磨仪(上海净信科技有限公司,型号:JXFSTPRP⁃24);实时荧光定量PCR仪(美国,Thermo Fisher Scientific,型号:7500);台式高速冷冻离心机(美国Sigma Aldrich公司,型号:3K15);紫外分光光度计(瑞士梅特勒⁃托利多国际有限公司,型号:UV5Nano)㊂RNA Easy Fast Tissue/cell Kit(北京天根生化科技有限公司,货号:DP451);HiScript®III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司,货号:R323);GO Taq®RT⁃Qpcr System(美国Promega生物技术有限公司,货号: A6001);小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(美国ALPCO Diagnostics,货号:80⁃INSMSU⁃E01)㊂1.5　造模㊁分组与给药在适应性喂养3周后,所有小鼠禁食不禁水12小时,尾尖采血法测量FBG㊂据FBG及体重结果按随机区组设计将KKay小鼠分为3组:滋肾丸高剂量组㊁滋肾丸低剂量组㊁模型组;C57BL/6J小鼠为正常组㊂滋肾丸高剂量组根据人剂量10g黄柏㊁10g 知母㊁1.5g肉桂,换算小鼠生药给药量2.8g/kg㊂小鼠每天同一时间段灌胃给药一次,滋肾丸高剂量组予2.8g/kg,滋肾丸低剂量组予1.4g/kg,模型组及正常组予等体积蒸馏水,连续给药6周㊂1.6　标本采集第6周末次给药后,禁食不禁水12小时,摘取眼球取血,置于离心管中,不抗凝,室温下静置30分钟后在4℃,3000r/min条件下离心15分钟,吸取上清液于-20℃保存;取出肝脏,将组织的一小部分固定在多聚甲醛溶液中用于形态学观察,其余部分收集在管中并立即用液氮冷冻㊂1.7　指标检测1.7.1　FBG测定　每周固定时间,将小鼠禁食不禁水12小时,取尾尖血,用葡萄糖氧化酶法测定FBG,采用配套血糖仪及试纸㊂1.7.2　口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)　第6周末次给药后,禁食不禁水12小时,测小鼠FBG作为0分钟血糖,按2g/kg给小鼠灌胃葡萄糖溶液进行OGTT试验,测定30分钟㊁60分钟㊁120分钟血糖,计算曲线下面积(area under curve,AUC)㊂AUC=0.5×(Bg0min+Bg30min)/2+0.5×(Bg30min+Bg60min)/2+1×(Bg60min+Bg120min)/2其中Bg0min为0分钟血糖,以此类推㊂1.7.3　酶联免疫吸附法测定胰岛素水平　将吸取的血清冷冻保存后检测空腹血清胰岛素(fasting insulin,FINS)水平,并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment⁃insulin resistance, HOMA⁃IR)㊂HOMA⁃IR=FBG㊃FINS/22.51.7.4　肝脏组织染色　新鲜肝脏组织经4%多聚甲醛固定24小时后,石蜡包埋,3~5μm切片,根据苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin staining,HE)染色试剂盒及糖原过碘酸雪夫染色(periodic Acid⁃Schiff staining,PAS)试剂盒使用说明书步骤进行,常规光学显微镜高倍镜镜检,观察肝脏组织形态及糖原分布情况,拍照保存图片㊂1.7.5　qRT⁃PCR法测定相关基因表达水平　将肝脏组织从-80℃冰箱取出,试剂盒提取总RNA,按照PCR操作要求及Promega试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA并扩增,反应条件:50℃2分钟,95℃10分钟,(95℃15秒,60℃1分钟,40循环),95℃15秒,60℃1分钟,95℃30秒,60℃15秒㊂以模型组的基因表达为对照,采用2-△△Ct法计算得到各个样本之间相对的基因表达水平㊂检测基因为胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)㊁磷脂酰肌醇3⁃激酶(phosphoinositide3⁃kinase,PI3K)㊁蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)㊁叉头框蛋白1 (forkhead box O1,FOXO1)㊁磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)㊁葡萄糖⁃6⁃磷酸酶(glucose⁃6⁃phosphatase,G6pase)㊁葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表达水平㊂所测基因引物序列如表1所示㊂1.8　统计学方法实验所得数据均为计量资料,采用SPSS25.0统计软件对数据进行分析,用均数±标准差(x±s)表示㊂空腹血糖㊁糖耐量㊁胰岛素水平及胰岛素抵抗指数指标取每组6只小鼠㊂基因表达量取每组3只小鼠㊂小鼠第2周空腹血糖及OGTT试验中30分钟血糖不满足正态分布,采用非参数检验(Kruskal wallis)分析㊂其他数据采用单因素方差分析,其中小鼠肝组织FOXO1基因表达量及第3㊁4㊁5㊁6周空腹血糖满足正态分布不满足方差齐,组间比较采取Dunnett’st检验;其他数据均符合正态分布及方差齐,组间比较采取LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义㊂2　结果2.1　滋肾丸对KKay小鼠空腹血糖的影响与正常组相比,模型组小鼠的血糖显著升高(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸低剂量组小鼠在第3㊁5㊁6周血糖显著降低(P<0.05),从第1周开始至用药结束,滋肾丸高剂量组小鼠空腹血糖显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),且下降幅度比滋肾丸低剂量组大㊂见表2㊂2.2　滋肾丸对KKay小鼠糖耐量的影响与正常组相比,模型组小鼠的0分钟㊁30分钟㊁60分钟㊁120分钟血糖及AUC均显著升高(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸高㊁低剂量组0分钟㊁30分钟㊁60分钟㊁120分钟血糖及AUC均显著下降(P<0.05)㊂见表3㊂2.3　滋肾丸对KKay小鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响与正常组相比,模型组FINS水平显著降低(P<0.05),提示早期胰岛调节功能受损;与模型组相比,高㊁低剂量滋肾丸均显著提升FINS水平(P<0.05),考虑滋肾丸可以改善早期胰岛功能㊂与正常组相比,模型组HOMA⁃IR显著升高(P<0.05),提示胰岛素抵抗㊂与模型组相比,高㊁低剂量滋肾丸均显著降低HOMA⁃IR水平(P<0.05),提示滋肾丸可以改善胰岛素抵抗㊂见表4㊂2.4　肝脏组织病理学观察2.4.1　HE染色　光镜下观察小鼠肝脏细胞HE染色情况㊂正常组肝组织肝小叶结构清晰,肝索排列规则整齐,以中央静脉为中心呈放射状分布,未见脂质沉积;模型组肝脏形态紊乱,肝小叶肝索结构消失,肝细胞肿大变性,存在大量脂肪空泡及脂质沉积㊂与模型组相比,滋肾丸高㊁低剂量组肝小叶结构较为清晰完整,肝索排列较正常,肝窦排列较为规则,中央静脉结构较完整,空泡样改变明显减少㊂见图1㊂表1　qRT⁃PCR引物序列基因名称上游引物序列(3’-5’)下游引物序列(3’-5’) GAPDH AAGATGGTGAAGGTCGGTGT GCTTCCCATTCTCAGCCTTGIRS⁃1AGCCAGTCTTCATCCAGTTGC AGATCTCCGAGTCAGTCCCACPI3K⁃ca ATTTGGCTATAAGCGGGAAC TTGCTAGGTAAGCCTTGTAACACAkt2CACCCTTCAAACCTCAGGTCAC GTCCAGGCTGTCATATCGGTC FOXO1CCTAATTCGGTCATGCCAGCGTA CCGTTGACCGAAGCCGTTTGCK CTTATGGCTGCTACTTCGTTC CTTCTAGTGCAGCAAAAGCG PEPCK CCTCAGCTGCATAACGGTCT CTGAGCATTGCCTTCCACGAACG6pase ACCTCGTCTTCAAGTGGAT GACTTCCTGGTCCGGTCTC表2　滋肾丸对KKay小鼠空腹血糖的影响(x±s,mmol/L)组别鼠只第0周第1周第2周第3周第4周第5周第6周正常组6 4.50±0.76 3.80±0.10 3.40±0.51 3.75±0.36 3.80±0.45 3.30±0.47 3.30±0.37模型组69.10±2.74a 6.90±2.12a8.70±1.74a11.73±2.34a9.80±2.37a10.70±3.62a9.60±1.14a 滋肾丸低剂量组69.00±1.87a 6.10±0.88a7.50±1.93a8.92±1.84ab8.10±3.10a 6.80±2.21ab 6.80±1.01ab 滋肾丸高剂量组68.90±0.97a 5.20±1.04b 5.90±1.47b 6.97±1.96ab 5.20±1.41b 5.70±1.85b 6.40±2.03ab 注:与正常组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂表3　滋肾丸对KKay小鼠糖耐量的影响(x±s)组别鼠只0分钟(mmol/L)30分钟(mmol/L)60分钟(mmol/L)120分钟(mmol/L)AUC 正常组6 3.35±0.4112.35±1.487.00±0.40 4.38±0.6714.16±0.79模型组610.80±3.23a32.53±1.21a29.65±1.32a21.85±3.61a51.73±3.57a 滋肾丸低剂量组6 6.20±0.95ab23.33±1.74b17.95±1.26ab9.03±1.93ab32.75±4.04ab 滋肾丸高剂量组6 5.47±1.08b23.19±3.65b16.53±5.81ab9.08±3.83ab31.40±9.70ab 注:与正常组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.05㊂表4　滋肾丸对KKay 小鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响(x ±s )组别鼠只FINS(ng /mL)胰岛素抵抗指数正常组623.86±1.090.70±0.11模型组620.65±1.94a 2.00±0.23a 滋肾丸低剂量组622.58±0.84b 1.36±0.16ab 滋肾丸高剂量组623.92±1.22b1.24±0.41ab注:与正常组相比,a P <0.05;与模型组相比,b P <0.05㊂注:A 正常组;B 模型组;C 滋肾丸低剂量组;D 滋肾丸高剂量组㊂图1　各组小鼠肝脏组织HE 染色(×200)2.4.2　PAS 染色　光镜下观察小鼠肝脏糖原染色,胞质PAS 反应阳性物质即为糖原,显示为紫红色,细胞核为蓝色㊂正常组肝细胞内紫红色糖原颗粒分布均匀,数量适中,提示血糖正常平稳㊂与正常组相比,模型组肝细胞内紫红色颗粒显著减少,提示肝脏糖原合成减弱;与模型组相比,滋肾丸高㊁低剂量组紫红色颗粒数量显著增加,提示糖原显著增多,与PCR 结果相一致,表明滋肾丸剂量依赖性促进糖原合成,抑制肝糖输出从而起到降低血糖的作用㊂见图2㊂2.5　滋肾丸对KKay 小鼠IRS⁃1㊁PI3K㊁AKT2㊁FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase㊁GCK 基因表达量的影响与模型组相比,滋肾丸各剂量组FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase 的mRNA 表达量均显著降低(P <0.05),且滋肾丸高剂量组下降幅度比低剂量组大㊂与正常组相比,模型组FOXO1的mRNA 表达量显著上升(P <0.05),但PEPCK㊁G6pase 的组间差异不符合预期㊂注:A 正常组;B 模型组;C 滋肾丸低剂量组;D 滋肾丸高剂量组㊂图2　各组小鼠肝脏组织PAS 染色(×200)与正常组相比,模型组GCK mRNA 表达量显著降低(P <0.05);与模型组相比,滋肾丸低剂量组GCKmRNA 表达量有上升趋势,但无统计学意义(P >0.05);高剂量组GCK mRNA 表达量显著上升(P <0.05)㊂与模型组相比,滋肾丸给药后IRS⁃1㊁PI3K 及Akt2的mRNA 有上升趋势,但组间差异无统计学意义(P >0.05)㊂见表5㊂3　讨论中药治疗糖尿病具有多通路㊁多靶点的优势特点,在当前时代背景下运用现代技术探究及阐明其内在作用机制是极其必要的㊂滋肾丸是来源于中医古籍中的经典方剂,组方精妙,量小药少而力专,方中以等量知母㊁黄柏为主,二者皆气寒味苦入肾经,泻火坚阴,在组方配伍中常相须而用㊂‘本草经解“言知母 主消渴热中,除邪气”,‘本草经疏“云黄柏 以至阴之气,补至阴之不足,虚则补之,以类相处”㊂二者相合,少佐温阳化气之肉桂共同起到滋阴化气之效,尤宜于消渴病之下消证㊂本实验参考既有文献研究[4],以10∶10∶1.5的比例制成水提物,探究其降糖机制及量效关系,以冀对临床中方剂应用提供帮助㊂表5　滋肾丸对KKay 小鼠肝组织相关靶基因的影响(x ±s )组别鼠只IRS⁃1PI3K Akt2FOXO1PEPCK G6pase GCK 正常组3 1.66±0.320.47±0.130.73±0.060.19±0.020.92±0.15 2.27±0.34 2.19±0.39模型组3 1.02±0.26a 1.01±0.21 1.01±0.15a 1.01±0.19a 1.01±0.13 1.01±0.19a 1.02±0.26a 滋肾丸低剂量组3 1.09±0.38a 1.71±0.61a 1.19±0.23a 0.41±0.06ab 0.52±0.16ab 0.50±0.19ab 1.62±0.31滋肾丸高剂量组31.47±0.161.53±0.36a1.35±0.53a0.29±0.06b0.35±0.22ab0.32±0.09ab1.99±0.77b注:与正常组相比,a P <0.05;与模型组相比,b P <0.05㊂ 肝胰岛素通路有转录水平以及蛋白磷酸化水平两方面的调节作用,相关研究已证实IRS㊁PI3K㊁Akt是通路上的三个重要节点[6]㊂在生理条件下,胰岛素分泌入血后,沿着IRS⁃1/PI3K/Akt2/FOXO1信号通路发生级联反应,首先与肝细胞膜上的特定INSR结合,通过募集底物IRS⁃1,IRS⁃1多个酪氨酸残基磷酸化,募集PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸磷脂酰肌醇,后者进一步与下游Akt结合并磷酸化激活Akt㊂目前发现Akt有3种亚型,Akt1表达于大部分组织,Akt2主要表达于胰岛素效应组织,Akt3则高度表达于脑和睾丸组织[7]㊂目前的研究表明Akt2是葡萄糖代谢所必需的[8]㊂肝脏Akt2激活后进一步磷酸化FOXO1使其失活,从而释放下游糖异生基因转录及抑制葡萄糖产物生成㊂胰岛素通过这些受体激活和信号蛋白的招募/磷酸化,在肝细胞质膜上启动近端胰岛素的一系列蛋白磷酸化反应㊂FOXO1是肝脏胰岛素信号级联的关键一步,是代谢信号到细胞核的延续与转接[9]㊂资料显示,在高脂喂养的小鼠中肝脏FOXO1mRNA表达降低40%也足以降低基础的肝脏葡萄糖生成[10]㊂正常生理条件下,FOXO1停留在细胞核内,进食状态时在胰岛素作用下磷酸化失活从细胞核转移到细胞质,从而禁用其转录因子活性;在糖代谢紊乱及炎症状态下,FOXO1会发生细胞核移位从而被激活,激活的FOXO1结合转录辅激活因子过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α[9](peroxisome proliferator⁃activated receptorγcoactivator⁃1α,PGC1⁃α),以协调糖异生转录程序,可以靶向提高PEPCK㊁G6pase两个关键酶的基因表达水平来促进糖异生㊂活性FOXO1还与辅阻遏子SIN3A结合,降低GCK 的表达,进一步促进葡萄糖输出[11]㊂GCK是己糖激酶的一种,仅存在于肝细胞和胰岛β细胞中,具有绝对专一性,其作用是催化葡萄糖生成葡萄糖⁃6⁃磷酸(glucose6⁃phosphate,G6p)㊂后者是糖原合成酶(glycogen synthase,GS)的底物,也是别构激活剂[12⁃13],可以促进糖原合酶的激活,提高糖原合成水平㊂GCK还受血糖浓度影响,在生理条件下,高血糖也可导致葡萄糖激酶从细胞核转移到细胞质[14],从而促成葡萄糖⁃G6p流动㊂GCK 催化G6p的生成同时也是有氧氧化的开始,所以GCK同时控制着肝脏葡萄糖的利用与储存[3]㊂目前GCK已成为潜在的治疗靶点,且已经出现了小分子的激活剂[15]㊂本实验以基因突变的KKay小鼠为2型糖尿病对照,在遗传易感的基础上饲以高脂饲料[16],造成外周组织对胰岛素敏感性降低,与人类2型糖尿病表现极为相似㊂实验结果表明,滋肾丸可显著降低KKay小鼠的FBG㊁OGTT AUC及HOMA⁃IR,PCR显示滋肾丸可以降低小鼠FOXO1㊁PEPCK㊁G6pase基因表达,提高小鼠的GCK基因表达,另外通过PAS 染色也证实给药后肝脏糖原增加㊂这些证据均提示药物可能通过降低FOXO1从而上调GCK基因表达㊁下调糖异生酶基因表达,抑制糖异生及促进肝糖原合成,从而改善肝脏胰岛素抵抗,降低血糖水平,可能跟IRS⁃1⁃PI3K⁃Akt2胰岛素信号通路有关㊂PCR结果提示上游IRS⁃1㊁PI3K㊁Akt2基因表达水平改变无统计学意义㊂考虑到胰岛素在上述位点的作用与转录后蛋白磷酸化有关,仍需完善蛋白免疫印迹实验进一步验证㊂此外,滋肾丸复方成分复杂,本实验只探索了该复方对胰岛素通路上的其中一条进行了研究,有可能还涉及到其他的胰岛素通路,仍有待进一步探索㊂参考文献[1]　赵进喜,王世东,张丽芬.糖尿病相关中医病名考辨[J].辽宁中医杂志,2005,32(9):889⁃890.[2]　张伯礼,薛博瑜.中医内科学[M].2版.北京:人民卫生出版社,2002:292.[3]　郭晓媛.滋肾丸干预糖尿病肾病肾小管上皮细胞焦亡作用及机制研究[D].北京:北京中医药大学,2021.[4]　TANG Y H,SUN Z L,FAN M S,et al.Anti⁃diabetic effects ofTongGuanWan,a Chinese traditional herbal formula,in C57BL/KsJ⁃db/db mice[J].Planta Med,2012,78(1):18⁃23. [5]　吴悠,陈源,胡耀木,等.滋肾丸对db/db糖尿病模型小鼠肠道屏障功能及骨骼肌转录组的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):22⁃32.[6]　Taniguchi C M,Emanuelli B,Kahn C R.Critical nodes insignalling pathways:insights into insulin action[J].Nat Rev MolCell Biol,2006,7(2):85⁃96.[7]　常盛.PI3K/Akt信号通路与胰岛素抵抗的研究进展[J].中医药导报,2008,14(7):113⁃116.[8]　Héron⁃Milhavet L,Franckhauser C,Rana V,et al.Only Akt1isrequired for proliferation,while Akt2promotes cell cycle exitthrough p21binding[J].Mol Cell Biol,2006,26(22):8267⁃8280.[9]　丁雷.苦瓜醇提物调节ZDF大鼠肝脏糖脂代谢的机制研究[D].北京:北京中医药大学,2020.[10]　Samuel V T,Choi C S,Phillips T G,et al.Targeting FOXO1inmice using antisense oligonucleotide improves hepatic andperipheral insulin action[J].Diabetes,2006,55(7):2042⁃2050.[11]　Langlet F,Haeusler R A,Lindén D,et al.Selective Inhibitionof FOXO1Activator/Repressor Balance Modulates HepaticGlucose Handling[J].Cell,2017,171(4):824⁃835. [12]　Seoane J,Gómez⁃Foix A M,O'Doherty R M,et al.Glucose6⁃phosphate produced by glucokinase,but not hexokinase I,promotes the activation of hepatic glycogen synthase[J].J BiolChem,1996,;271(39):23756⁃23760.[13]　查锡良,药立波.生物化学与分子生物学[M].第8版.北京:人民卫生出版社,2014:50.[14]　Iynedjian P B.Molecular physiology of mammalian glucokinase[J].Cell Mol Life Sci,2009,66(1):27⁃42. [15]　赵文丽,苏畅,李美英.治疗2型糖尿病药物葡萄糖激酶激活剂的研究进展[J].国际药学研究杂志,2009,36(6):452⁃456.[16]　樊怡欣.四种茶类对自发性2型糖尿病KKay小鼠降糖作用的比较研究[D].北京:北京中医药大学,2011.(收稿日期:2023⁃03⁃08)(本文编辑:张楠)。

小鼠胰岛素(Insulin)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清样本中胰岛素(Insulin)含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠胰岛素(Insulin)水平。

用纯化的小鼠胰岛素(Insulin)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素(Insulin)，再与HRP标记的胰岛素(Insulin)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的胰岛素(Insulin)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠胰岛素(Insulin)含量。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：18mIU/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

小鼠胰岛素自身抗体（IAA）ELISA 试剂盒检测原理2021年是胰岛素发现100周年，胰岛素彻底改变了1型糖尿病患者的管理。

百年来，我们对不同类型糖尿病的发病机制理解也发生了翻天覆地的变化，推动了糖尿病患者的诊疗进展。

目前发现，胰岛素抗体产生的原因有以下两种情况：1、在从未用过胰岛素的受试者体内出现的，对自身分泌的胰岛素产生的抗体，即胰岛素自身抗体（insulin autoantibody，IAA）。

这种抗体被认为是在胰岛β细胞损伤、胰岛素分泌异常时产生的自身免疫性抗体。

虽然在正常人体内这种抗体也可能有少量存在，但一般情况下测不到或浓度较低，定性结果为阴性。

高浓度的IAA常出现在1型糖尿病患者或潜在患者身上。

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫介导的胰腺β细胞破坏。

胰岛素自身抗体（IAA）在许多患有1型糖尿病高风险的受试者在临床疾病发作和暴露于外源性胰岛素之前会产生。

2、应用外源胰岛素后患者体内出现的抗胰岛素的抗体。

这是一种针对外源性胰岛素的抗体，为非自身免疫性抗体，习惯上常称之为胰岛素抗体（insulin antibody，IA）。

实际上这个习惯称谓不贴切，也不准确。

外源性胰岛素抗体是在使用外源性胰岛素时，由于外源性胰岛素具有抗原性，刺激机体免疫系统产生的能与胰岛素结合的抗体，常导致患者胰岛素治疗剂量逐步增大才能达到理想的治疗效果。

这种抗体一般在应用外源性胰岛素后1～2个月左右出现。

外源性胰岛素纯度越低，产生抗体的滴度就越高。

所以，应用动物源胰岛素的患者体内出现胰岛素抗体比较普遍，患者耐药情况也比较普遍和严重。

胰岛素抗体中包括了胰岛素自身抗体和外源性胰岛素抗体（非自身抗体）。

胰岛素自身抗体与外源性胰岛素抗体都是胰岛素抗体的一种类型，他们都属同一种抗体——胰岛素抗体。

因为，他们有同一个抗原——胰岛素。

但是，胰岛素自身抗体与外源性胰岛素抗体产生的机制不同，临床意义也不一样。

艾美捷不同种属的胰岛素自身抗体（IAA）ELISA试剂盒提供了一系列独特而可靠的产品来支持研究中的胰岛素自身抗体（IAA）的分析。

免疫elisa实验报告免疫ELISA实验报告引言：免疫酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是一种常用的生物化学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。

本文将介绍一次关于免疫ELISA实验的报告，探讨实验目的、方法、结果和讨论。

实验目的：本次实验的目的是检测血清中特定蛋白质的含量。

通过免疫ELISA技术，我们希望能够准确、快速地测定目标蛋白的浓度，为进一步的研究提供可靠的数据支持。

实验方法：1. 血清样本制备：从实验动物体内采集血液样本，并离心分离血清。

2. 酶标板涂布：将目标蛋白的抗体溶液均匀涂布在微孔板的孔底，使其吸附在板上。

3. 标准曲线制备：将不同浓度的目标蛋白标准品加入酶标板中，制备标准曲线。

4. 样本加入：将血清样本加入酶标板中，与抗体结合。

5. 二抗加入：加入与目标蛋白结合的二抗，形成“夹心”结构。

6. 底物反应：加入底物溶液，使酶作用于底物，产生显色反应。

7. 反应终止：加入反应终止液，停止酶的反应。

8. 测定吸光度：使用酶标仪测定各孔的吸光度值。

实验结果：通过测定各个孔的吸光度值，我们得到了标准曲线和样本的浓度。

根据标准曲线，我们可以计算出样本中目标蛋白的浓度。

实验数据显示，样本A的目标蛋白含量为X μg/mL，样本B的目标蛋白含量为Y μg/mL，样本C的目标蛋白含量为Z μg/mL。

讨论：本次实验使用免疫ELISA技术成功测定了血清样本中目标蛋白的含量。

通过标准曲线的建立，我们可以准确地计算出样本中目标蛋白的浓度，为后续的研究提供了重要的数据支持。

然而，实验中也存在一些限制和改进的空间。

首先，样本的处理过程可能会影响测定结果的准确性，因此需要严格控制操作步骤和条件。

其次，实验中使用的抗体和二抗的选择也会对结果产生影响，因此需要进一步优化和验证抗体的特异性和效力。

此外，免疫ELISA技术在实验过程中需要使用底物产生显色反应，因此结果的读取和解释可能会受到底物的选择和反应时间的影响。

胰岛素（Ins）测定试剂盒（化学发光免疫分析法）适用范围：用于体外定量测定人血清中胰岛素（Ins）的含量。

包装规格为96人份/盒。

主要组成成分见表1：表1 组成2.1物理性能试剂盒的各液体组分应澄明，无沉淀或絮状物。

冻干粉呈疏松体，加入纯化水复溶后，10min内溶解。

包被抗体微孔板的铝箔袋，应无破损现象。

2.2 准确度试剂盒内校准品与相应浓度的国家标准品同时进行分析测定，用Log(x)-Log(y)模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行(t检验)；以国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测值与标示值的效价比应在0.900～1.100之间。

2.3 线性在[5－160] mIU/L区间内，用 Log(x)-Log(y)数学模型拟合，剂量-反应曲线线性相关系数（r）应不低于0.9900。

2.4 精密度2.4.1 分析内精密度分别检测高值和低值两个样本，分析内精密度（CV）应不高于10.0%。

2.4.2 批间精密度在多个不同批次产品之间，样本测定结果的变异系数（CV）应不高于15.0%。

2.5 最低检出限试剂盒最低检出限应不高于2.0 mIU/L。

2.6 特异性表2 与 CP、胰岛素原的交叉反应2.7 稳定性2.7.1 效期稳定性2℃～8℃保存，有效期12个月，效期后分别检测2.1～2.4.1、2.5项，其结果应符合各项要求。

2.7.2 复溶稳定性冻干粉试剂开瓶后（复溶后），2℃－8℃保存，有效期1个月，效期后分别检测2.1～2.4.1、2.5项，其结果应符合各项要求。

2.8 溯源性应根据GB/T 21415-2008提供所用Ins校准品溯源性资料，并溯源到国家标准品人胰岛素（Ins）,编号：150519。