转录组测序RNA-seq技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生

转录组测序结题报告转录组测序结题报告篇一：转录组测序问题集锦转录组测序问题集锦转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合，转录组测序(RNA-seq) 是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录分析的方法,可以对全转录组进行系统的研究。

Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以对转录组进行测序，Roche GS FLX Titanium与Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4相比，拥有更长的读长和较小的数据量，适用于表达量较高基因的RNA全长测序。

但是对低表达丰度的基因，可能需要多次测序才能得到足够的数据，成本比较高，而Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4数据读取量大，能够得到较高的覆盖率，可以较好的降低成本。

若是位置基因组序列的物种，则Roche GS FLX Titanium测序更有优势，其较长的读长便于拼接，获得更好的转录本数据。

转录组测序可以供研究者在转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、miRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现等方面进行深入研究。

研究转录组的方法有哪些？目前研究转录组的方法主要三种，基于杂交技术的cDNA 芯片和寡聚核苷酸芯片，基于sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression)、LongSAGE和MPSS(massively parallel signature sequencing)，基于第二代测序技术的转录组测序，又称为RNA-Seq。

转录组测序比其他研究方法有哪些优势?（1）可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题；（2）灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本；（3）可以对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并准确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。

转录组测序技术转录组测序技术（Transcriptome sequencing technology）是研究基因表达的一种高通量测序技术，用于分析特定时间点或特定条件下细胞、组织或生物体内的所有转录本的整体集合，即转录组。

通过转录组测序，可以研究基因的表达模式、发现新的转录本、检测外显子变异、研究RNA修饰等。

转录组测序技术主要有以下几种：1. RNA-Seq: RNA-Seq是目前最常用的转录组测序技术，它能够以高通量、高灵敏度和高分辨率分析细胞中全部转录本的表达情况。

RNA-Seq首先将RNA提取、逆转录为cDNA，然后通过高通量测序仪对cDNA进行测序，最后根据测序结果分析基因的表达水平和异质性剪接等信息。

2. 3'end sequencing: 3'end测序是一种用于定量研究基因表达的测序技术。

它通过选择转录本的3'末端序列进行测序，可以快速获得RNA的5'端信息，并通过对测序数据的分析揭示基因的表达水平。

3. Full-length transcript sequencing: 全长转录本测序技术是一种能够获得完整转录本序列的测序方法。

与传统的RNA-Seq只能得到部分转录本序列不同，全长转录本测序技术可以通过直接测序RNA分子的全长来研究转录组。

4. Small RNA sequencing: 小RNA测序是用于研究微小RNA （miRNA）和其他小的非编码RNA的测序技术。

小RNA测序可以帮助研究人们了解miRNA的表达和调控机制，以及它们在多种生物学过程中的功能。

转录组测序技术在生物学、医学和农学等领域有着广泛的应用，可以帮助研究者深入理解基因表达调控、发现新的基因、研究疾病发生机制等。

基于生物信息学方法的小鼠精子发生关键基因筛选李欣1，田佳2，脱征军2，邵怀峰2，张伟新2，李委奇2，王琨2，徐寒2，温万2*（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.宁夏畜牧工作站，宁夏银川 750105）摘 要：为探索精子发生的分子机制，寻找精子变形期间的关键基因，本研究从公共基因表达数据库下载小鼠精细胞的转录组测序数据，利用R软件Ballgown程序包筛选差异表达基因，并对差异表达基因进行Gene ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析后，再对筛选出的关键基因进行分析。

结果显示：筛选出8个相关性较强的关键通路，将其所包含的基因进行FPKM值从大到小排序，取前18名的基因进行功能分析。

其中，Txnrd3和Tcp1与繁殖活动相关；Gpx4、Dkkl1、Dbil5与发育相关；Prm2、Selenof、Tnp1、Tnp2、Ropn1l、Pafah1b2、Spink2和Prm1等8个基因参与精子发生；Spa17、Ldhc、Hsp90aa1、Gstm5和Csnk2b参与鞭毛和纤毛的形成。

以上基因对精子发生具有重要作用，深入发掘这些基因的功能特点可为进一步揭示精子变形机制提供理论依据。

关键词：精子发生；生物信息学分析；差异基因中图分类号：Q811.4 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200410-06转录组是某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA总和，通过对不同样本的转录组差异研究，不仅可以了解特定时间和空间条件下疾病的发生发展状态，也能作为研究疾病诊断和预后标志物的重要研究手段[1]。

目前，RNA-seq已经成为转录组研究中最为常见的手段，来自不同动物的多个器官的大量RNA-seq 数据集陆续出现[1-2]，这些数据保存于NCBI数据库中。

精原细胞处于雄性生殖细胞的早期发育阶段，能不断进行有丝分裂，分化为精母细胞。

基因差异表达分析方法及其在作物遗传育种中的应用苏在兴高闰飞李强【摘要】植物基因的差异表达是细胞形态和功能多样性的根本原因,也是各种生理及病变过程的物质基础.分析基因差异表达是近30年来分子生物学研究的重点,研究方法也从最早的差减杂交、差异显示PCR和cDNA代表性差异分析等,不断地发展到基于测序的表达系列标签和转录组测序技术,其中高通量测序技术的应用,使得分子生物学进入后基因组时代,特别是转录组测序可高效率、大批量地获取差异表达基因.通过基因差异表达分析,可挖掘农作物的优异农艺性状、高品质、抗性以及杂种优势等相关基因,辅助常规育种,提高农作物的品质、产量、抗性等综合性状,并为探究其机理、机制奠定基础.【期刊名称】《江苏师范大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2017(035)001【总页数】8页(P38-45)【关键词】基因差异表达;转录组测序;农艺性状;品质性状;抗性;杂种优势【作者】苏在兴高闰飞李强【作者单位】[1]江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业部甘薯生物学与遗传育种重点实验室,江苏徐州221131;[2]中国农业科学院甘薯研究所,江苏徐州221131;[3]江苏师范大学生命科学学院,江苏徐州221116【正文语种】中文【中图分类】Q786植物基因差异表达是在转录水平上对基因的表达情况进行研究,包括2个及2个以上材料之间存在差异基因或者差异基因在相同环境条件下具有不同的表达模式,以及同一材料在不同处理下,同一基因呈现不同的表达模式2种情况．在真核生物基因组中,仅约10%～15%的基因在细胞中表达,而且在不同发育阶段、不同生理状态和不同类型的细胞中基因表达也不同[1]．基因的差异性表达是细胞形态及功能多样性的根本原因,也是植物生长发育和各种生理及病变的物质基础[2]．通过基因差异表达,分离新的功能基因、挖掘和鉴定差异表达基因的新功能等,对作物遗传改良具有十分重要的意义．目前,分子生物学技术逐步应用到作物遗传育种中,分子标记辅助育种、转基因育种以及分子设计育种正在成为作物遗传改良的重要手段[3]．1990年代开始,基因差异表达分析方法逐渐得到发展[4-12],并在挖掘新的功能基因以及揭示基因的新功能方面表现出优势．随着研究的深入,对差异性表达基因的富集程度要求更高,从而促使基因差异表达的筛选方法不断得以丰富和改进,尤其是测序技术的发展,使得差异表达基因的获得更加便捷,数量更多,效率更高[13]．本实验室也采用基因差异表达分析技术,解析徐薯18和徐781 2个甘薯品种在新陈代谢、抗逆性和碳水化合物积累等方面的机理机制,已获得一批与新陈代谢、抗逆性、物质积累等相关的功能基因．本文简要综述不同基因差异表达分析方法的特点、原理及优缺点,进一步阐述基因差异表达分析技术在作物农艺性状分析、品质性状分析、抗性分析以及杂种优势分析等方面的应用,以期对后续的研究工作有所裨益．1.1 基因差异表达分析方法1.1.1 差减杂交(subtractive hybridization,SH) 最初由Lamar等[4]于1984年报道,用于分离老鼠Y染色体的特异性探针．该方法也叫扣除杂交或减法杂交．差减杂交是对2种遗传背景大致相同而性状有差异的材料进行研究,基因组DNA或者mRNA(反转录成cDNA)经特定的核酸限制性内切酶消化后,在一定的条件下进行分子杂交,选择性地去除2部分共有基因杂交后形成的复合物,将含有目的基因的未杂交部分收集后装入载体,从而构建差减文库．佘卫炜等[14]用该方法成功地分离到6条与藏红花苷合成相关的特异性表达cDNA片段．该方法克服了示差筛选技术的局限性,灵敏度较高,也能有效检测转录丰度低的基因[15]，但操作难度大,费时费力,重复性较差,并且在酶切不彻底等情况下很难得到满意的结果[16]．1.1.2 mRNA差异显示逆转录PCR(differential display of reverse transcriptional PCR，DDRT-PCR) 1992年，Liang等[5]根据高等生物成熟的mRNA具有poly(A)尾巴的特性,建立了mRNA差异显示逆转录PCR．该方法利用含Oligo(dT)n的寡聚核苷酸作为锚定引物,通过逆转录酶的催化,将真核生物细胞中全部表达的mRNA逆转录为cDNA,通过PCR扩增,利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将有差异的片段分开,从而筛选出差异表达基因．张弛等[17]利用该方法研究水稻77-170(Oryza Sativa var. Japoinca)及其耐盐突变体M-20在盐胁迫下基因表达的差异,克隆到13个与盐诱导相关的cDNA片段,其长度范围在200～600 bp 之间．该方法具有技术应用成熟、效率高、灵敏度高的优点,实验每一步均可检测,无需实验结束，但假阳性率高,最高达70%,所得的cDNA片段较短,很难扩增到ORF(open reading frame)内部[18-19]．1.1.3 cDNA代表性差异分析(cDNA-RDA) 在Lisitsyn等[20]建立的DNA代表性差异分析(representational difference analysis,RDA)方法的基础上,1994年,Hubank等[6]建立了cDNA代表性差异分析技术．该技术对2组材料的cDNA 进行酶切消化,并为酶切片段连接特异寡聚核苷酸接头，进行PCR扩增,分别获得实验组(T)和对照组(D)的扩增子．再次酶切2组扩增子并对T组扩增子添加新接头,然后将T组扩增子与富余的D组扩增子混合,形成杂交体,用与新接头互补的特异引物对杂交体进行PCR扩增,其中T/T杂交体进行指数扩增,T/D杂交体进行线性扩增,D/D杂交体不扩增．对差异产物进行多轮PCR后,可用普通琼脂糖凝胶检测差异表达条带[21-22]．Ling等[23]将该技术运用于分离大豆不同萌发期子叶中的差异表达基因,并成功克隆到CysP1和CysP2 2个编码半胱氨酸蛋白酶的新基因．1.1.4 表达系列标签(serial analysis of gene expression,SAGE) 1995年,Velculescua等[7]首先提出基因表达系列分析技术,该方法通过限制性酶切含有生物素标记的cDNA,产生能够代表其相应转录物的cDNA短标签(9～14 bp),然后随机连接并进行测序分析．单一转录体由其特异性的短标签所代替,用SAGE软件定量分析标签的丰度,代表转录体的表达水平．Song等[24]采用SAGE法分析超级杂交稻LYP9及其亲本93-11、PA64s在不同时期、不同组织部位的差异表达基因,获得12种主要的基因表达模式,其中406个基因上调表达,469个基因下调表达,这些基因可能与水稻的杂种优势有关．该方法可以将多个短标签串联测序,能够寻找低丰度的转录物,但其依赖已测序的基因序列,过短的序列标签所涵盖的信息无法被准确注释到基因组上[25-26]．1.1.5 抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH) 1996年，Diatchenko等[8]提出抑制差减杂交,也叫抑制性消减杂交,结合了抑制PCR和差减杂交技术,利用抑制性PCR，选择性地扩增目的cDNA片段,显著增加了低丰度差异表达cDNA获得的概率．Tirumalaraju等[27]应用SSH技术从抗花生根结线虫和感花生根结线虫2份材料中获得70个差异表达ESTs,并证实各种非生物、生物(含根结线虫)胁迫和植物应答此类胁迫时与水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及乙烯信号传导之间的关系．这些差异表达候选基因为获得抗根结线虫种质资源并培育优良抗性花生新品种提供可能．该方法简单、成熟、易操作,且效率高,筛选周期短,通常3～4 d可获得基因差异表达片段．但是SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA,不是全长cDNA;材料之间最好是存在细微差异,小片段缺失时也不能有效检测;实验中酶切后的cDNA与接头连接的效率是该方法的关键,若连接效率低,有些差异表达的基因就会漏检[18]．1.1.6 cDNA限制性片段长度多态性分析(cDNA-AFLP) 在Botstein等[28]建立的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法的基础上,1995年,Vos等[29]结合PCR扩增提出一种新的DNA指纹技术,即扩增片段长度多态性(amplification fragment length polymorphism,AFLP)．1996年,Bachem等[9]结合RT-PCR和AFLP提出cDNA-AFLP技术,用于对转录组表达情况进行分析．该技术采用2种不同的内切酶切割cDNA片段,并添加含有与引物序列互补的人工接头,进行PCR预扩增后用聚丙烯酰胺凝胶区分差异条带．Nie等[30]运用cDNA-AFLP技术从玉米亲本和杂交种的叶、根和成熟胚中分别分离到180、170和108个差异表达基因,为揭示玉米杂种优势提供了线索．cDNA-AFLP 技术具有很好的重复性,假阳性比较低,不需要预先知道基因的序列信息,能够通过扩增条带显色强度判断基因表达量的差异[31]．1.1.7 基因芯片(DNA Chips)技术是指把大量核酸片段固定在载体上,组成密集的按序排列的探针群,通过与标记样品的核酸杂交,判断靶核苷酸的有无或数量多少的一项技术,主要包括芯片的制备、杂交与检测等3个步骤．常见的芯片可分为2大类：一种是原位合成,适用于寡核苷酸;另一种是直接点样,多用于大片段DNA．姜兆远等[32]将Affymetrix表达谱芯片运用于水稻与稻瘟病不同小种的互作研究,水稻与稻瘟病菌非亲和互作的基因表达谱及其亲和互作的基因表达谱之间存在较大差异,将基因芯片筛选到的差异表达基因通过GO注释,明确了差异基因的分子功能及信号通路,有利于进一步了解植物抗病机制,并可能为稻瘟病防治提供新的途径．该方法同时将大量的探针固定于支持物上,可以同时对大量序列进行检测,克服了传统的核酸印迹杂交操作复杂、自动化程度低，且检测序列数量少等缺点．但该方法所用仪器及软件价格较昂贵,探针的合成和固定比较复杂,难以检测低丰度表达的基因[33]．1.1.8 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR 半定量逆转录多聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)是探究基因差异表达的有效手段之一[10]．采用PCR技术同时对2组或多组材料的目的基因和内参基因(internal reference genes)进行扩增,运用琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，并调节内参基因条带强度一致,便可直观地呈现出目的基因在不同组织或者不同材料中是否表达，且能对比其表达丰度[11，34]．1993年,Higuchi等[35]根据PCR延伸阶段随着DNA双链的生成,含有荧光的EB(ethidium bromide)染料能嵌入DNA链内部而激发荧光,提出实时荧光定量PCR(real time quantitative RT-PCR，qRT-PCR)的概念．荧光定量PCR具有很好的特异性,重复性好,操作简单快捷,全反应过程在一个封闭的PCR管中进行,可以实时地进行监测,而且扩增结束后不需要进一步处理．Applied Biosystems、Bio-RAd等公司推出实时荧光定量PCR配套的仪器和试剂,使得该技术在研究基因表达方面逐渐成为主流手段[36]． Fu等[37]采用SSH法从3份水稻材料中获得一批抗旱相关的基因,并用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR对300多条特异条带进行确证,为完善水稻抗旱相关QTLs及获得候选功能基因奠定基础．1.1.9 转录组测序(RNA-Seq)技术转录组(transcriptome),广义上指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和,主要包括信使RNA(message RNA，mRNA)、核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)、转运RNA(transport RNA，tRNA)和非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)．狭义上,一般指特定组织或细胞中转录的全部mRNA[25]．转录组测序就是利用高通量技术对转录组进行测序分析,并对获得的读段进行过滤、组装以及生物信息学分析．RNA-Seq需要将mRNA反转录成cDNA,并对合成的cDNA作末端修复、加poly(A)尾巴及连接测序接头,片段化为测序平台所需的长度,PCR扩增,构建测序文库,利用相应的测序平台进行序列测定．对于有参考基因组序列的物种,可根据其参考序列(reference assembly)组装,没有参考基因组序列的物种,则进行从头组装(denovo assembly)[12,38]．根据组装情况,以单位长度的转录物上覆盖的读段数来衡量基因的表达水平(reads per kilo bases per million reads,RPKM)．RNA-Seq 主要用于研究2个及以上样本中基因的差异表达情况,如正常条件下的棉花幼苗和盐胁迫下的棉花幼苗等[39]．转录组测序技术具有较高的灵敏度,可以同时获得组织内的全部转录本;能检测出SNP等单个核苷酸的差异,具有很高的精确度;通过组装分析能得出基因家族中的不同拷贝或可变剪接．随着测序仪器的升级,RNA-Seq 费用逐渐下降，除了从测序数据中挖掘差异表达基因外,还可以挖掘SSR、SNP信息以及组装出尽可能完整的Unigenes序列,为后续的基因克隆和功能验证奠定坚实基础[40-45]．1.1.10 基因编辑技术近年来,锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、类转录激活样效应核酸酶(artificial transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和CRISPR-Cas9等[46]基因编辑技术(gene editing)逐步发展并得到广泛应用．基因编辑技术能在基因组水平上对DNA序列进行剪辑或插入,从而导致目的基因的表达受到抑制或表达产物失去相应的功能．Piffanelli等[47]发现,在与小麦亲缘关系较近的大麦中,MLO基因功能的缺失突变使其对白粉病产生广谱和持久的抗性．Wang等[48]采用TALEN和CRISPR-Cas9技术对小麦MLO基因进行编辑,已经获得具有广谱抗白粉病的小麦材料．Qi等[49]结合qRT-PCR检测NgAgo酶与不同引导序列组合作用下目标基因fabp11a的差异表达情况,表明NgAgo技术在降低基因表达水平方面表现出优异的特性．1.2 基因差异表达方法的特点比较SH、DDRT-PCR、cDNA-RDA等方法都是研究基因差异表达的有效工具(表1),其中SAGE、cDNA-AFLP等5种技术能检测出差异表达基因的表达丰度,而其他4种方法则不能;除SH外,其他基因差异表达分析方法均基于PCR技术．应用DDRT-PCR时,结合PCR扩增,可检测出低丰度的mRNA样品,而cDNA-RDA、SSH和cDNA-AFLP等需要经过2～3次PCR扩增,高度富集差异表达基因,保证有较高的特异性,减少假阳性率;SH、cDNA-RDA和SSH技术需要在2个材料之间进行杂交,故仅能检测2组mRNA的差异表达,其他方法可以同时比较多组材料;SAGE 和RNA-seq需要结合测序以及相应软件分析,才能获取差异表达片段以及各自的表达量,其他技术则通过扩增或杂交即可;DNA Chips和RT-PCR/qRT-PCR分别在设计杂交探针和扩增引物时需要预先知道基因序列信息,其他方法均不需要[8,11,28]．2.1 挖掘重要农艺性状相关基因农艺性状是指农作物的株高、生育期、育性及产量等可以代表作物特点的重要因子,是作物育种重要考察指标．Firon等[41]通过分析甘薯起始膨大根(initiating storage roots，ISRs)和纤维根(fibrous roots，FRs)的转录组信息,发现至少2.5倍的表达差异短片段8 353个,采用qRT-PCR法对其中Sporamin、AGPase和GBSS1等9个基因进行检测,表明这些差异表达基因参与碳水化合物的代谢和淀粉合成,促使储藏根的形成．Tao等[43]利用Illumina paired-end(PE)转录组测序技术,结合重头组装策略对甘薯7个不同组织的转录组进行分析,为甘薯组织特异表达基因和非生物逆境基因的研究奠定基础．程立宝等[50]对莲藕进行转录组测序分析,发现86个可能与莲藕根茎膨大相关基因,得到10 个贮藏蛋白合成和5 个淀粉合成相关基因,其中Lrplp8和Lrgbss对莲藕根状茎的膨大起到重要作用．育性是有性繁殖作物重要的农艺性状．雄性不育性的发现及三系配套育种、光温不育等概念的提出及成功运用,为新品种的培育和推广带来了极大的方便[51]．黄鹂等[52]利用拟南芥ATH1基因芯片与3种不同类型的白菜不育系及其共同保持系的花蕾的mRNA进行杂交,发现各不育系与保持系的花蕾中基因表达存在巨大差异,不同类型不育系之间花蕾转录组的组成特征也有差异．由于3种不育系与保持系花蕾的差异仅表现在花粉的形成和绒毡层的发育上,而其他花器官均无差别,从而推断这些差异表达的基因可能与花粉花药的发育有关．刘冬梅等[53]用陆地棉洞A 的不育株和可育株小孢子单核早期花药进行转录组测序,获得51个激素相关差异表达基因,首次分析小孢子时期激素相关基因在转录组水平上的差异,并对其中2个关键基因进行验证,为深入研究陆地棉洞A的不育机理和挖掘关键基因奠定了基础．2.2 挖掘重要品质性状相关基因随着农作物新品种的更迭以及栽培技术的革新,我国的粮食产量已达到比较理想的水平,人均收入逐步提高的同时,人们的食物消费开始转向有营养、益健康且口感佳的方向,所以对农产品的外观品质和营养品质等要求更高．外观品质是农产品商品价值的重要指标,如水稻种子灌浆不充分、胚乳中的淀粉粒等营养物质排列疏松导致垩白,影响稻米的外观品质[54]．Chen等[55]采用RNA-Seq法,在垩白率及胚乳垩白度均低的籼稻品种PYZX和垩白率及胚乳垩白度均高的粳稻品种P02428中发现5 552个差异表达基因,与PYZX相比,P02428中表达量较高的基因有3 603个,较低的基因1 949个;而与2亲本的高垩白重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)混样相比,低垩白RIL混样中有88个基因表达量较高,623个基因表达量较低,从中分析确定33个可能与垩白相关的候选差异表达基因,为后续的基因功能验证和育种应用奠定了基础．营养品质包括淀粉及可溶糖等碳水化合物、蛋白质、脂肪酸等,不同加工用途对营养成分的要求不尽相同[56]．小麦、甘薯等是重要的淀粉类作物,利用基因差异表达技术分析淀粉合成相关的基因,对育种研究至关重要．小麦材料CB037A具有A 型(直径>10 μm)、B型(直径5～10 μm)和C型(直径<5 μm)3种淀粉粒,而PI330483仅有A型淀粉粒,Cao等[57]采用qRT-PCR法对这2份小麦材料的淀粉粒大小与AGPase大亚基、AGPase小亚基、SSⅠ、SSⅡa和SBEⅠ等淀粉合成相关基因的表达模式进行研究,发现SBEⅡa、SBEⅡb、WaxyD1和AGPase大亚基基因在2份材料中呈截然不同的表达模式．2.3 挖掘耐逆相关基因全球气候逐渐恶化,极端天气逐渐增多,其中干旱是非常普遍的现象,正考验着农业生产．Li等[58]利用基因芯片对玉米抗旱相关小RNA的基因差异表达进行分析,得到miR156、miR159、miR319等3个与抗旱相关的家族基因．Deng等[59]用差异表达的方法从耐旱玉米品系中分离到4个差异表达cDNA片段,并用实时荧光定量PCR分析这4个基因在干旱胁迫下的6个玉米近交系中的表达模式,证实候选基因在耐旱品系中呈上调表达,而在干旱敏感品系则相反．现代农业的投入逐渐加大,而农药、除草剂、化肥以及工业废弃物等各种形式的土地污染严重影响我国的粮食和其他经济作物的产出,植物功能基因的差异表达使其能最大限度地耐受逆境胁迫．Gao等[60]通过转录组测序技术获得紫花地丁镉处理与非镉处理条件下892个差异表达基因,且随机选取15个DEGs进行qRT-PCR 结果验证,为进一步研究其耐镉胁迫机制提供遗传学基础．印莉萍等[61]比较正常供铁和缺铁胁迫下铁高效型小麦(京-411)和铁低效型小麦(三属麦-3)的基因表达差异模式,获得ATP结合转运体(ATP binding cassette,ABC)的cDNA片段并进行Northern杂交,证明它的基因表达受缺铁胁迫的抑制．Kato等[62]利用基因芯片分析硝酸铵诱导下拟南芥和水稻中eIF6(eukaryotic translation initiation factor 6)基因的差异表达,发现该基因在这2种植物中呈现出不同的表达模式,表明eIF6基因在不同的物种中具有表达特异性．除了非生物胁迫外,病虫害等生物胁迫也给农业生产造成巨大的损失,所以挖掘生物胁迫应答基因，辅助选育抗病虫新品种,能有效地缓减农药的使用,增加农民收入和提高生产效率．Evers等[63]以抗马铃薯晚疫病品系Solanum phureja和感晚疫病双单倍体S. tuberosum subsp. tuberosum为材料,用差异显示mRNA法,获得与抗病性、胁迫应答、初级新陈代谢和次级新陈代谢相关的基因．2.4 挖掘与作物杂种优势相关的基因作物杂种优势是杂种后代在表型上优于亲本的现象,涉及作物病虫抗性、高产、高油以及高蛋白等多个方面．杂种优势在自然界比较普遍,但对其具体机理却知之甚少．近年来研究者试图运用基因差异表达技术揭示杂种优势的成因,并取得一定的进展．Zhao等[64]用棉花杂交种及其亲本进行杂种优势研究,发现其中差异表达基因有定量和定性的区别,定性差异是在亲本中高表达或低表达的基因在杂交种中显著高表达;而定量差异有4种基本模式,即在双亲中表达,但后代不表达(BPnF1);其中一个亲本表达,后代不表达(UPnF1);亲本均不表达,后代表达(UF1nP);双亲之一有表达,同时后代也表达(UPF1)．在亲本及其后代整个生长期叶片中观察到的基因差异表达可能是杂种优势现象的成因．Wang等[65]通过分析12个玉米近交系及其配组的33个杂交系的基因差异表达情况,发现基因在双亲及其杂种后代中均表达的模式占大多数,故杂种优势不仅与基因表达与否有关,还与基因的表达丰度有关;在玉米雌幼穗发育初期,杂交种的基因表达与双亲的基因表达差异最大;另外,某些基因在杂种中不表达，可以促进籽粒的发育并抑制幼穗中小花发育．利用基因差异表达分析技术,能挖掘新的功能基因，揭示基因的新功能等,为探究农作物的农艺性状、品质性状以及抗逆性等方面的机理机制奠定基础．随着生命科学进入后基因组时代,通过测序及功能注释将对DNA序列、基因表达通路、蛋白质结构及其互作关系等进行初步的鉴定．高通量测序技术和生物信息学的运用,结合qRT-PCR验证提高研究的准确性,也加快了该领域的研究进程．本课题组采用转录组测序技术,对比分析甘薯徐薯18和徐781的转录组信息,在一定程度上解释2种材料的淀粉含量差异和抗性差异(数据未发表),但其具体的调控机制有待进一步研究．未来,从基因差异表达分析入手获得相关功能的候选基因,采用基因编辑技术对目标基因进行敲除或降低其表达量,可逐步实现分子设计育种的目标[66-67]．*通讯作者:李强,男,研究员,博士,主要从事甘薯遗传与分子育种研究,E-mail:****************．【相关文献】[1] 吴乃虎.基因工程原理[M].2版.北京:科学出版社,1998.[2] 刘凯,曾继吾,夏瑞,等.mRNA差异显示技术及其在园艺植物上的应用(综述)[J].亚热带植物科学,2009,38(1):78.[3] 黎裕,王建康,邱丽娟,等.中国作物分子育种现状与发展前景[J].作物学报,2010,36(9):1425.[4] Lamar E E,Palmer E.Y-encoded,species-specific DNA in mice:evidence that the Y chromosome exists in two polymorphic forms in inbred strains[J].Cell,1984,37(1):171. [5] Liang P,Pardee A B.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J].Sci,1992,257(5072):967.[6] Hubank M,Schatz D G.Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA[J].Nucl Acids Res,1994,22(25):5640.[7] Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,et al.Serial analysis of geneexpression[J].Sci,1995,270(5235):484.[8] Diatchenko L,Lau Y F,Campbell A P,et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12):6025.[9] Bachem C W,van der Hoeven R S,de Bruijn S M,et al.Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP:analysis of gene expression during potato tuber development[J].Plant J,1996,9(5):745.[10] Cottrez F,Auriault C,Capron A,et al.Quantitative PCR:validation of the use of a multispecific internal control[J].Nucl Acids Res,1994,22(13):2712.[11] 金凤媚,薛俊,郏艳红,等.半定量RT-PCR技术的研究及应用[J].天津农业科学,2008,14(1):10.[12] 张春兰,秦孜娟,王桂芝,等.转录组与RNA-Seq技术[J].生物技术通报,2012,28(12):51.[13] 白根本,沈昕,王沙生.差减杂交方法的原理和应用[J].生物工程进展,1998,18(6):54.[14] 佘卫炜,郭志刚,刘瑞芝.用扣除杂交法分离藏红花苷合成相关基因的克隆[J].清华大学学报(自然科学版),2004,44(12):1592.[15] 李捷,印莉萍,刘维仲.示差扣除杂交法及其在分子生物学中的应用[J].生物技术通报,1999,15(3):9.[16] 白根本,沈昕,王沙生.胡杨盐诱导基因与盐抑制基因的差减杂交显示研究[J].林业科学,2003,39(2):168.[17] 张弛,陈受宜.利用DDRT-PCR技术分析在盐胁迫下水稻耐盐突变体中特异表达的基因[J].中国科学(B辑),1995,25(8):840.。

RNA-seq基础知识1.RNA-Seq名词解释2.测序名词解释3.高通量测序常用名词解释4.转录组测序问题集锦RNA-Seq名词解释1.index 测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。

2.碱基质量值（Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。

碱基质量值越高表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。

3.Q30 碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。

4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Millionfragments mapped）每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。

计算公式为公式中，cDNAFragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数，以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。

5.FC（Fold Change）即差异表达倍数。

6.FDR（False Discovery Rate）即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。

通过控制FDR来决定P值的阈值。

7.P值（P-value）即概率，反映某一事件发生的可能性大小。

统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。

8.可变剪接（Alternative splicing）有些基因的一个mRNA前体通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点）产生不同的mRNA剪接异构体，这一过程称为可变剪接(或选择性剪接，alternative splicing)。

DNA序列数据分析技术综述DNA 序列数据分析是生物信息学领域中的一个重要分支，它通过对DNA序列进行系统学的分析，揭示生物分子的结构、功能以及演化规律等方面的信息。

在近年来，高通量测序技术的发展和应用的推广，加速了DNA序列数据量的积累和多样性，推动了生物学研究的发展。

这篇综述将会介绍几种主要的DNA序列数据分析技术和方法。

第一，全基因组测序(Whole Genome Sequencing)。

它是指对一个生物体的所有基因组DNA序列进行测序，所获取到的大量信息可以被加以分析以揭示基因组结构、功能等方面的信息。

全基因组测序一般采用Nanopore、PacBio等进行较长的reads的获取，之后在此基础上采用统计学技术进行reads的拼接，之后进行基因预测，同源比对，基因之间的有序排列等的分析，并可结合其他数据如RNA-seq数据以加深基因功能的理解。

第二，转录组测序(RNA-seq sequencing)。

它是指对一个生物体的所有基因产生的mRNA进行测序，以揭示在不同生长、发育、病理状态下细胞的转录基因组变化，从而研究基因的调控机制、功能等。

RNA-seq测序技术通过对RNA转录本序列的高通量测序，获取了大量的RNA序列数据，然后结合基因注释数据库对其进行分析，常常用于发掘基因的差异表达，功能注释以及拼接新的转录本等方面的分析，还可用于研究RNA编辑等多个领域。

第三，基因组组装技术(Genome Assembling)。

它是指将高通量伸展测序产生的读取数据组装成为一个完整的代表一个生物体基因组序列的统一序列。

基因组组装技术是生物信息学领域中的一项基础技术，其对未知生物群体的基因组结构的揭示具有至关重要的作用。

基于伸展测序技术的产生长读取的数据，采用算法和统计方法进行基因组的组装，输出预测基因。

第四，元基因组组装技术(Metagenome Assembling)。

它是指通过高通量测序技术获取到不同环境中微生物代谢群体所产生的基因组序列数据，对其进行生物信息学分析和比对，从而发现微生物间的转移应对技术、肠道菌群变化以及环境微生物群落的结构探究等。

转录组测序（RNA-seq）技术转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。

转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。

相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

技术优势：¾数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

¾高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。

¾任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。

同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。

¾更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。

应用领域：转录本结构研究（基因边界鉴定、可变剪切研究等），转录本变异研究（如基因融合、编码区SNP研究），非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等），基因表达水平研究以及全新转录本发现。

图1 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异康成生物提供的RNA-seq技术服务实验流程：1. 样品RNA准备2. 测序文库构建¾使用oligo dT微珠纯化mRNA¾ mRNA片段化处理¾反转录反应合成合成双链cDNA¾双链DNA末端修复及3’末端加‘A’¾使用特定的测序接头连接DNA片段两端¾高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库3. DNA成簇（Cluster）扩增4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）5. 数据分析¾原始数据读取¾与数据库比对并进行注释¾深层次数据分析6. 提供实验报告¾原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估¾基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。

RNA-seq转录组的测序技术一、概述1. RNA-seq技术简介在过去的几十年中，研究人员利用转录组学技术对生物体中的RNA 进行研究，以揭示基因表达调控和基因功能等方面的信息。

而RNA-seq技术则是近年来兴起的一种高通量测序技术，逐渐替代了传统的microarray技术，成为了研究转录组学的主流方法之一。

二、RNA-seq的原理1. 测序库构建在进行RNA-seq实验之前，首先需要构建测序库。

通常采用聚合酶链式反应(PCR)或者DNA和RNA的逆转录(Reverse Transcription)来将RNA转录成双链DNA，并添加barcode标签，最后形成文库。

2. 高通量测序完成测序库的构建后，需要使用高通量测序技术对文库中的DNA 进行测序。

目前常用的测序评台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio 等公司的测序仪器。

高通量测序技术能够快速、高效地获取大量的基因序列信息。

三、RNA-seq的优势1. 高灵敏度与传统的microarray技术相比，RNA-seq能够提供更高的灵敏度和动态范围，能够检测到低表达水平的基因，同时也能够覆盖更广泛的基因组区域。

2. 高分辨率RNA-seq能够提供单个碱基的分辨率，帮助研究人员更准确地识别基因的外显子、内含子和剪切异构体。

3. 无需先验信息相比于microarray技术需要先知道待检测基因的序列信息，RNA-seq技术能够在不依赖已知基因组信息的情况下进行测序。

四、RNA-seq的应用1. 基因表达水平分析RNA-seq能够帮助科研人员进行基因表达水平的定量和定性分析，揭示基因在不同组织、不同环境条件下的表达规律。

2. 剪切异构体分析通过RNA-seq技术可以发现和识别基因的各种剪切异构体，帮助了解基因的调控机制。

3. RNA编辑和融合蛋白质的细致分析RNA-seq技术也被广泛应用于RNA编辑和融合蛋白质的研究，为研究人员提供了一种便捷的方法。

广州基迪奥生物科技有限公司/转录组是指某个物种或者特定细胞或组织在某一状态下所转录出来的所有转录本的集合。

转录组为核酸研究提供了全新的角度，可用于预测基因结构、可变剪切和其他转录组修饰、并可定量测定每个转录本在生长过程中和不同条件下的表达水平的变化。

通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或者器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。

原核转录组与真核转录组的分析基本相似。

但由于原核生物的mRNA 没有polyA 尾结构，因此原核生物的mRNA 富集直接采用去rRNA 的策略（真核生物采用的策略为直接富集polyA 尾的RNA ）。

建库策略：300bp 插入片段文库 测序策略：125PE 测序 测序平台：Hiseq2500测序样品质量检测→常规/链特异性转录组测序文库制备→上机测序→生物信息分析原始序列数据 数据质控De novo 拼接 （无参考）比对参考基因组 （有参考）基因差异表达分析 GO 功能显著性富集分析Pathway 显著性富集分析预测编码蛋白框(CDS) Unigene 功能注释 新基因预测基因可变剪切鉴定 SNP 检测 基因融合鉴定图2 比较转录组ka/ks分析通过杨树两个近缘种单拷贝同源基因的ka（非同义突变率）和ks（同义突变率）的比较。

图中Ka/ks>1（红色斜线上方）的基因属于快速进化的基因，潜在与沙漠干旱环境适应性相关[1]。

图3 基因家族进化树以及蛋白结构域分析某蛋白家族在拟南芥、玉米多个物种的序列进化关系。

从左图进化树可以推断这个家族可以分为4个亚家族。

而从右图的蛋白结构域分析中，可以进一步发现不同蛋白亚家族由不同的结构域构成，而这可能与亚家族功能的分化相关。

图1 Unigene与近缘物种同源序列比较通过与近缘种同源序列比较，可以判断转录组Unigene组装结果的整体完整性，直观反映组装质量。

图中大部分Unigene（蓝色以及蓝色以上点）对同源基因的覆盖度在50%以上，说明组装结果具有较好的完整性。