全血蛋白提取方法

全血基因组DNA提取试剂盒使用说明一、试剂盒组成及存储条件：1.试剂盒包括蛋白酶K、缓冲液、洗涤缓冲液、脱水溶液等。

2.试剂盒应存放在4℃以下避光干燥处，避免冻结。

二、实验前准备：1.准备所需的实验耗材和设备，如离心管、恒温振荡器、离心机等。

2.取出全血样品，可以是新鲜全血或已离心制备的全血细胞。

三、DNA提取步骤：1.取出全血样品，用洗涤液洗涤细胞沉淀并离心收集，去除红细胞。

2.加入蛋白酶K将细胞裂解，释放DNA。

3.加入缓冲液和脱水溶液，沉淀DNA并洗涤。

4.最终稀释DNA并保存在适当的条件下。

四、实验注意事项：1.操作过程中需注意无菌操作，避免污染。

2.加入蛋白酶K的量应准确控制，不要过多或过少。

3.混合溶液时需轻轻摇匀，避免气泡的产生。

4.稀释保存DNA时，需使用无核酸酶的载体溶液，如TE缓冲液。

五、质控及结果分析：1.可以通过琼脂糖凝胶电泳或比色法检测提取的DNA质量。

2.检测DNA浓度和纯度，确保提取的DNA适用于后续实验。

3.可以保存提取好的DNA样品，以备后续实验使用。

六、应用领域：1.该试剂盒适用于从全血样品中提取DNA，可用于基因分析、疾病诊断、遗传研究等领域。

2.可以用于个体基因检测、种群遗传学研究、药物反应性研究等。

总结：全血基因组DNA提取试剂盒是用于从全血样品中提取DNA的重要工具，操作简便、提取效率高。

在实验中需注意操作规范，保证提取的DNA质量和纯度。

该试剂盒广泛应用于科研领域，为基因研究和临床诊断提供了有力支持。

希望上述使用说明能够帮助用户正确、高效地使用全血基因组DNA提取试剂盒。

全血超敏C-反应蛋白(bCRP)检测SOP文件一、检验目的：能鉴别出细菌和病毒感染，量的动态变化能反映病症的活动性。

二、原理：用散射光比浊法，可溶性抗原与特异性的抗体反应形成不溶性复合物，当光线通过反应悬液时发生散射并由特定蛋白分析仪检测到。

散射光值的多少与测试样品中的特定蛋白浓度成一定比例。

通过刷卡将磁卡中的标准曲线存储入仪器中，仪器会自动计算出样品中特定蛋白浓度。

三、标本的采集：采用新鲜手指血，或者EDTA或肝素抗凝血进行测定，抗凝血在2-8度储存最长不超过72小时，冷冻在-20度或更低温度则可贮存更长时间。

测试当天使用样品处理液处理样品和检测。

四、试剂超敏全血C反应蛋白检测试剂盒(由深圳市国赛生物有限公司提供)。

五、仪器设备：Nephstar特定蛋白分析仪六、操作步骤1.开机，刷bCRP磁卡更新，核对试剂批号等信息2.取2ul全血标本加入预分装处理缓冲液的测量杯中，轻轻摇匀，并将测量杯放进仪器的测量孔3.屏幕显示“请加入试剂”4.取60ul抗血清加入测量杯中并同时按下反应启动键5.仪器自动进行检测七、注意事项：1.标本测试在全血模式下进行，质控测试在血清模式下进行。

2.确保仪器屏幕显示批号与试剂批号一致，批号不一致时请及时刷卡更新。

3.试剂从冰箱取出，需平衡至室温才可以进行测量。

4.加入抗血清后务必尽快按下“反应启动”键。

5.每天开机后稳定运行半个小时。

溶血时请充分摇匀至透明清亮方可以进行测试。

八、质量控制在检测每批样品时，最好同时做质控。

用试剂盒中所提供的质控血清，测试当天按1/41比例，使用样品处理液处理质控血清，同全血的检测方法进行检测。

检测结果在所标示的范围内都是有效的。

九、计算方法：十、生物参考区间〈5mg/L.十一、技术指标：测量范围：1mg/L-350mg/L精确性：2.36-3.02%十二、超出可报告范围的处理：十三、危急值：十四、干扰因素：（1）本试验不能用草酸盐、肝素或EDTA盐等作抗凝剂。

血清中蛋白提取方法一、前言血清蛋白是由肝脏合成的，主要分为白蛋白、球蛋白和纤维蛋白原等。

血清中的蛋白质含量较高，具有重要的生物学功能，因此对于从血清中提取蛋白质进行研究具有重要意义。

本文将介绍一种简单易行的血清中蛋白提取方法。

二、试验材料1. 血清样品：新鲜采集的小鼠全血经离心分离得到的血清样品；2. 洗涤缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH 7.4)；3. 裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS；4. 蛋白酶抑制剂：PMSF（Phenylmethylsulfonyl fluoride）；5. 离心管和离心机。

三、实验步骤1. 血清样品制备：（1）将采集到的小鼠全血放入无菌离心管中，在3000 rpm下离心15分钟，将上清液收集至新的无菌离心管中；（2）将上清液再次在12000 rpm下离心15分钟，将上清液收集至新的无菌离心管中。

2. 蛋白提取：（1）将收集到的血清样品加入洗涤缓冲液中，用旋转摇床摇晃30分钟；（2）将混合物在12000 rpm下离心20分钟，收集上清液；（3）将上清液加入裂解缓冲液中，在室温下震荡30分钟；（4）再次在12000 rpm下离心20分钟，收集上清液。

3. 蛋白质定量：使用BCA法或Lowry法测定蛋白质浓度。

四、注意事项1. 所有试验步骤均需在无菌条件下进行。

2. 在制备血清样品时应注意不要破坏红细胞，以免对后续实验产生干扰。

3. 在裂解缓冲液中加入PMSF可以有效地保护蛋白质不被降解。

4. 在实验过程中应注意安全，避免接触到有害物质和高速旋转设备。

五、总结本文介绍了一种简单易行的血清中蛋白提取方法，该方法操作简单、成本低廉、提取效果较好，适用于血清中蛋白质的提取和分析。

在实验过程中应注意无菌操作和安全防护，以保证实验顺利进行。

血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。

掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。

一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。

一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。

(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。

制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。

将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。

为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。

2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。

每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。

将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。

血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。

3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。

抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。

（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。

每毫升血液用1-2mg 即可。

配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。

全血提取总DNA实验步骤1. 取4 ml全血离心弃血清（已处理），将血球转移至15 ml离心管中，加入Buffer FG1至9 ml（血球过多可12 ml），上下颠倒混匀5次，2,500×g离心15分钟，缓慢弃上清。

2. 把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。

注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。

将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。

3. 按照附表配制缓冲液FG2与Proteinase K的混合液（比例100:1）。

注意：此混合液最好现用现配，并在配好后1h之内用完。

4. 加入1.5 ml Buffer FG2/Proteinase K混合液，立即混匀至溶液无团块。

注意：1）如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/Proteinase K混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品都加完后再震荡。

2）通常涡旋震荡3-4次，每次5秒可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入300 μlBufferFG2/Proteinase K混合液，再次涡旋混匀。

5. 65℃水浴锅中孵育5分钟，其间颠倒混匀数次。

注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。

水浴时间不能过长，防止DNA降解。

6. 加入1.5 ml异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至看到DNA，用玻璃吸管吸出沉淀置于1.5 ml 的EP管中。

注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。

如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下颠倒离心管20次确保沉淀完全。

7. 加入1.5 ml 70%乙醇，涡旋震荡5秒，2,500×g离心5分钟，弃上清。

注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或增大离心力。

8. 把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中，空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净（至少5分钟）。

注意：1）在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。

实验一、血液标本提取DNA（蛋白酶K-酚抽提法）一、实验原理离心分离到外周血的白细胞层；用细胞裂解液溶解细胞膜、核膜，使组蛋白与DNA分离，再用酚、三氯甲烷/异戊醇抽提去除蛋白质，最后经乙醇沉淀即可得到基因组DNA片段。

二、实验步骤：1、血液标本处理 1.0ml抗凝全血(ACD、EDTA抗凝均可)2000rpm离心10min（1.5mlEP管）。

轻轻去上清液（血浆），吸出淡黄色悬浮液（白细胞层）置于另一2.0mlEP管中。

（约50μl）2、细胞裂解加入10倍体积组织细胞裂解液，37℃1h，3、加入蛋白酶K消化加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml（约4μl），充分混匀，37℃震荡12-24h或37℃1h后，56℃水浴3h。

保温过程中不时摇动，混匀反应液。

液体逐渐变粘稠，表明已有DNA释放出来，操作应轻柔。

4、酚抽提：将上述溶液冷却至室温，加等体积的Tris饱和酚（pH8.0）溶液，温和缓慢颠倒离心管10min，混匀两相成乳液。

12000rpm 5分钟，两相分层。

用宽口径移液管小心吸出上层粘稠的水相，移至一新的2.0mlEP管中。

（小心一点，不要吸入蛋白层。

如交界处有白色沉淀，需重新抽提有机相，用酚重新抽提两次，合并水相）5、三氯甲烷/异戊醇抽提上清液加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，取上层水相0.5ml入另一新的2.0mlEP管；6、DNA沉淀上清液中加0.2倍体积3.0mol/L 醋酸钠，再加2倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔振摇，充分混匀；应可看到白色絮状物（DNA）。

12000rpm 5分钟，弃上清液；7、纯化：加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 离心5分钟，去上清夜，重复1次；（此过程不得振荡摇动）8、溶解：弃上清液后，自然干燥（挥发痕量乙醇）后，用30μl pH8.0TE完全溶解，保存在-20℃备用。

三、注意事项1、加样准确，操作轻柔；微量加样器绝对不能超过最大量程；2、加酚试剂时，不要接触到皮肤上，有腐蚀性；如不小心弄到，立即用清水冲洗；3、取上清液时，不可吸到下层溶液；4、加TE液后轻摇10min溶解DNA或-4˚C保存待用。

全血DNA提取步骤提取全血DNA是常见的分子生物学实验步骤之一，可以用于基因测序、PCR等一系列实验。

下面将详细介绍全血DNA提取的步骤，供参考：1.样本准备首先，需要准备采集血液的材料，如采血管、细胞裂解缓冲液、蛋白溶解缓冲液、蛋白酶K等。

此外，还需要一些实验所需的试剂和器材，如离心管、离心机、恒温器等。

确保仪器和试剂的清洁和消毒。

2.血液采集使用专业的血液采集器具，从被试者的静脉中采集血液样本。

建议使用EDTA抗凝管收集血液，以防止血液凝固。

3.预处理将采集的全血样本通过轻轻倾斜管子，使其混合均匀。

根据实验需要，可选择不同的预处理方式。

如果需要分离血浆或血细胞，可将全血离心，离心速度通常为1000-2000g，离心时间为15-20分钟。

4.细胞裂解将离心后的血细胞沉淀取出，加入适量的细胞裂解缓冲液。

裂解缓冲液的成分通常包括盐溶液、蛋白酶K、非离子型洗涤剂等。

裂解缓冲液的选择可根据实验的目的和所需的DNA纯度来确定。

将裂解缓冲液和血细胞沉淀充分混合，可使用移液器轻轻上下翻动。

5.DNA沉淀将混合好的血细胞裂解液加入离心管中。

在室温下离心10-15分钟，以除去细胞残渣和细胞膜的碎片。

离心完成后，将上清液转移到新的离心管中。

6.蛋白溶解将血细胞裂解液中的蛋白质通过加入蛋白溶解缓冲液沉淀下来。

蛋白溶解缓冲液通常包含盐溶液和蛋白酶K。

将蛋白溶解缓冲液加入上一步的上清液中，轻轻混合，并在室温下静置一段时间。

然后再次进行离心，使蛋白质沉淀到离心管的底部。

7.除去上清液将离心管取出，将上清液倒出，只保留蛋白质沉淀在离心管底部的沉淀。

8.水洗将离心管中的蛋白质沉淀用去离子水洗涤一次，以去除余留的盐溶液和杂质。

将去离子水加入离心管中，轻轻混合后离心，然后将上清液倒出。

9.DNA溶解将沉淀的蛋白质用适量的DNA溶解缓冲液重新溶解。

DNA溶解缓冲液通常包含盐溶液和螯合剂，以便稳定DNA的结构。

将DNA溶解缓冲液加入离心管中，轻轻混合使蛋白质沉淀溶解。

全血基因组DNA提取步骤1、冷冻全血室温化开。

（如时间紧可37℃化开，反复冻融有利于细胞破裂释放核酸）。

2、取1mL全血，加400μl灭菌蒸馏水，轻缓颠倒混匀5min。

（破碎红细胞）3、10000rpm，10min，可见底部沉淀，倒掉液体。

4、加1mL水，弹起沉淀，颠倒混匀5min。

（破碎红细胞）5、10000rpm，10min，倒掉液体。

（视情况而定，可再洗一次）6、依次加入500μl STE，25μl 10%SDS，10μl 10μg/mL 蛋白酶K。

弹起，颠倒混匀。

7、50℃水浴过夜，可加摇床。

（蛋白酶K的最适温度为55℃，资料上为3h，考虑到过夜时间较长，故降低温度）8、从水浴锅中取出，待降至室温。

9、加500μl Tris饱和酚，颠倒混匀10min。

10、12000rpm，10min。

从离心机取出时注意不要摇动离心管。

仔细将上清移入另一离心管，注意不要吸到中间蛋白层。

11、上清液中加500μl Tris饱和酚，颠倒混匀10min。

12000rpm，10min，取上清。

12、上清液中加500μl 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀10min。

12000rpm，10min，取上清。

13、上清液中加500μl 氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀10min。

12000rpm，10min，取上清。

14、加1mL冰冻无水乙醇，轻轻颠倒，可见白色絮状沉淀，用枪头挑入另一离心管。

若只见白色浑浊液体（无絮状沉淀），可加20μl 醋酸铵，轻轻颠倒混匀，液体可变清亮。

8000rpm，5min。

倒去液体。

15、加1mL 70%冰冻乙醇洗涤沉淀，8000rpm，5min。

倒去液体。

16、将离心管倒扣在滤纸上，晾干（需1h以上）。

17、加100μl TE，弹起，置4℃过夜溶解。

次日0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

DNA提取仔细看试剂盒说明书！使用前：1.在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇（加入量看瓶标签）2.若缓冲液GA或GB有沉淀，37℃水浴溶解，摇匀后使用简要步骤如下：1.冻存全血37℃快速融化，取200μL血液加20μL Proteinase K溶液，混匀。

2.加200μL缓冲液GB，颠倒混匀数次，70℃放置10min，溶液应变清亮，瞬时离心。

3.加200μL无水乙醇，振荡混匀15s，可能会有絮状沉淀，瞬时离心。

4.将所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3（吸附柱放入收集管），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

5.向CB3中加入500μL缓冲液GD（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

6.向CB3中加入600μL漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400g）离心30s，弃废液。

7.重复步骤6.8.将CB3放回收集管，12000rpm（~13400g）离心2min，弃废液。

将CB3置于室温放置数分钟，以挥发残留的乙醇。

9.将CB3转入一1.5mL Ep管，向吸附膜中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm（~13400g）离心2min，备用。

DNA/RNA浓度测定使用仪器：ND-1000使用方法：1.保持检测区域的清洁。

准备无RNA酶水，使用前润洗点样区1-2次。

2.打开软件，在点样区滴加1μL无RNA酶水，选择核酸种类（DNA/RNA），设置blank。

3.滴加1μL待测样本，记录浓度和纯度。

4.用纸巾擦去样品，再用无RNA酶水清洗1-2次。

5.关闭软件，关闭电脑，将机器盖上防尘布。

DNA PCR扩增反应体系：模板DNA 500ng10*buffer 2.5 μL25mM MgCl2 1.5 μL2.5mM dNTP 2μL10μM引物各0.4μLTaq酶0.25μL补水至25ul反应条件：95℃3min，（94℃30s，60℃30s，72℃30s），35个循环，72℃5minPCR产物2%琼脂糖凝胶电泳1.小胶（1/4）25mL ,中胶（1/2）50 mL ,大胶 100 mL。

全血提取试剂：1．2% EDTA：称取EDTA 2g，加入80ml蒸馏水，完全溶解后补足100ml，过滤除菌。

2．红细胞裂解液：NH4Cl 3.9g 终浓度0.144mlNH4CO30.4g 终浓度0.01mlEDTA 0.9g 终浓度5ml溶解于400ml蒸馏水，完全溶解后补足500ml，高压灭菌，4℃保存。

3．白细胞裂解液：Tris 0.6g 终浓度100mlEDTA 1.85g 终浓度0.5mlNacl 2.85g 终浓度5ml溶解于400ml蒸馏水，完全溶解后补足500ml，高压灭菌，4℃保存。

4．10% SDS：称取SDS 10g，80ml蒸馏水溶解后补足100ml。

5．蛋白酶K：100mg蛋白酶K溶解于10ml三蒸水，终浓度为10mg/ml，-20℃保存。

6．70%乙醇：70ml 95% 乙醇加蒸馏水至95ml。

★7．6mol Nacl：称取Nacl 135.1g，80ml蒸馏水溶解后补足100ml。

（这一溶液很难溶解，所以需要将Nacl一部分，一部分溶解。

）操作步骤：1．静脉血3 ~ 5ml，我们取5ml，枸橡酸钠抗凝。

2．离心2500rpm×10min，取血膜层。

（有的病人的白膜层很好吸！）3．加入红细胞裂解液10ml，放置＞20min，每十分钟摇匀一次。

离心1000rpm×10min，弃上清。

*重复步骤3 一次，放置时间＜20min。

4．加入白细胞裂解液3ml，充分混匀。

5．加入10% SDS 200ml，混匀。

6．加入蛋白酶K（10mg/ml）150ml，混匀。

7．放37℃O.N。

全血dna提取原理
全血DNA提取是一种常用的实验技术，旨在从人体全血样本
中分离纯净的DNA。

全血DNA提取的原理主要包括以下几
个步骤。

首先，将全血样本进行离心，以分离血液中的红血细胞（RBCs）、白血细胞（WBCs）和血小板。

离心后，上清液
中含有RBCs和WBCs混合的细胞组分。

其次，采用红细胞裂解缓冲液，使RBCs在牺牲细胞膜完整性
的同时释放出细胞内的血红素。

血红素会结合到缓冲液中的成分上，从而不会对后续DNA提取步骤产生干扰。

然后，WBCs的核酸膜被洗涤和蛋白酶降解，以去除表面的蛋
白质和杂质。

随后，用组织裂解缓冲液处理细胞，以破坏细胞膜结构，释放出细胞内的DNA。

为了去除细胞膜碎片、蛋白质和其他杂质，可通过离心将细胞碎片沉淀下来，上清液则富含DNA分子。

将上清液用等体积
的冰冷异丙醇（isopropanol）沉淀DNA，使其从溶液中析出。

最后，用乙醇洗涤沉淀得到的DNA，以去除残留的盐和其他
重组浓度和纯度的DNA样本。

最终，通过在适当的缓冲液中
重新溶解DNA，即可获得纯净的全血DNA样品。

全血DNA提取的过程中需要注意使用无菌操作和一些酶解、
洗涤等步骤，以确保提取出的DNA样品纯度高、浓度适当，并且不受外界污染影响。

血红蛋白提取和分离的四步血红蛋白是存在于人类血液中的一种重要蛋白质，它承担着将氧气从肺部输送到身体各个组织和器官的重要功能。

因此，对血红蛋白的提取和分离具有重要的生物学意义和医学应用前景。

接下来将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。

第一步：血样采集首先需要采集含有血红蛋白的血样。

一般来说，静脉采血是最常用的方法。

在采集血样之前，需要确保采血器具干净无菌，以避免外部微生物的污染。

同时，还要确保采集到的血样足够新鲜，以保证血红蛋白的活性和稳定性。

第二步：红细胞裂解将采集到的血样进行红细胞裂解，将红细胞膜破坏，释放血红蛋白。

一般可以使用生理盐水等溶液进行红细胞裂解。

在裂解的过程中，需要注意温度和pH值的控制，以确保血红蛋白的完整性和稳定性。

第三步：血红蛋白提取在红细胞裂解后，血液中的血红蛋白被释放出来，需要进行进一步的提取。

常用的提取方法包括离心、凝胶过滤、离子交换层析等。

通过这些方法，可以将血红蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来，得到比较纯净的血红蛋白样品。

第四步：血红蛋白分离最后一步是对提取到的血红蛋白进行分离。

根据血红蛋白的性质和不同的应用需求，可以选择不同的分离方法。

例如，可以利用凝胶电泳、高效液相色谱等技术对血红蛋白进行分离和纯化。

通过这些方法，可以得到高纯度的血红蛋白样品，为后续的研究和应用提供基础。

通过以上四个步骤，我们可以完成血红蛋白的提取和分离工作。

这些工作不仅有助于深入了解血红蛋白的生物学功能和结构特性，还为相关疾病的诊断和治疗提供了重要的基础。

希望在未来的研究中，可以进一步完善血红蛋白提取和分离的技术，为人类健康事业做出更大的贡献。

人血XX （低温乙醇法）制造及检定规程本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆或血清经低温乙醇法分离提取，经60C 10小时加温灭活病毒后制成。

白蛋白含量96%以上，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素，专供静脉输注。

主要用于治疗创伤性、出血性休克、严重烧伤以及低蛋白血症等。

1 制造1.1 制造要求1.1.1 新鲜分离的液体血浆、过期血分离的血浆、半成品、成品检定剩余血浆、轻度溶血或脂肪血浆、去除其他血浆蛋白的组分，均可用于制备。

所用之血浆或血清的来源应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》。

1.1.2 血浆或血清应尽可能保持无菌，否则应及时投料制造或低温冰冻保存。

低温冰冻保存血浆量长保存期不应超过 2 年。

1.1.3 制造工作室应符合工艺流程。

冷库及各种生产用具必须专用，严禁与其他异种蛋白质混用。

制造工作室的建筑应便于清洁、消毒、防霉。

在制造过程中为防止制品污染热原质，应采取各种有效措施，如降低操作室温度，注意无菌操作等。

各种直接接触制品的用具，用后应立即洗净，用前须经除热原质或灭菌处理。

1.1.4 生产用水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。

所用各种化学药品应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》规定，未纳入试行标准者应不低于化学纯。

1.2 制造工艺1.2.1采用低温乙醇法。

应含适量的稳定剂（每g蛋白质用0.16mmol辛酸钠或0.08mmol 辛酸钠和0.08mmol 乙酰色氨酸钠）。

1.2.2热处理每批制品必须经60± 0.&加温10小时处理。

热处理可在除菌过滤前或分装后24 小时内进行。

1.2.3 分批同一制造工艺、同一容器混合的制品作为一批。

不同滤器除菌过滤或不同机柜冻干的制品应分为亚批。

1.2.4 半成品检定液体制剂于除菌过滤后应做理化检查（残余乙醇含量< 0.03%及热原质试验，并应按亚批抽样做无菌试验。

直接分装时应留样做上述试验。

1.2.5 冻干除菌过滤后制品应及时分装、旋冻、冻干。

全血分离获得血清的方法及步骤材料与方法1.1 血清采集MG患者全血来自2004～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。

根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。

正常人血清取自同时期健康志愿者。

-70 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 主要试剂固相pH梯度干胶条IPG strip（Amersham公司产品，非线性pH 3～10，7 cm）。

3-〔3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸盐｛3-〔（3-cholamidopropyl）dimethylamino〕-1-propanesul-fonate，CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），三丁基膦（tributyl phosphine，TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N，N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetram-ethyl-ethylenediamine，TEMED），过硫酰胺（am-monium persulfate，APS），三羟甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl）aminomethane〕、甘氨酸（glycine，Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）均为Bio-Rad公司产品。

琼脂糖为华美生物公司产品。

其他试剂均使用国产分析纯试剂。

所有溶液均用MilliQ水配制。

1.3 主要仪器高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司产品;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQ Deca XP Plus，美国Thermo Finnigan公司产品。

实验四血红蛋白的提取1、血红蛋白的制备：取新鲜抗凝全血5ml（可先将柠檬酸三钠用水溶解后再取鸭血），于2000r/min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的0.9﹪Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。

离心弃去上清液，重复1～2次，至上清液清完为止。

于血球中加入10倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，以棉花过滤，即得血红蛋白溶液。

仪器及试剂：离心管（4.2×10 ，10支）试剂瓶（500ml 2支；250ml 2支） Nacl（1瓶）柠檬酸钠（1瓶）2、溴酚蓝溶液的制备（1mg/ml）:称25mg溴酚蓝溶于25ml蒸馏水中即可。

仪器及试剂：溴酚蓝（1瓶）滴瓶（5个 50ml）3、洗脱瓶：用锥形瓶（下有开口）作洗脱瓶。

仪器及试剂：锥形瓶量筒（10ml 50ml）4、洗脱液：称46.4g，溶于4000ml，即得0.2mol/L Nacl溶液。

仪器及试剂：烧杯电子天平容量瓶玻璃棒操作步骤：1、凝胶溶胀置蒸馏水中于室温下溶胀3h，沸水浴1h再用蒸馏水洗涤几次，再次将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速）。

洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。

【G-75以下称硬胶；G-75以上的称软胶（吸水量大，膨胀形态柔软易变）；G25:吸水量为2.5ml/g； G10-50:分离肽及脱盐；G75-200：各类蛋白质，全渗透。

葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。

商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小】2、装柱采用脱盐柱，即将无机盐或其他物质（溴酚蓝）与大分子物质（血红蛋白）分离。

A,将层析柱垂直固定在铁架台上，打开柱下口开关。

将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等；B,用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内，此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱；C,当到达所需凝胶高度时（约17ml），立即关闭下口，使凝胶完全沉降；D,凝胶柱上始终覆盖一层溶液，凝好后用洗脱液流过。

血红蛋白的制备（一）、缓冲溶液1.定义把能抵抗外加少量强酸或强碱，而维持pH基本不发生变化的溶液称为缓冲溶液。

缓冲溶液所具有的抵抗外加少量强酸或强碱的作用称为缓冲作用。

多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。

在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们是蛋白质缓冲系统、重碳酸盐缓冲系统以及磷酸盐缓冲系统。

每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。

在生化研究工作中，常常需要使用缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。

研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到研究工作的成效。

如果“提取酶”实验体系的pH值变动或大幅度变动，酶活性就会下降甚至完全丧失。

所以配制缓冲溶液是一个不可或缺的关键步骤。

2.组成较浓的强酸和强碱也有缓冲作用，但由于这类物质酸性或碱性过强，所以很少作为缓冲溶液使用，一般使用的缓冲溶液是由足够浓度和适当比例的共轭酸碱对所组成。

习惯上把组成缓冲溶液的共轭酸碱对称为缓冲对，缓冲溶液是由足够浓度的缓冲对组成的混合溶液。

缓冲溶液之所以具有缓冲作用，是因为溶液中同时存在足量的共轭酸碱对，它们能够抵抗外加的少量强酸或强碱，从而保持溶液的pH基本不变。

如果加入大量的强酸或强碱，缓冲溶液中的抗酸成分或抗碱成分将耗尽，缓冲溶液就丧失了缓冲能力。

3.缓冲溶液的配制通常由1-2种缓冲剂溶液于水中制成的，调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同的PH范围内使用的缓冲液。

人体血液中的缓冲液有①弱酸和弱酸盐组合NaH2PO4/Na2HPO4和②多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐H2CO3/ NaHCO3。

在血红蛋白的检测中用的是磷酸缓冲液。

磷酸缓冲液配制方法：NaH2PO4•2H2O：10.86105g（或NaHPO4•12H2O：21.8502g）+ NaH2PO4•2H2O：6.08595g（或NaH2PO4•H2O：10.76g），溶解，定容至1L。

上述药品都是极易溶的，直接溶解就行了4.作用：能够抵制外界的酸与碱的对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。

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