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差异致龋性变形链球菌细胞外蛋白质组学的初步研究

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重症婴幼儿龋及无龋儿童牙菌斑中变形链球菌的致龋性比较

重症婴幼儿龋及无龋儿童牙菌斑中变形链球菌的致龋性比较
ｐ ｅ ｅ ｔ ｎ ｏ － ｒ ｖ ｎ ｉ ｆＳ ＥＣＣ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ａｃ ｏ ｄ ｎ ｏ ｔ ｅ ＮＩ ｒｔｒ ｏ ． ｔｏ ｓ ｃ ｒ ｉ ｇ ｔ ｈ Ｈ ｃ ｅ ａ，６ ｈ ｌ ｒ ｎ ｗｉ ｇ ａ ｇ ｎ ｒ ｍ ｏ ５ ｉ ｉ ７ ｃ ｉ ｅ ｔ ａ ｅ ｒ ｎ ｉ ｇ ｆｏ ３ ｔ ｄ ｈ
ｅｒ ｈｌｈｏ ａ ｅ （ －Ｃ ）ａ ｄ ｃｒ ｓｆ ｅｃ ｉ ｒｎ ｎ ｈｄ ｌ ｈ ｎ ｔ ａｌ ｄａｎｓ ｎ ａｌ ｃ ｉ ｏｄ ｃｒ ｓ ＳＥ Ｃ ｎ ａｉ ｒ ｈｌ ｅ ，ａｄ ｓｅ ｉ ｔｏ ｈ ｅｒ ｉｇｏｉ ａ ｄ ｙ ｄ ｉ ｅ ｅ ｄ ｇ ｅ ｙ ｓ
Ｗｅ —ｉ ，ＬＮ Ｊ —ｈｎ ，Ｌ ｉ ｘ ａ ，Ｚ Ａ０ Ｗｅ ｕｎｈ ａ Ｓ ｈｏ ｆ Ｓｏ ａｏ ｇ ，［ｓｔｔ ｏ ｎｑｎ ｇ Ｉ ｉ ｃｅ ｇ Ｕ Ｊ －ｕ ｎ Ｈ ｉ ａｇ ｕ ｃｏｌｏ ｔ ｔｌ ｙ ｎｔｕｅ ｆ ａ ａ ．Ｇ ｍ ｏ ｉ
Ｓ ｏ ｔｌｇ ｃ ｌ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ，Ｓ ｎ ｒ ｔｓ ｎ Ｕ ｉｅ ｓｔ ｔｍａｏ ｏ ｉａ ｈ ｕ ５ ０ ５ ｕ ｎ ｚ ｏ １ ０ ５，Ｃ ｉａ ｈｎ
李文卿 林家成 卢佳璇 赵玮
【 摘要 】 目的 对 比分 析重症 婴幼儿 龋 （－Ｃ ） Ｓ Ｃ 儿童 及无龋 儿童牙 菌斑 中变形链 球菌 （ Ｅ 简称
按照 Ｎ Ｈ标 准 ． ６ Ｉ 将 ７名 ３～５岁
变链菌 ） 的致 龋性 ， ＳＥ Ｃ的早期检测及 预防奠定基础 。方法 为 －Ｃ
儿童分 为 ＳＥ Ｃ组 （ ＝ ５ 、 龋组 （ ＝ ２ ， －Ｃ ｎ ３ ）无 ｎ ３ ） 采集牙 面菌斑 ， 经分 离 、 鉴定获取纯 化的变链 菌株 ． 接种 至蔗糖浓 度为 ２ ％的 Ｔ Ｃ Ｂ液体培 养基 ， ０ Ｙ Ｓ 检测其产 酸能力 、 长情 况 、 生 合成水 不溶性葡 聚糖 （ Ｇ ＷＩ ） 的量 以及 黏附 比值 。结果 ＳＥ Ｃ组 及无龋组 中变链 菌株 的检 出率 分别为 ９ ．％及 ６ ．％． －Ｃ ２４ ２５ 差别有 ＳＥ Ｃ患儿牙 菌斑 中变链 菌的定植 比例及 临床分 离菌株致 龋 －Ｃ

龋病免疫学研究新进展

龋病免疫学研究新进展

龋病免疫学研究新进展龋病是一种普遍的多因素的细菌感染性疾病，由于宿主，饮食及微生物在牙表面经过一定的时间导致的局部硬组织的溶解和破坏，这一过程可以被有效免疫应答所干扰。

本文就微生物的致龋特异性，龋病发生时机体的免疫应答及龋病的免疫预防等方面作一综述。

旨在深入了解对龋病的免疫学研究及其进展，为临床龋病的预防和治疗提供参考依据。

标签：龋病；免疫；变形链球菌目前为止，龋病仍是危害人类口腔健康的最常见疾病之一。

我国最近的一次全国口腔流行病学调查显示，我国成人和老年人患龋率分别达88.1%和99.4%，故研究龋病的防治方法仍是口腔研究的重中之重，而对于龋病的免疫学研究更是诸多研究中的热点。

早在上世纪60年代末期，国外学者即开始了防龋疫苗的探索，期望通过接种某种防龋疫苗，有效地阻止致龋菌在宿主口内的粘附与定植，达到预防龋病的目的。

近年来，运用免疫学手段预防龋病的研究更为研究的热点，大量的研究证实，主动和被动免疫对于控制龋病的发生均有一定的作用。

本文就近年来龋病的免疫学研究动态做一综述。

1变形链球菌的致龋特异性龋病是一种由细菌所致的牙体硬组织感染性疾病。

它的基本过程是细菌与糖，特别是蔗糖作用产酸，主要是乳酸，将牙体中的硬组织脱矿所致。

这种硬组织的脱矿过程发生在牙面某些比较隐蔽的部位，这些部位是由于缺氧而导致糖的酵解不完全造成的。

我们将牙面上容易产生龋损的部位叫做龋敏感区。

牙面龋敏感区之所以易产生龋，和牙面的不清洁密切相关。

这里的不清洁有严格界定，即存在着细菌组成的生态环境，即生物膜或生态膜，这个生态膜才是龋病发生的根本，由于该生态膜是口腔微生物为了抵抗抗生素等抗菌渗入所建立的有效屏障？3？。

上世纪70年代以来，人们遵循Koch定律逐渐认识到变形链球菌可能是引发龋病的主要致病菌，尽管如此也存在占次要作用的其他致病菌，如远缘链球菌和乳酸杆菌，其中乳酸杆菌属于机会致病菌。

因此我们可以怀疑：变形链球菌是不是唯一的致龋菌。

龋病菌群失调导致口腔异味的研究

龋病菌群失调导致口腔异味的研究

龋过程中分解有机物产生大量硫化氢类致口腔异味化学物质, 这
就是产生口腔异味的独特原因。
3. 3 口腔异味是人群中常见的一种疾病, 有研究报道口腔就诊
病人 3. 84%的人存在口腔异味, 而吸毒者口腔异味发生率较高达
29. 1%; 口腔异味多见于成年人, 并且男多于女, 与个人的生活卫生
习惯密切相关, 同时男性吸烟和喝酒的比例大于女性, 烟酒的刺激
交 流园 地
马旭东 ( 湖州师范学院医学院 浙江湖州 313000)
【摘要】目的 研究龋病菌群失调与口腔异味症的相关性。方法 选择 18 例口腔异味患者和 18 例健康人, 分别采集龋洞菌作细菌
的定量培养, 并对链球菌、乳酸杆菌及放线菌做抑菌和清除试验。结果 龋病致龋菌受试者菌属总数病例组比健康对照组差异有显著
【摘要】 肿瘤的肾脏并发症已成为严重制约肿瘤患者生存率及生活质量的重要并发症, 被人们日益重视。而恶性淋巴瘤相关性肾小
球肾炎临床罕见, 现报道1例与恶性淋巴瘤相关的膜性肾病。
【关键词】肿瘤 恶性淋巴瘤 肾炎
【中图分 类号】R 7 3 3
口腔异味症是人群中常见的一种疾病, 发病原因有口腔因素 和非口腔因素, 本研究调查了口腔异味症患者 160 例, 发病原因属 于口腔内因素的患者占 82 %, 其中龋病患者约 24％, 尤其急性多 发龋导致口腔异味明显, 龋病致病菌是导致口腔异味主要原因之 一。链球菌、乳酸杆菌、放线菌是口腔致龋病的主要致病菌, 所 以, 研究龋病致病菌与口腔异味症患者相关性, 寻找致口腔异味 的主要因素并控制这些致病菌, 探讨口腔异味症的治疗方法和途 径是十分必要的一 个途径。 1 材料与方法 1. 1 研究对象
2. 4 抑菌试验
药物抑制致龋菌, 可以改善口腔异味。

变形链球菌表面蛋白生物学特性的研究现状

变形链球菌表面蛋白生物学特性的研究现状

变形链球菌表面蛋白生物学特性的研究现状摘要：变形链球菌是口腔当中十分重要的致龋菌组成部分，并在近些年的研究过程中，证明了这种病菌与全身的系统性疾病，也存在着一定的关系。

在细胞外蛋白当中，存在着一定的疾病或者毒性的因子，这对于人体的疾病发生存在着较为紧密的联系。

在本文的分析中，主要阐述了变形链球菌表面蛋白生物学特性，从而为医疗卫生领域的研究提供参考，确保龋齿等相关疾病能够被有效解决。

关键字：变形链球菌；表面蛋白；生物学特性引言：在当下进行变形链球菌的研究过程中，为了实现对表面蛋白生物学的特性研究，就需对其内部组成进行详细的分析与研究。

这种研究方向，不仅仅对于病理研究和抗生素开发有着十分重要的价值，并在不同领域也相应的存在着较高的价值，全面提升了对口腔内部菌群的了解深入程度。

1 研究背景龋齿是一种基于细菌影响下，让引体人体组织发生慢性破坏的疾病、变形链球菌就是一种十分重要的致龋菌。

该菌体是一种革兰氏阳性球菌，在口腔当中的菌群占据着十分重要的比重，也是在近些年的研究进程中，发现对于全身的系统性疾病，带来十分明显影响的关键病害。

在对细胞外蛋白的处理过程中，往往含有这较多的致病菌，同时也相应的存在着一定的毒性因子。

对于这样的疾病发病的机制研究中，存在着较多密切的联系。

蛋白生物学特性的研究中，基本上要从某些特定的时间，对于细胞的蛋白质进行详细的分析，同时加上对于表面蛋白质进行详细的分析，以此了解到蛋白质之间的相互作用情况。

现阶段细菌细胞表面蛋白的研究工作，已经是一个十分重要的研究领域，并取得了十分重要的研究结果。

当下很多蛋白质组学的研究工作开展，都已经纳入到了变形链球菌的研究领域当中，以此进行了深入的研究与分析。

在当下的一些研究当中，已经证明出了与人体全新的系统性疾病带来了直接的影响。

2 变形链球菌这是一种在口腔菌群当中，占据着十分重要比重的一个菌体。

造成人体龋齿的问题，基本上是一种牙体硬组织的慢性破坏性的疾病。

应用Cariogram系统评估龋病风险的研究进展

应用Cariogram系统评估龋病风险的研究进展

应用Cariogram系统评估龋病风险的研究进展李健;刘璐【摘要】龋病是一种严重影响口腔健康的常见病和多发病.研究发现身体差异和生活习惯等原因使个体间患龋风险不同.因此通过预测个体患龋风险可以有针对性采取预防手段,以达到最佳防龋效果.Cariogram系统是应用最为广泛的龋病风险预测系统,本研究就Cariogram系统应用、评估效果以及不足之处等方面作一综述.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2018(047)005【总页数】3页(P461-463)【关键词】龋病;风险评估;预测;Cariogram系统【作者】李健;刘璐【作者单位】中国医科大学口腔医学院口腔预防科,辽宁省口腔疾病重点实验室,辽宁省口腔疾病转化医学研究中心,沈阳110002;中国医科大学口腔医学院口腔预防科,辽宁省口腔疾病重点实验室,辽宁省口腔疾病转化医学研究中心,沈阳110002【正文语种】中文【中图分类】R788.1龋病是多因素作用下的慢性疾病，临床研究[1]发现饮食、氟暴露、敏感宿主和口腔微生物与社会、文化和行为因素差异导致不同个体患龋风险不同。

我国第3次全国口腔流行病学调查显示，12岁青少年恒牙龋病患龋率为28.9%，5岁年龄组患龋率为66%，其中79.3%的龋病发生在1/3的人群中[2]。

美国第3次全国健康和营养调查[3]同样发现，15岁年龄组中60%龋病发生在1/5受检人群中。

从以上结果可以看出，龋病在人群中的分布情况不是平均的，一部分人会因各种因素影响而表现出较高的患龋风险，这部分人群称为龋病高危人群[4]。

随着现代龋病研究发展，研究热点从龋病修复和治疗向龋损早期诊断和预防措施方向转变，通过龋病风险预测，筛选出龋病高危人群，在个体水平上有助于提供适当防龋措施，在群体水平上可更有效地利用口腔卫生保健资源，有的放矢地降低龋病发生。

龋病预防目的是尽早发现龋齿，从而做到早期诊断、早期预防及早期治疗，所以需要首先掌握龋病发生的危险信号。

龋病微生物因素研究进展

龋病微生物因素研究进展

龋病微生物因素研究进展陈婧;程磊;周学东;彭显【期刊名称】《华西口腔医学杂志》【年(卷),期】2018(36)1【摘要】龋病是发病率最高的口腔慢性感染性疾病,以变异链球菌为代表的一系列细菌曾被认为是龋病的单一致病菌.然而,近几十年来,基于传统致病菌的防治手段未能有效降低龋病的发病率,人们逐渐认识到单一致病菌理论并不能全面反映疾病与微生物的关系.龋病病因学的微生物研究逐步从传统致病菌理论过渡至微生态失衡理论.目前,随着检测手段的不断发展,大量龋病微生物群落研究陆续开展,龋病“核心微生物组”的概念得以提出,即在龋病发生发展中起到关键作用的一组微生物,这将是未来龋病微生物因素研究的方向.%Dental caries is the most common chronic infectious disease of the oral cavity.The bacterium Streptococcus mutans is the sole pathogen that causes this disease.However,substantial evidence suggests that prevention and treatment strategies developed from traditional "cariogenic pathogen theory" are inefficient in reducing the prevalence of dental caries.An increasing number of individuals adopt the ecological view of the microbiota in the pathogenesis of dental caries.Recent technological improvements have enabled the detection and analysis of oral microorganisms,and many studies have focused on this area.The core microbiota is defined as a cluster of microbes playing critical roles in the initial and development phases of dental caries and may provide future direction for microorganism-related etiological studies.【总页数】5页(P104-108)【作者】陈婧;程磊;周学东;彭显【作者单位】口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院,成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院,成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院,成都610041;口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院,成都610041【正文语种】中文【中图分类】R780.2【相关文献】1.龋病相关微生物群落结构与功能的多组学研究进展 [J], 霍媛媛;韩轩;李雨庆;邹静;2.婴幼儿龋病相关危险因素的研究进展 [J], 鲍雪俐;阿依努尔·阿不都热衣木;赵今3.家庭因素与儿童龋病患病相关性的研究进展 [J], 李玥晓4.菌斑微生物群落构成变化与儿童龋病相关研究进展 [J], 周庆楠;尚佳健5.菌斑微生物群落构成变化与儿童龋病相关研究进展 [J], 周庆楠;尚佳健因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

表兄链球菌致龋性与免疫防龋的研究进展

表兄链球菌致龋性与免疫防龋的研究进展
孙静华;牛玉梅;樊明文
【期刊名称】《国际口腔医学杂志》
【年(卷),期】2008(35)2
【摘要】表兄链球菌是变异链球菌群中的一种重要致龋菌,检出率逐渐提高.与变异链球菌相比较,表兄链球菌的产酸性和耐酸性更强,与高度龋活性的关系更为密切,日益引起学者们的重视.下面就该菌的致龋性及其与免疫防龋相关的研究进展作一综述,以期对龋病病因学和免疫防龋的深入研究提供参考.
【总页数】4页(P167-169,175)
【作者】孙静华;牛玉梅;樊明文
【作者单位】哈尔滨医科大学口腔医院牙体牙髓病科,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨医科大学口腔医院牙体牙髓病科,黑龙江,哈尔滨,150001;口腔生物医学工程教育部重点实验室,武汉大学,湖北,武汉,430079
【正文语种】中文
【中图分类】R781.1
【相关文献】
1.高龋及无龋者变形链球菌临床分离株致龋性研究rnⅠ 对唾液包被羟磷灰石的粘附实验 [J], 黄晓晶;杨锦波;刘天佳;陈舟;詹玲
2.高龋及无龋者变形链球菌临床分离株致龋性研究rnⅡ 合成细胞外多糖能力的实验研究 [J], 黄晓晶;刘天佳;杨锦波;陈舟;刘建国
3.变形链球菌的致龋性及鉴别的研究进展 [J], 王金华;林居红
4.变形链球菌黏附相关分子及其针对性免疫防龋的研究进展 [J], 张鹰;文玲英;储冰峰
5.蔗糖浓度对重症婴幼儿龋菌斑中变型链球菌致龋性的影响 [J], 赵玮;李文卿;卢佳璇;余东升
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研究背景


• 四、研究方案 • （一）变形链球菌UA159不同生长阶段和不同条件下耐 热性的差异对不同时期不同PH条件下的菌株进行热应 激，筛选热应激性能优良的菌株。 • （二）选取耐热性强菌株进行热适应条件和致死评价 条件摸索 • 1、在不同温度下水浴锅中处理细菌30min，分别活菌 计数，确定热适应和致死评价温度范围 • 2、按照1中所确定的温度，将菌液在该温度下热适应 处理30min，对照置于37摄氏度培养30min • 3、计算对照管和测试管菌体的存活率，通过比较两者 的存活率来选择最佳的热适应温度 • 存活率=评价前活菌数/评价后活菌数*100% • 耐热性提高倍数=热适应组存活率/对照组存活率
• • • • • •
（四）二维凝胶电泳 1、样品制备 收集菌体、洗涤、材料破碎 失活或者去除干扰物质 蛋白质增溶溶解 2、蛋白质提取 冲液悬浮菌体，离心后收集 菌体沉淀 • 3、蛋白质定量和上样
• 4、采用胶内加样法，IPG胶条(pH值范围为pH 3 to 6, 4 to 7, or 5 to 8)水合作用过夜后，再进行等电聚焦， 总电压合计达60 kV。等电聚焦结束后，将IPG胶条 置于平衡液I(0．05 mol／LTris-HClpH 8．8，6 mol ／L尿素、质量分数30％ 甘油，质量分数2％ SDS、 质量分数1％DTT或者5%的碘乙酰胺还原15 min）， 将IPG胶条移至质量分数12%-14%的SDS-PAGE 胶 上，行二维垂直SDS-PAGE电泳，电泳结束后，固 定胶，用考马斯亮蓝染色。 • 考马斯亮蓝染色（将凝胶转入染色盘中倒入考染液, 振荡染色过夜,约12 h。染色结束后以20%乙醇双蒸 水洗涤脱色一次,再以双蒸水洗涤两次至背景清晰）
• （二）对普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)热休克反应的研究中，应用双向凝 胶电泳方法发现DnaK、HtpG、HtrA、 AhpC等热休克蛋白表达水平的变化与芯片 结果一致。 Global analysis of heat shock response in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

防龋型免疫球蛋白的研究现状

中 。对 防 龋 型免 疫 球 蛋 白的发 展 前 景 作 了大胆 预 测 。 关 键 词 ： 疫 球 蛋 白 防龋 变形 链 球 茵 牙膏 免
龋 病被世界 卫生组 织列在癌症 和心 血管疾病 之
后， 是严 重威胁 人类健康 的三大疾 病之一 ， 变形链 球
此外 ， 采用胶囊 技 术 可 以保护 ｌＹ的活 性 不 受 ｇ
制作用 ， 对其他菌种没有杀灭或抑制作用 ， 从而对致 龋菌 的作 用具 有 长久性 引。
２ 防龋 型免疫 球 蛋 白与 氟 的防龋 机制 比较 ．
２ １ 氟的防 龋机制 ．
抑制 ， 故其检 出水平大幅下降。Ｍ Ａ等还认为 ， 抗体
通过抑 制干 扰变链 菌和 血链菌在 牙 面 的粘 附定植 而
备 方 法 、 用机 理 及其 应 用 等 ， 出在 ｐ 值 为 ５— 作 指 Ｈ ７时 比较 稳 定 ， 用胶 囊技 术 可 以保 采
护 ＩＹ的活性不受外界影响 ， ｇ 可与变形链球茵表 面抗原特异性 结合 ， 直接抑制其生长繁
殖， 并抑制 牙茵斑的形成 ， 而获得 防龋的效果 ， 从 可应用在 防龋 、 白、 美 清新 等类型牙膏
浓度山梨醇溶液 中， 稳定性得到很好 的提高 。
维普资讯
２０ ０ ８年第 １ 期
牙
膏
工
业
３ ｌ
体产 品 ， 只对 变形 链球 菌等 致龋 菌有 较好 的杀灭 、 抑
Ｍａ 等研究 表 明 ， 然应用抗 体后 细菌 的总菌 落 虽 数没有 显著 性改 变 ， 变 链 菌 和血 链 菌 的粘 附受 到 但
别 ， 口腔保健 中同样 可 以应 用类似技术 。 在 防龋型免疫球 蛋 白 （ｇ 是 从鸡 蛋 中获得 的抗 ＩＹ） 体 ， 特殊处理后 具有 良好的稳定性 ， 经过 对热 、 、 酸 碱

口腔微生态与龋病防治的研究进展

口腔微生态与龋病防治的研究进展龋病是指发生于牙体硬组织的慢性进行性疾病。

世界卫生组织将龋病与肿瘤、心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。

第四次中国口腔健康流行病学调查报告显示，儿童乳牙和成人恒牙患龋发生率均呈上升趋势。

随着现代口腔微生态学的发展及研究方法的进步，人们逐渐认识到龋病的发生与口腔微生态失衡密切相关，并通过调节口腔微生态来防治龋病。

本文对口腔微生态与龋病防治的研究进展进行了综述。

1.口腔微生态概述口腔微生态是由口腔内存在的各种微生物及唾液等环境所构成的微生态系统，在参与机体代谢、免疫、营养及维持口腔健康等方面具有重要生理作用。

目前研究发现，人类口腔内至少包含179属645种微生物，虽然大部分微生物无法进行体外培养，但随着16srRNA基因测序技术和宏基因组学的发展，逐渐丰富了人们对口腔微生态的认识。

利用宏基因组测序方法分析口腔细菌菌群结构时发现，口腔内优势菌属包括奈瑟菌属、罗斯菌属、链球菌属、韦荣菌属、放线菌属等多个菌属。

这些菌属存在形式大多为生物膜，而生物膜是维持口腔微生态平衡的重要屏障之一，因此抗致病性生物膜的方法被广泛应用于口腔疾病的防治。

有研究发现，口腔微生态的改变与多种口腔疾病相关，如龋病、牙髓炎、牙周炎，甚至口腔颌面部肿瘤等。

如口腔内微生物通过激活Toll样受体，触发一系列促炎途径的信号通路，释放有害代谢产物如过氧化氢，形成促癌生长的环境，从而诱导口腔癌的发生。

有研究应用同位素标记相对和绝对定量技术在龋活性样品中检测到放线菌、链球菌等细菌。

2.口腔微生态失衡与龋病的发生发展口腔在受到外界刺激或口腔内环境改变时，口腔微生物群的种类、结构会发生变化，物质的代谢也会受到影响，出现口腔微生态失衡，导致疾病的发生、发展。

龋病是在含糖食物持续刺激下，口腔内菌群比例失调造成生物膜内pH 值下降致牙齿脱矿而形成。

有研究发现，龋病人群微生物群落结构、组成及代谢较健康人群更为复杂，其中链球菌属、放线菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、艰难杆菌属等多种细菌菌属的丰度相对较高，且在龋病治疗后，口腔微生态失衡会得到一定改善，提示口腔微生态失衡在龋病的发生和发展中具有重要作用。

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差异致龋性变形链球菌细胞外蛋白质组学的初步研究戴煦原;崔伟;杨光;王成龙【摘要】目的:分析不同致龋性变形链球菌之间细胞外蛋白质的差异性,研究变形链球菌的胞外蛋白在细菌致龋过程中的作用.方法:相同条件培养变形链球菌的不同致龋性的临床分离株,提取各菌株的细胞外蛋白,利用双向电泳和质谱分析进行蛋白组学的分析,重组表达并纯化在不同致龋性变形链球菌表达有差异的胞外蛋白.结果:获得在不同致龋性变形链球菌中构成与表达量有差异性的细胞外蛋白,并重组表达了这一组蛋白中的S1蛋白.结论:不同致龋性变形链球菌细胞外蛋白表达有差异,这些差异蛋白有可能在变形链球菌致龋过程中具有重要的生物学功能.【期刊名称】《中华老年口腔医学杂志》【年(卷),期】2019(017)004【总页数】5页(P193-197)【关键词】变形链球菌;蛋白组学;双向电泳;质谱分析【作者】戴煦原;崔伟;杨光;王成龙【作者单位】解放军总医院第一医学中心口腔科北京 100853;解放军总医院第一医学中心口腔科北京 100853;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京 100850;解放军总医院第一医学中心口腔科北京100853【正文语种】中文【中图分类】R781龋病是一种牙体硬组织的慢性破坏性疾病，变形链球菌是导致龋病发生发展的主要致龋菌[1～3]。

对于变形链球菌致龋因子的结构和功能，包括葡糖基转移酶[4～6]、表面抗原AgI/II蛋白家族[7,8]、葡聚糖结合蛋白[9,10]以及群体感应密切相关LuxS蛋白和信号分子AI-2[11]等，学者们已经有了比较明确的认识。

但是基于变形链球菌致龋因子的龋病防治效果还不能令人满意[4,9,12,13]。

分泌蛋白质组(Secretome)是蛋白质组学研究的重要内容，是对细胞释放到胞外的全部蛋白质(细胞外蛋白)的研究。

病原菌的分泌蛋白质往往含有致病或毒性因子，与疾病发病机制密切相关，对疾病发病机理的研究等具有重要意义[14～18]。

关于变形链球菌分泌蛋白质组研究，目前国内外还未见文献报道。

我们在前期研究工作[19]的基础上，研究高、低致龋性变形链球菌细胞外蛋白质的差异，希望能够发现除GTF、GBPs等致龋因子外，不同致龋性变形链球菌差异表达的蛋白并为这些差异表达蛋白在致龋过程中的作用及其机理研究打下基础。

1.材料与方法1.1 菌株变形链球菌国际标准株Streptococcus mutans Ingbritt(首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所提供)，低致龋性临床分离株4号、高致龋性临床分离株5号[19,20](本课题组保存)。

1.2 主要仪器 ImageMaster 2Dplatinum双向电泳凝胶图像分析软件；Burke公司REFLEXTMIII型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDITOF-MS)；Micromass公司ESI-MS/MS(Q-TOF 2)质谱仪；Bio-Rad Protena II型垂直电泳仪。

1.3 实验方法1.3.1 变形链球菌细胞外蛋白制备参照Liu Y等的 TCA(三氯乙酸)法[21]。

1.3.2 双向电泳第一向等电聚焦；第二向SDS-PAGE电泳。

1.3.3 银染色1.3.4 ImageMaster 2D platinum软件分析双向电泳凝胶图像运用Image Master 2D Platinum软件对电泳凝胶图像蛋白质斑点进行检测、量化、背景扣除、匹配，自动检测后手工校对，取4号菌株凝胶图像作为参考凝胶，5号菌株凝胶图像与之匹配。

1.3.5 质谱分析 ESI-MS/MS正交加速电喷雾串联质谱仪，配有毛细管液相色谱和纳升喷雾源，所有测定均为正离子模式，雾化气体为N2，碰撞气体为H2，源温80℃，锥孔电压50V，TOF加速电压9.1kV，MCP检测器电压2200V。

取4ul样本，900V毛细管电压，检测获得串联质谱图，经过MaxEnt3处理后，使用MasSeq推导出肽段序列。

1.3.6 变链菌标准株S1基因克隆、重组表达S1蛋白纯化以变形链球菌Ingbritt基因组为模板，设计合成S1特异性引物，5'F NdeI：CATA TGATGAATGAATTTGAAGA，3'R XhoI：CTC GAGTTATAATTCAATATCAC，通过PCR扩增得到S1基因。

PCR条件为94℃变性，55℃退火，72℃延伸，进行30个循环。

将PCR扩增得到的S1片段用NdeI和XhoI酶切分子克隆至pET-28a载体，将所得表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。

通过菌落PCR和基因测序鉴定序列正确性。

挑取pET-28a-S1-BL21阳性克隆于LB(kana+)培养基，37℃220rpm摇床过夜，以1∶100比例接入到新的LB(kana+)培养基中，37℃220rpm摇床培养约1.5小时，OD600约为0.6时，加入1mM IPTG，继续37℃220rpm摇床培养6h，所得菌液5000rpm离心5min去上清，ddH2O重悬后超声裂解，Ni亲和树脂柱亲和纯化于裂解液上清的目的蛋白。

2.实验结果2.1 变形链球菌细胞外蛋白的制备通过TCA沉淀法处理对数生长末期的4、5号变形链球菌菌液分别获得两菌株的细胞外蛋白，经SDS-PAGE电泳验证，4、5号菌的细胞外蛋白的电泳凝胶图像可见蛋白条带存在差异。

2.2 变链菌细胞外蛋白双向电泳对获得的细胞外蛋白样本进行了双向电泳，分析凝胶图像(图1)：蛋白点匹配率76%。

以蛋白量有3倍以上差异为标准，其中4号菌株有高表达蛋白点10个(图1A)，5号菌株有高表达蛋白点4个。

同时5号菌株有特异表达蛋白点4个(图1B)。

图1 变形链球菌细胞外蛋白双向电泳A：低致龋菌株4号；B：高致龋菌株5号(“○”表示高表达蛋白点，数字表示5号与4号蛋白表达量比值，“△”表示特异表达蛋白点)我们挖取了5号菌株电泳的2个高表达蛋白点和2个特异表达蛋白点进行质谱分析(图2)，分别标记为 70、71、72、73。

图2 质谱分析位点(70、71点高表达蛋白点，72、73为特异表达蛋白点)2.3 质谱分析通过对4个差异蛋白点质谱分析获得以下结果(表1)。

表1 差异致龋性变形链球菌细胞外蛋白质谱分析表NCBI GI number Protein name[strain]gi|488197484 gi|488222043 gi|488206298 gi|3130093gi|24379801 gi|24379637 gi|21666296 gi|290581292 gi|488240714gi|488208813 gi|24378856 gi|488207400 gi|24378589 gi|488207131gi|24380475 gi|24379669 gi|490994699 gi|516665418 gi|15341180gi|446651915 gi|488193341 gi|195978262 glucan-binding proteinA,GbpA[Streptococcus mutans]glucan-binding proteinA,GbpA[Streptococcus mutans]levansucrase precursor[Streptococcus mutans]glucosyltransferase-I[Streptococcus mutans]glucan-binding protein GbpC[Streptococcus mutans UA159]5'-nucleotidase[Streptococcus mutansUA159]GroEL[Streptococcus mutans]levansucraseprecursor[Streptococcus mutansNN2025]glucosyltransferase-SI[Streptococcus mutans]glucosyltransferase-I,partial[Streptococcus mutans]elongation factor G[Streptococcus mutansUA159]levansucrase precursor[Streptococcus mutans]hypothetical proteinSMU_63c[Streptococcus mutans UA159]30S ribosomal proteinS1[Streptococcus mutans]hypothetical protein SMU_2147c[Streptococcus mutans UA159]enolase[Streptococcus mutans UA159]sugar ABC transporter substrate-binding protein[Klebsiellaoxytoca]enolase[Streptococcus ferus]glucan-binding proteinB[Streptococcus mutans]trigger factor[Bacillus cereus]recombinaseA[Streptococcus mutans]30S ribosomal protein S1[Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus MGCS10565]2.4 重组表达S1蛋白我们利用变形链球菌基因组为模板，使用S1特异性引物，PCR钓取S1片断(图3)，测序鉴定序列正确，构建pET-28a-S1表达载体并转入大肠杆菌BL21感受态细胞，菌落PCR(图4)及测序鉴定：pET-28a-S1表达载体构建成功。

图3 PCR钓取S1片段1：对照；2：S1图4 pET-28a-S1-BL21菌落PCR测序正确的阳性克隆成功在37℃、1mM IPTG诱导下成功表达分子量大约为50kDa的S1蛋白。

利用pET-28a载体表达系统自带的his标签，使用Ni离子螯合柱成功纯化获得了纯度较高的重组表达S1 蛋白(图 5)。

图5 S1蛋白重组表达SDS电泳图3.讨论蛋白质组学研究是对蛋白质的成分、表达和修饰的动态变化从整体水平进行的研究。

既往变形链球菌的蛋白组学的相关研究多为关于突变株[16]蛋白表达差异、不同生存条件下[22]的蛋白表达差异以及不同黏附状态下[23]的蛋白表达差异的研究。

而使用蛋白质组学方法研究不同致龋性变形链球菌差异蛋白对于致龋因子和龋病发病机理研究意义更大。

赵兴福，黄晓晶等[15]的研究显示来自高龋患者和无龋者的血清C型变形链球菌的临床分离株的蛋白表达有差异。