根癌农杆菌介导的水稻转化研究进展

水稻转基因育种的研究进展与应用现状刘志宏1　田　媛2　陈红娜1　周志豪1　郑　洁2　杨晓怀1（1深圳市农业科技促进中心，广东深圳518000；2暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）摘要：随着生物技术发展的不断深入，我国水稻种业的发展也面临着全新的机遇和挑战。

目前，改善水稻品种质量的主要方法有分子标记技术、基因编辑技术和转基因技术。

其中，转基因水稻是利用生物技术手段将外源基因转入到目标水稻的基因组中，通过外源基因的表达，获得具有抗病、抗虫、抗除草剂等优良性状的水稻品种。

近年来，国内外在采用转基因技术进行水稻育种，提升水稻产量、改善水稻品质方面具有较多的研究进展。

在阐述转基因技术工作原理的基础上，概述国内外利用转基因技术在优质水稻育种方面的研究进展，进一步探究转基因技术在我国水稻育种领域的发展前景。

关键词：转基因育种；水稻；病虫害；除草剂Research Progress and Application Status of Rice Transgenic Breeding LIU Zhihong1，TIAN Yuan2，CHEN Hongna1，ZHOU Zhihao1，ZHENG Jie2，YANG Xiaohuai1（1Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center，Shenzhen 518000，Guangdong；2Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632）水稻（Oryza sativa L.）作为世界上重要的粮食作物之一，为世界超过1/3的人口提供了主粮，全球种植面积约1.4亿hm2[1]。

“十二五”以来，我国水稻产量连续稳定在2亿t以上[2]。

水稻作为我国的主要粮食作物，在我国粮食生产领域占据着十分重要的地位，水稻品种改良仍是保障种业持续发展和国家粮食安全的重点。

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化研究进展根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是一种广泛应用于真菌基因功能研究与基因工程改造的技术。

通过利用根癌农杆菌T-DNA插入系统，将外源DNA转移至真菌细胞中，并将其整合到其基因组特定位点中，以此实现真菌基因突变、功能分析和引入外源基因等目的。

本文将介绍根癌农杆菌介导的真菌遗传转化技术的原理、方法和应用，并对其研究进展进行概述。

一、技术原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种经常被应用于植物基因工程的重要媒介，其T-DNA插入系统是实现外源基因整合的重要工具。

T-DNA是根癌农杆菌质粒中可转移DNA的一部分，其特点是，在植物感染过程中，T-DNA可被转移至寄主植物细胞内，并随后整合到其基因组中。

利用这一特点，将要转化的DNA导入到T-DNA载体中，然后插入到根癌农杆菌中，再将根癌农杆菌和真菌竹蜜菇接触，使得根癌农杆菌向真菌转移T-DNA，并通过T-DNA的插入将外源DNA整合到真菌基因组中。

二、方法简介根癌农杆菌介导的真菌遗传转化分为三个主要步骤，包括构建T-DNA载体、初始感染和筛选鉴定。

1. T-DNA载体构建T-DNA载体是根癌农杆菌之间传递转移DNA的载体，也是构建真菌遗传转化所需的载体。

在构建T-DNA载体时，需要创建flanking序列、筛选标记和转入基因。

其中，flanking序列是T-DNA插入到基因组中的标记，通常使用真核生物的基因表达元件，如启动序列或终止序列等，在T-DNA插入过程中随之整合到基因组中。

筛选标记则是指用于鉴定转化后的真菌是否包含T-DNA的标志，一般建议选择抗性基因或荧光蛋白基因。

转入基因则是要转入真菌中并施加特定的功能的外源基因。

2. 初始感染根癌农杆菌与真菌的接触是通过共培养实现的。

首先，将竹蜜菇生长在含有不同浓度的根癌农杆菌悬浮液的培养基上。

当根癌农杆菌悬浮液达到适当的浓度时，将其与真菌孢子混合，并将混合物培养在适当的时间和温度下，使根癌农杆菌向真菌细胞释放T-DNA，再经过植物激素、光照等处理，使真菌细胞产生表型变化，如生长速度快慢、菌丝分化、子实体大小等，这些都是外源DNA整合到基因组中的结果。

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。

下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。

T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。

不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。

置于该边界内的任何外源基因均可被转化。

LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。

LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。

其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。

该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。

3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。

它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。

华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2023, 44(6): 843-853DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202307001郭涛, 沈任佳, 王加峰. 水稻基因遗传转化方法研究进展[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(6): 843-853.GUO Tao, SHEN Renjia, WANG Jiafeng. Research progress on genetic transformation methods of rice[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(6): 843-853.特约综述水稻基因遗传转化方法研究进展郭　涛 ，沈任佳，王加峰(华南农业大学 农学院/国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东 广州 510642)摘要: 介绍水稻遗传转化方法的发展历程和科研成果，为水稻遗传转化体系的研究和应用提供借鉴。

从生物介导转化法和非生物介导转化法2类方法出发，介绍各种转化方法在水稻上的首次报道和重要进展并进行了展望。

生物介导转化法中，农杆菌Agrobacterium介导转化法通过侵染种胚、稻穗、愈伤组织和茎尖进行转化，种胚及其诱导的愈伤组织作为材料的转化体系较为成熟，稻穗和茎尖转化法则操作简便、转化再生周期短；此外，有研究尝试用根瘤菌Sinorhizobium和Rhizobium以及附着剑菌Ensifer adhaerens转化水稻。

非生物介导转化法中，物理方法转化法(基因枪法、电击法、花粉管通道法和显微注射法)是较为传统的转化方法，基因枪法应用较为成熟，花粉管通道法则取得较多育种成果；介质介导转化法中，纳米材料的应用正逐步成为研究热点。

水稻遗传转化体系的发展可从转化材料的筛选和优化介导转化的载体入手，同时将转化体系和DNA-free、单倍体诱导等技术结合起来，以提高转化效率和安全性，缩短转化再生周期。

基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。

作者简介陈思（1997—），女，安徽安庆人，助理农艺师，从事水稻遗传育种工作。

*通信作者收稿日期2022-06-17农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展陈思张从合*王慧吴浩然杨力黄艳玲管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA 结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。

本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。

关键词水稻；根癌农杆菌；农杆菌介导转化法；遗传转化中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0001-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.001开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Influencing Factors of Agrobacterium-mediated GeneticTransformation of Rice and Its ApplicationCHEN SiZHANG Conghe *WANG HuiWU HaoranYANG LiHUANG YanlingGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice genetic transformation,agrobacterium-mediated transformation method has manyadvantages compared with other methods,such as the complete structure and relatively stable expression of the transferred exogenous DNA,simple operation and high transformation rate.It has been widely used in transgenic technology.This paper reviewed the principles of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens and the factorsaffecting genetic transformation,and discussed the application prospects of agrobacterium-mediated methods.Keywordsrice;Agrobacterium tumefaciens ;agrobacterium mediated transformation method;genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全球1/2以上人口的主食，也已经成为植物基因组学研究的重要对象[1]。

农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。

实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。

水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。

DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。

其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。

基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。

同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。

所以已成为转化单子叶植物的首选方法。

一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。

2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。

3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。

将农杆菌作为载体成功获得转基因烟草的试验发生在1983年，其后的30多年，农杆菌介导的遗传转化技术在双子叶植物的研究中得到了长足发展。

之后，关于单子叶植物在这方面的研究却比较少，因为农杆菌寄主范围局限于双子叶植物和一些裸子植物。

单子叶植物被认为不能作为农杆菌的宿主，所以难以被转化。

因此最初人们关于单子叶植物通过根癌农杆菌介导遗传转化的研究很少，而多是采用PEG法、基因枪法及电激法等。

1根癌农杆菌转化单子叶植物的研究进展1.1水稻水稻作为单子叶植物研究的模式植物，关于根癌农杆菌介导水稻遗传转化的研究开始得比较早。

水稻的遗传转化研究从完全否定其可行性，到可以进行转化，从低频率转化到高频率，经过几十年的研究发展，已经具备了相当的理论基础和研究成果，实现了许多优质的外源基因对水稻的遗传转化[1]。

李宝健证明了水稻是可以通过农杆菌进行遗传转化的，并获得了转基因的水稻，虽然其转化频率很低，却是农杆菌介导转化单子叶植物的一大突破。

这之后，Hiei证明了水稻是可以被有效侵染的，他不仅利用胚性愈伤组织作外植体，还将粳稻的转化频率提高到28.3%，并建立了水稻的遗传转化体系。

王春萍等[2]将ThIPK2基因通过农杆菌介导法插入到籼稻科恢675中，经验证后，通过该试验结果完善了优良的遗传转化体系。

张燕红等[3]利用农杆菌介导法，将SiPEBP基因转入到秋田小町、新稻21号以及08GY30-5-4这3个新疆品种水稻中，试验结果表明，3个品种的抗性愈伤率皆达到了40%以上。

1.2玉米玉米作为三大粮食作物之一，是作为单子叶植物研究的重要对象。

1996年，Ishida等[4]选用玉米自交系A188幼胚作为受体的转基因试验，获得了世界上第一株用该方法转化的转基因玉米，从而证实玉米是能够被转化的，为玉米的遗传转化研究提供了一定的理论基础。

邢小龙等[5]将GUS作为目的基因，以玉米杂交种“郑单958”为材料，以Bar作筛选标记，试验结果表明，在侵染浓度0.6、侵染时间2h、真空处理时间10min的条件下，“郑单958”作为受体能有效提高转化效率。