HPLC法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量

收稿日期:2006207208作者简介:赵欣(19672),女(汉族),黑龙江哈尔滨人,硕士,E 2mail xinzhao63@ ;赵春杰(19602),男(汉族),吉林农安人,教授,主要从事药物分析学研究,T el .024*********,E 2mail zcjjljj @ 。

文章编号:100622858(2008)0320200204HPLC 法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量赵　欣1,谷　艳2,宋欣鑫2,左金梁2,李　丹2,赵春杰2(1.哈尔滨市第一医院,黑龙江哈尔滨150010;2.沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳110016)摘要:目的建立HPLC 法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量。

方法采用Hypersil ODS色谱柱(250mm ×416mm ,5μm ),以乙腈2体积分数为114%的冰醋酸水溶液进行线性梯度洗脱,流速:110mL ・min -1,检测波长:275nm ,进样量:10μL 。

结果阿魏酸的线性为0186～20164mg ・L -1(r =019992),平均回收率为9612%,RSD 为115%;芍药苷的线性为20～200mg ・L -1(r =019993),平均回收率为9713%,RSD 为110%;肉桂酸的线性为211～2713mg ・L -1(r =019995),平均回收率为9410%,RSD 为112%;甘草酸的线性为2114～29196mg ・L -1(r =019997),平均回收率为9811%,RSD 为210%。

仪器与方法精密度均小于210%。

结论该方法能更加全面控制该方的质量,优化后的提取工艺可为今后剂型的改进提供基础。

关键词:高效液相色谱法;当归四逆汤;有效成分;梯度洗脱中图分类号:R 917 文献标志码:A 当归四逆汤源于东汉名医张仲景的《伤寒论》,由当归、白芍、桂枝、细辛、甘草、通草、大枣7味药组成。

该方温经散寒、养血通脉,主治手足厥寒、脉细欲绝[1]。

现代药理研究表明该方有抗凝抗血栓、扩血管、镇痛抗炎的作用[2]。

方中当归养血活血、温经通脉,为君药。

桂枝温经散寒、畅行血脉;芍药益血和营,合用为臣。

细辛助桂枝温经,散表里内外之寒;大枣倍量合炙甘草温养脾气,协归,助芍药更增养血之功,共为佐药。

使以木通引诸药入经通脉。

文献[3-4]仅测定其中阿魏酸或芍药苷的含量,本文作者利用梯度洗脱同时测定了其中4种有效成分的含量,从而能更加全面、有效地控制该方的质量;同时采用已优化好的工艺进行提取,可为新剂型的研究开发提供依据。

1　仪器与试药Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司),RE 252AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),BS110型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),TG332A 型微量分析天平(上海分析天平厂)。

甲醇、乙腈均为色谱纯(天津市康科德科技有限公司),无水乙醇、冰醋酸均为分析纯,实验用水为三重蒸馏水。

阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草酸标准品均购自中国药品生物制品检定所。

当归、白芍、桂枝、细辛、甘草、通草药材均购自沈阳天益堂大药房,大枣购于市场。

2　方法211　色谱条件色谱柱:Hypersil ODS C 18柱(250mm ×416mm ,5μm ),柱温:30℃,流动相:乙腈体积分数为114%的冰醋酸水溶液线性梯度洗脱,洗脱程序见表1;流速:110mL ・min -1,检测波长:275nm ,进样量:10μL 。

T able 1　Program of gradient elutiont /minφ(acetonitrile )/%V (aqueous acetic acid ,φ=114%)/mL0-510905-23148623-30148630-40208040-60307060-805050第25卷第3期2008年3月沈　阳　药　科　大　学　学　报Journal of Shenyang Pharmaceutical UniversityVol 125　No 13　Mar 12008p 1200　212　样品溶液的制备按当归四逆汤处方比例称取当归、白芍、桂枝、细辛、甘草、通草药材粉末适量,精密称定,加大枣一枚,用8倍量的体积分数为85%的乙醇溶液提取2次,每次115h ,合并2次提取液,过滤浓缩,干膏用甲醇定容至25mL 量瓶中,精密量取5mL 于25mL 量瓶中,甲醇稀释至刻度,微孔滤膜过滤,取续滤液在上述色谱条件下进样分析。

色谱图见图1。

A —Mixed standard solution ;B —Negative solution ;C —Sample solution ;1—Paenoniflorin ;2—Ferulic acid ;3—Cin 2namic acid ;4—G lycyzzhizic acidFig 11　RP 2HPLC chromatograms of Dangguisini decoction213　阴性溶液的制备按当归四逆汤处方比例精密称取全方中除当归、白芍、桂枝、甘草外的其他药材,加大枣一枚,按“212”条制备成阴性溶液。

3　结果311　系统适用性试验取供试品溶液,在上述色谱条件下进样分析,理论塔板数按阿魏酸峰计算不低于3000,按芍药苷计算不低于2000,按肉桂酸计算不低于4000,按甘草酸计算不低于4000。

各色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于115。

拖尾因子均在0195～1105之间。

仪器精密度:阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草酸的RSD 分别为019%、112%、018%、114%。

312　标准曲线的绘制分别称取阿魏酸、芍药苷、肉桂酸和甘草酸对照品适量,精密称定,分别置于100mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成单组分对照品溶液,其中含阿魏酸01086g ・L -1、芍药苷01500g ・L -1、肉桂酸01210g ・L -1、甘草酸01214g ・L -1。

分别精密量取各单组分对照品溶液适量置10mL 量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成混合对照品溶液,分别进样10μL ,记录色谱图。

以对照品峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,绘制标准工作曲线。

阿魏酸、芍药苷、肉桂酸和甘草酸分别在0186～20164、2010～20010、211～2713、2114～29196mg ・L -1内,峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

所得回归曲线方程如下:阿魏酸　y =3615200x -010485,r =019992;芍药苷　y =015861x -312090,r =019993;肉桂酸　y =361720x +21195,r =019995;甘草酸　y =261710x -41880,r =019997。

312　方法重复性按处方比例精密称取各药材进行提取,共5份,按“212”条方法操作,在上述色谱条件下测定,阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草酸含量的相对标准偏差分别为115%、113%、210%、116%。

313　回收率试验按处方比例精密称取各药材进行提取,共9份,精密加入一定量对照品溶液,按”212”条方法制成溶液,计算平均回收率,结果见表2。

102第3期赵　欣等:HPLC 法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量 T able2　S ample recoveries(n=9)Compound m basic value/mgm amount/mgAdded FoundRecovery/% x/%RSD/%Ferulic acid015260143001938951996121150160211115971801688111809510Paenoniflorin51276315008171798139713110510001*********610001*********Cinnamic acid017120163011312951294101120173511401931701945115919310G lycyzzhizic acid017190153511233961198112100174911456981401963116809918314　稳定性试验取供试品溶液室温下放置,分别于0、2、4、8、12和24h在上述色谱条件下测定。

结果表明,阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草酸均在24h内稳定,其RSD分别为017%、119%、210%、113%。

315　当归四逆汤样品液测定按处方比例精密称取各药材共5份,同“212”条方法操作,在上述色谱条件下进样,阿魏酸的平均含量为010374%,芍药苷的平均含量质量分数为013752%,肉桂酸的平均含量质量分数为010506%,甘草酸的平均含量质量分数为010511%,结果见表3。

T able3　Contents of samples(n=5)Compound w/% x/%RSD/%Ferulic acid010366010374210010372010369010376010387Paenoniflorin013750013752013013747013755013740013768Cinnamic acid010498010506210010513010501010505010523G lycyzzhizic acid010507010511119010515010501010526010506202 沈　阳　药　科　大　学　学　报第25卷4　讨论411　波长的选择本文作者考察了230-300nm 不同吸收波长图谱,发现275nm 波长下各峰的吸收均较大,图谱特征性强。

故选择275nm 为检测波长。

412　流动相的选择曾试过以乙腈-体积分数为015%的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,发现肉桂酸峰拖尾严重,换成体积分数为114%的醋酸水溶液后,峰形均较好,故选择乙腈-醋酸水溶液为流动相。

413　提取工艺的选择曾以正交试验设计法对当归四逆汤的提取工艺进行优化,以4种成分的含量和浸膏得率为指标,考察了溶剂用量、提取时间和提取次数对提取效果的影响,经过直观分析和方差分析,结果显示以8倍量的体积分数为85%的乙醇溶液、提取2次,每次115h ,能获得最好的提取效果。

参考文献:[1]邓中甲,李冀,连建伟.方剂学[M ].北京:中国中医药出版社,2003:1453.[2]苗明三,王升启.现代方剂学:第十一版[M ].北京:清华大学出版社,2004:885.[3]丁野,黄罗生,高展.HPLC 法测定当归四逆汤中芍药苷的含量[J ].海峡药学杂志,2005,17(1):37-39.[4]葛尔宁.RP -HPLC 测定不同煎煮方法下当归芍药汤中阿魏酸和芍药苷的含量[J ].中国实验方剂学杂志,2005,11(6):16-17.Simultaneous determination of four main compo 2nents in Dangguisini decoctionZHAO Xin 1,GU Yan 2,SON G Xin 2xin 2,ZUO Jin 2liang 2,L I Dan 2,ZHAO Chun 2jie 2(1.The Fi rst Hospital of Harbi n ,Harbi n 150010,Chi na ;2.School of Pharm acy ,S henyang Pharm aceu 2tical U niversity ,S henyang 110016,Chi na )Abstract :Objective To determine simultaneously the contents of four active components in Dangguisini de 2coction by RP 2HPLC method.Methods The separation of four ingredients was achieved on a Hypersil C 18column (250mm ×416mm ,5μm )with gradient elution using solvents of acetonitrile and aqueous acetic acid.R esults Assay was linear over the range 0186-20164mg ・L -1for ferulic acid ,20-200mg ・L -1for paeoniflorin ,211-2713mg ・L -1for cinnamic acid ,2114-29196mg ・L -1for glycyrrhizin acid.Average re 2coveries of samples were all over 9410%,RSD were all below 210%.Conclusions The method is simple and accurate and can be used as the method for quality assessment of Dangguisini decoction.K ey w ords :HPLC ;Dangguisini decoction ;main gredients ;gradient elution302第3期赵　欣等:HPLC 法同时测定当归四逆汤中4种有效成分的含量 。