蛋白灰度分析软件使用
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网络出版时间:2023-05-0916:29:18 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20230508.1432.054.html鹿龙再生汤Ⅱ号方对化疗后骨髓抑制的作用机制崔伟伟1,2,彭 飞1,2,秦婷婷1,2,胡灿红1,2,郁兆婧1,3,方志军1,2,朱建华3,4(1.南京中医药大学附属中西医结合医院,2.江苏省中医药研究院,江苏南京 210028;3.南通良春国医堂,江苏南通 226001;4.南通大学附属医院,江苏南通 226001)收稿日期:2022-11-10,修回日期:2023-01-15基金项目:江苏省重点研发计划(社会发展)专项(NoBE2021753);江苏省中医药研究院自主科研项目重点项目(NoBM2018024 2019005)作者简介:崔伟伟(1982-),女,学士,副主任中药师,研究方向:中药药理学,E mail:cuiweiwei8855@sina.com;彭 飞(1982-),男,博士生,研究方向:中医药抗肿瘤,共同第一作者,E mail:pengfei_82@163.com;方志军(1965-),男,主任中医师,研究方向:中医药治疗肿瘤,通信作者,E mail:1248256089@qq.com;朱建华(1947-),女,主任中医师,研究方向:中医临床,通信作者,E mail:zjh47@126.comdoi:10.12360/CPB202112055文献标志码:A文章编号:1001-1978(2023)05-0986-08中国图书分类号:R 332;R289 5;R322 2;R329 25;R735 3摘要:目的 探讨鹿龙再生汤Ⅱ号方对荷瘤裸鼠骨髓抑制的干预作用机制。
方法 肠癌荷瘤裸鼠随机分为5组:对照组、化疗组、化疗加利可君片组,化疗加鹿龙再生汤Ⅱ号方高、低剂量组,连续灌胃给药10d。
d4-10,除对照组外,均腹腔注射氟尿嘧啶(5 Fu)25mg·kg-1。
蛋白灰度值计算随着健身风潮的兴起,蛋白质在人体健康和运动中所起的作用日益受到人们的关注。
而如何衡量蛋白质的含量,就成为了许多健身爱好者和科研人员关注的重点。
其中一个重要的指标就是蛋白质的灰度值,本文将对蛋白质灰度值的计算方法进行详细介绍。
1. 什么是蛋白质灰度值?蛋白质灰度值是指蛋白质在图像中的灰度平均值。
它反映了蛋白质在照片上的亮度。
蛋白质分子越多,其灰度值越高。
2. 蛋白质灰度值如何计算?蛋白质灰度值的计算方法有多种,以下是其中两种常用的方法。
方法一:使用软件进行计算通过使用一些图像处理软件,如ImageJ,可以方便地计算出蛋白质的灰度值。
具体步骤如下:1) 打开ImageJ软件,在“File”菜单中选择“Open”选项,打开需要计算灰度值的图片。
2) 选择“Image”菜单中的“Adjust”选项,然后单击“Auto Threshold”选项,进行图片二值化。
3) 在“Analyze”菜单中选择“Measure”选项,测量图片的灰度值。
方法二:自行编程计算唯一的缺点是需要具备一定的计算机编程能力。
具体步骤如下:1) 图片处理提取需要计算灰度值的图片,并可进行自动二值化处理和噪声去除。
这可以通过Python等编程语言的图形处理库实现。
2) 灰度值计算使用图像处理库中的函数计算图片的灰度值。
根据计算出的灰度值的统计结果,可以得到蛋白质的灰度值。
3. 蛋白质灰度值的影响因素有哪些?蛋白质灰度值的影响因素有很多,以下是一些重要的影响因素。
1) 蛋白质浓度:蛋白质浓度越高,其灰度值越高。
2) 图片亮度、对比度:在图片中,蛋白质的灰度值受图片亮度和对比度的影响,需要进行调整。
3) 照片质量:如果照片质量差,如不均匀的光线、模糊等,可能会对蛋白质灰度值的计算造成质量影响。
4. 为什么需要计算蛋白质灰度值?蛋白质的含量是检测某些生物学过程如老化、肿瘤、疾病等非常重要的指标。
通过计算蛋白质的灰度值,不仅可以了解蛋白质的含量,还可以通过照片上的灰度分布了解蛋白质的分布情况,对某些生物学过程更加了解。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤一、组织的研磨准备:研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤:①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎,取出组织,在研钵中盛满液氮,用力敲碎组织,研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了,立即加入液氮,保持研磨在液氮中进行,直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存,待所有组织都研磨结束后装入自封袋,于-80℃保存。
注意:1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头,在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管,备用。
二、裂解提蛋白准备:裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000:10=100:1若需要加入蛋白酶抑制剂,则比例一般为1:1000(即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂)步骤:①将RIPA和PMSF按比例混匀,加入到装有组织粉末的EP管中,一般加入300~500μl左右(浓度尽量高点)。
②盖好盖子,在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃,12000rpm离心10min,取上清液转移到新的离心管中,于-20℃保存。
注意:1.裂解液加入后用手指弹一下混匀,当加入量很少时,成粘稠状,有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度(BCA试剂盒)准备:BCA试剂盒(BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液)、酶标板、酶标仪、摇床步骤:①按1:15或1:30稀释待测样品,即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液,样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液,充分混匀,在摇床上震荡30s,37℃放置30min,于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光度为纵坐标,根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
如何用photoshop计算蛋白条带的灰度值?
在western blot或者DNA电泳条带中,经常需要半定量统计条带的灰度值,比较常用的是用ImageJ这个软件来统计,但是如果不熟悉操作很容易得出错误的统计数据。
本文从原理到操作告诉你如何用photoshop来统计灰度值首先进行实际操作之前我们先来理解下什么叫做灰度值
如上图所示,灰度值就是从黑到白渐变过程中对应的数值。
0代表黑色,255代表白色。
上图所示正常western blot条带和反向之后的条带。
上图的箭头分别指出了条带以及背景对应的区域。
在正常条带中条带的值约为20,背景值为80;在反向图片中,条带的值约为200,背景值为130。
我们习惯了条带越粗亮灰度值越大,因此我们一般是对其进行反向之后测量。
在这里一定要去掉背景,至于为什么要去掉背景,在此不多说了(视频教程里将详细介绍)请看下面图片:那么接下来开始我们今天的教程:打开图片,因为图片有点倾斜,我们需要将其摆正,有两种方法进行拉直,第一种是将图层旋转(Ctrl+T,然后旋转至其摆正),另外一种是使用标尺工具,在左边快捷栏中安卓吸管工具不放,选择标识工具,然后在条带上面从左边点按住鼠标不放一直拖动到最右边,最后点击拉直图层即可。
点击菜单栏的“窗口”,选
择直方图,弹出下面面板。
Western blotting实验流程实验流程共分为6步:1 待测蛋白的准备;2 蛋白电泳;3 转膜;4 抗体结合;5 曝光;6 灰度值统计分析。
一、待测蛋白的准备1.细胞蛋白的提取:(1)拿出六孔培养板,去培养液,PBS洗细胞两遍,根据细胞密度每孔加50~100µl细胞裂解液(含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配),冰上放置10分钟裂解。
(2)将培养板置于冰上,用细胞刮挂下细胞,每孔刮一分钟左右(刮不同孔细胞需用PBS 或水冲洗细胞刮,洗后甩干),收集裂解液于1.5ml EP管中,置于冰上裂解20分钟,期间需用振荡器振荡混匀3次,每次15秒左右(3)12000rpm,4℃冷冻离心5min左右,收集上清置于新EP管,存于-80℃。
2. BCA法蛋白溶液浓度测定(具体步骤按试剂盒说明书)(1)配制BCA工作液:打开37℃恒温箱预热加温,取出BCA标准品与蛋白样品解冻,配BCA工作液,A:B=50:1,A液总量=(8个标准蛋白+待测蛋白数量)*200µl,B液总量=(8个标准蛋白+待测蛋白数量)*4µl,配好后混匀。
(2)配制BCA标准品与标准曲线:用PBS稀释好标准品,按说明书将标准品加入到96孔板中,再补加PBS到一样体积。
(3)配制蛋白样品:每孔加入5µl蛋白原液,补加PBS稀释(稀释可节省蛋白,记住稀释倍数,蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测;蛋白孔可做2~3个平行孔,测量时取平均值较准)(4)加入BCA工作液:每孔各加200µl已配好的工作液,盖上板盖混匀30秒,37℃孵育30min,放好蛋白样品。
(5)测蛋白浓度:打开酶标仪预热10分钟以上,孵育完后取出96孔板冷却到室温,用移液枪去除小气泡,用纸巾擦干96孔板板度水珠,调节酶标仪波长,放入打印纸,打开96孔板板盖,在570nm波长下读取数值,空白孔可设可不设。
(具体按酶标仪操作说明,可以测几次选取)(6)计算浓度:用EXCELL表格制作标准直线方程,计算待测蛋白浓度(若稀释测量的记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度),然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各组蛋白上样体积与细胞裂解液RIPA的补加体积。
蛋白表达研究系列之——Western Blot试验操作指南目录目录 (1)一、总蛋白的提取 (2)1 试验类型和蛋白类型 (2)2 样品组织类型 (3)3 蛋白表达峰度判断 (4)4 总蛋白提取的基本步骤 (4)4.1细胞样品总蛋白的提取操作步骤 (5)4.2组织样品总蛋白的提取操作步骤 (5)二、总蛋白BCA定量 (6)三、SDS-PAGE凝胶电泳 (7)四、转膜 (8)五、信号增强剂处理膜 (9)六、封闭、一抗孵育、二抗孵育 (9)1 封闭 (9)2 一抗孵育 (9)3 二抗孵育 (13)七、曝光显色 (14)八、灰度分析 (15)九、抗体及相关溶液配制 (15)1 抗体 (17)2 相关溶液配制表 (17)蛋白检测相对于DNA/RNA的检测来讲要困难许多,Western Blot作为蛋白检测的经典方法短时间内仍然无法被取代。
Western Blot的原理并不复杂,网上有很多这方面的材料,这里不作过多的介绍。
虽然原理、操作并不复杂,但做好Western Blot、得到满意的图片并非易事。
其操作过程中涉及到:蛋白提取、电泳、转膜、杂交、显色、抗体的选择、试剂的选择、设备应用等诸多内容,其中每一个环节的差错对最后的试验结果都会产生不小的影响,最终导致试验失败。
很多同学都在抱怨自己的Western Blot没有信号、目的条带太弱、杂带太多、条带弯曲、泳道中有涂抹状背景等诸多问题,大部分情况都会最终把矛头指向抗体,认为这个抗体质量不好。
抗体质量肯定会对试验产生相当重要的影响,但绝不是全部。
你的操作方法可能是对的,但,是否合理、是否适合你的试验要求,你可能未必了解。
我们课题组Western Blot的任务量极重(每年ECL的用量都在5L以上),课题组里面的一些同学总是在不停的问我关于条件优化的问题,我不可能为每一个人找到问题的关键点,因此,写一份关于Western Blot的系统性材料非常有必要,希望你们可以针对自己的问题,自我分析、自我解决,这样也能锻炼你们独立解决问题的能力。
❷ ❷ 1.打开图片(可以将要进行分析的条带提前编辑到一张图片,以便进
行多条带的同时分析)
2.框选第一条要分析的目标条带,出现黄色框框进行框选
❶
❶
ImageJ 进行蛋白灰度分析操作步骤
3.将选出的条带设置为第一条要分析的条带
❶
❷
❸
4.框选下一条蛋白条带区域,操作位直接用鼠标左键移动第一条黄色框至下一条要分析的条带处
5.将框选的第二条条带设置为要进行分析的区域(如果有更多条带分析,则重复第二条带的操作步骤)
❶
❷
❸6.点击Plot Lanes,跳转至下一步
7.选择直线工具,画出各条带永道的封闭面积,然后使用魔术棒点击各条带灰度封闭取峰图,
得到result 框中定量灰度结果。
❶
❷
❸。
收稿日期:2022-05-23基金项目:广西中医药大学研究生教育创新计划项目(YCSZ2019009;YCSZ2020009;YCXJ2021014);广西壮族自治区教育厅广西研究生教育创新计划资助项目(JGY2014086)作者简介:朱海滨(1997-),男,江西抚州人,硕士,主要从事抗炎免疫药理研究,(电话)137****6474(电子信箱)****************;通信作者,杨柯(1975-),男,广西柳州人,教授,主要从事抗炎与免疫研究,(电话)134****0102(电子信箱)************************。
朱海滨,曾春晖,唐木兰,等.基于AMPK/mTORC1自噬通路研究二氢杨梅树皮素对损伤A549细胞的保护作用[J ].湖北农业科学,2023,62(9):175-180.基于AMPK/mTORC1自噬通路研究二氢杨梅树皮素对损伤A549细胞的保护作用朱海滨,曾春晖,唐木兰,池鑫宇,邓浩健,李雨君,方静,徐浩亮,杨柯(广西中医药大学药学院/广西高校中药药理重点实验室,南宁530200)摘要:为研究二氢杨梅树皮素(APS )对脂多糖(LPS )诱导A549细胞损伤模型的保护作用及其对AMPK/mTORC1自噬通路的影响,随机分为正常组、模型组、APS 高中低浓度组(80、40、20μg/mL )。
除正常组外,其余各组用30μg/mL LPS 诱导8h 构建A549细胞损伤模型,APS 干预24h 后,MTT 法检测A549细胞存活率、荧光法检测上清液LDH 漏出量、Elisa 法检测上清液TNF-α含量、MDC 法细胞检测自噬体形成情况、自噬双标mRFP-GFP-LC3检测细胞自噬流情况,Western blot 法检测p-AMPK/AMPK 、p-mTOR/mTOR 以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62蛋白表达水平。
AMPK 抑制剂(CC )干预验证试验,随机分为正常组、模型组、LPS+APS 组、LPS+CC 组、LPS+APS+CC 组,APS 与CC 共培养时间24h 后,采用Western blot 法检测p-AMPK/AMPK 、p-mTOR/mTOR 以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62蛋白表达水平。
Oligo 6 Tour 主要功能介绍Oligo是一种多功能的程序,通过从一个序列中搜索、选择寡核苷酸而广泛运用于PCR、DNA 测序、定向诱变及各种杂交中。
它采用nearest neighbor thermodynamic values的方法计算出杂交的温度及寡核苷酸的二级结构。
Oligo软件已经被认可作为一种选择及分析寡核苷酸的工业软件,运用于各种分子生物学中。
最早的商业化的软件在1989年被开发出来。
本文描述了Oligo软件的最重要的特征及性能。
1、主窗口当你运行Oligo、并输入序列之后,Oligo出现了两个窗口:上面的一个为Tm窗口(The Melting Temperature window),下面的一个为内部稳定性窗口(五聚体的DG),还有第三个窗口,即寡核苷酸频率窗口,隐藏在内部稳定性窗口之后。
--图1,2Tm窗口显示了一部分的DNA/RNA的活性片段,Tm的散点图显示了在这个片段中的每20个碱基的Tm值。
分析的片段的长度是可变的,取决于monitor resolution。
圈出来的序列部分及黄色的bar即代表当前分析的20个碱基的Tm值【注:Olig6.71的版本为20个碱基,与原文的21个碱基不同】.可通过点击窗口的左下角的Upper、Lower按钮选择上游引物、下游引物。
划分Tm图二等分的水平线代表了这个序列的所有的21个碱基的寡核苷酸的平均Tm值(or free energy or degeneracy or %GC)。
在Tm图的分别为双链的核苷酸序列及相应的氨基酸【彩色的代表使用的密码子】--图3内部稳定性窗口显示了寡核苷酸的内部稳定性(五具体的自有能)。
可被用于预测用于PCR 或测序反应特异性的把握度2. Analyze - Key Info显示寡核苷酸的基本信息。
--图4,53. Analyze - Duplex Formation显示了上游引物、下游引物的潜在的二级结构的形成。
入门Imageproplus(IPP)的主要用途是分析测量图象。
本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间,写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得,并总结一下使用方法。
如果你是刚接触IPP,最好先从本帖看起,并同时打开你电脑上的IPP程序照着操作。
学会一个软件需要花一段时间的,两分钟不可能学会。
两小时也太短。
但我相信,照着我这几个帖子作下来,至少是可以用IPP干一点事情了。
打开IPP后的界面是这样的,该从何处下手呢?既然是处理图片,当然是先要打开一张要处理的图片嘛这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。
处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的“量”。
对该图片进行观察,可以看到图片中主要有三种主要颜色,一是染成蓝色的细胞核,二是呈现出黄色的胞浆,三是细胞间的空隙区域,呈现出浅蓝色,是为背景。
所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来,这部分区域是我们最感兴趣的地方,叫作AOI(area of interest)。
AOI是IPP中最有用最重要的概念。
如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。
一旦准确地选取了AOI,下面的测量分析就好办了。
对不同的图片,需灵活地使用各种适当的AOI工具,就这张图片来说,AOI是黄色区域,因此用颜色分类的AOI工具是最有效的。
点击measure---count/size,弹出分类测量窗口。
在窗口中选中manual,再点击select color,弹出颜色选择窗口segmentation,这个工具是IPP 最有特色的颜色选取工具之一。
用好这个工具是使用IPP的要点于目标颜色鲜明的图片,用吸管工具是最简单的。
点一下吸管图标,在目标区域点一下,就可以选中该点的颜色,当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域,可以在未选中的地方接着再点,这样多次选取,直到把想选中的区域全部选中为止。
在这张示例图中,选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。
quantityone中文使用说明**首先把做出的图片用“图片转化器Version 3.14”(可下载)转换为TIF格式,颜色框选中“真彩”,压缩框选中“TIFF UNCOMPRESSED”,点击开始转换,转换的图像才能在本软件中应用。
** 凝胶电泳是基本技术。
电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。
目前有大量软件可以用于分析电泳结果,比较有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma Gel等等。
今天要向大家介绍的是来自Bio-Rad的1D凝胶定量软件Quantity One(Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest)。
这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的主页免费下载。
目前的最新版本是4.52版。
虽然软件并非免费,但是值得高兴的是该软件提供了30天的全功能试用期,而且30天以后仍然可以以Basic Mode继续使用,关键功能如Lane、Band、Volume Contour功能一个不缺,只是无法保存和打印结果(其实这没有很大关系,大家可以用HyperSnap等截屏保存分析结果)。
Quantity One的分析功能顾名思义主要用来进行凝胶或者培养皿的荧光定量分析。
它的分析功能或者说分析方式主要有4种:泳道/条带轨迹定量法;等高线直接定量法;菌落计数;分子量测定等高线定量法(Volumn Contour):通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积,再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。
当然这种分析方法的弊病显而易见:道的背景亮度;等高线的绘制处于“半自动”状态,即需要人为判断作为等高线标准无法同等得排除不同泳的电泳条带的边缘;最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时候几乎无法绘制单一条带的轮廓(常出现连续的几个条带等高线相连而无法分离出单独条带的轮廓)。
泳道/条带轨迹定量法(Trace Tracking):使用起来步骤较为繁琐,必须通过泳道识别---电泳条带识别两个连续的步骤才能进行定量。
imagelab 算条带灰度值【最新版】目录1.介绍 ImageLab2.条带灰度值的概念3.ImageLab 实现条带灰度值计算的方法4.应用案例正文1.介绍 ImageLabImageLab 是一款图像处理软件,广泛应用于生物学、医学等领域的科研工作中。
它功能强大,能够满足科研人员在图像分析、处理和可视化方面的需求。
在基因组学、蛋白质组学等研究领域,条带图像分析是常用的一种手段。
2.条带灰度值的概念在条带图像分析中,条带灰度值是指图像中每个像素点的灰度值。
灰度值是表示图像亮度的指标,其取值范围通常为 0(黑色)到 255(白色)。
在条带图像中,灰度值的变化可以反映出不同生物标志物的表达水平。
3.ImageLab 实现条带灰度值计算的方法ImageLab 提供了多种方法来计算条带灰度值。
其中,最常用的方法是使用“Measure”工具。
具体操作步骤如下:(1)打开 ImageLab 软件,导入需要分析的条带图像。
(2)在工具栏中选择“Measure”,然后在图像上绘制需要计算灰度值的条带区域。
(3)绘制完成后,在“Measure”工具栏中选择“Statistics”,即可显示所选区域的灰度值统计信息。
(4)根据需要,可以继续绘制其他条带区域,并分别计算其灰度值。
4.应用案例假设我们有一张蛋白质电泳条带图像,需要分析其中某个目标蛋白的表达水平。
可以使用 ImageLab 的“Measure”工具,先绘制目标蛋白所在的条带区域,然后计算该区域的灰度值。
将得到的灰度值进行统计分析,可以得到目标蛋白在不同样本中的表达水平。
STAT3、E-cadherin、Vimentin在食管鳞癌上皮间质转化中的研究作者:徐夏江海陈豫民王琰来源:《中国医学创新》2021年第11期【摘要】目的:探究STAT3、E-cadherin、Vimentin在食管鳞癌上皮间质转化过程中产生的影响。
方法:采用RT-qPCR方法检测50例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中STAT3、E-cadherin、Vimentin的mRNA水平表达,分析癌组织、癌旁正常组织相对表达量与临床病理特征间的关系;随机抽取4例食管鳞癌患者组织标本,采用Western blot方法检测STAT3、E-cadherin、Vimentin蛋白水平表达。
采用RT-qPCR及Western blot方法检测三种食管鳞癌细胞株中STAT3、E-cadherin、Vimentin表达,筛选出1株高表达STAT3的菌株,用STAT3的小干扰RNA转染。
对照组转染双链无义RNA,转染成功后进行细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验。
结果:50例食管鳞癌组织中STAT3、E-cadherin、Vimentin相对表达量分别为(1.81±0.62)、(0.68±0.23)、(1.48±0.56);癌旁正常组织为(0.54±0.23)、(2.03±0.64)、(0.61±0.21)。
食管鳞癌中STAT3、Vimentin在mRNA水平高表达及E-cadherin低表达,在浸润深度、淋巴结转移方面比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。
检测随机4例食管鳞癌患者组织标本蛋白水平表达,癌组织中STAT3、Vimentin均比癌旁正常组织高(P<0.05),而癌组织中E-cadherin比癌旁正常组织低(P<0.05)。
STAT3小干扰RNA 转染高表达STAT3的细胞株EC109后,STAT3表达在mRNA水平较对照组下调,E-cadherin 表达较对照组相对上调;Vimentin表达较对照组相对下调,差异均有统计学意义(P<0.05);在蛋白水平,转染STAT3小干扰RNA组较对照双链无义RNA组成功抑制STAT3蛋白表达(P<0.05),E-cadherin蛋白表达相对上调(P<0.05),Vimentin蛋白表达相对下调(P<0.05)。
Image J和Graphpad如何对Western Blot条带灰度分析WB是研究蛋白表达的一个经典方法。
对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。
一些凝胶成像软件带有此分析工具,比如Quantity One,Bandscan,Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。
除了这些软件,还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。
而且Image J是开源性质的免费软件,可以在其官网直接下载使用。
对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。
灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。
灰度值越小物体颜色越深。
光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线通过溶液或物质后的透射光强度Ib比值的对数OD=log(IO/Ib);图像分析中,入射光和透射光强度分别被切片上最亮区域的平均灰度值和待测目标平均灰度值取代,则图像分析系统的光密度值=log(切片标本最亮区域的平均灰度值(g0)/待测目标的平均灰度值(g))。
光密度值越大,物体颜色越深,阳性物质相对含量越大。
对于灰度值来说,切片标本制作时染色时间长短,以及测量时显微镜照明光源电压的大小对其影响很大。
而光密度是一个比值。
是通过计算一张切片标本最亮区域的平均灰度值与该切片标本中待测目标的平均灰度值的比值,再根据数学公式计算而来的,所以受切片标本染色时间长短及照明光源电压关系很小。
然而有研究实践显示,灰度值与光密度值二者之间存在着线性关系,都可以用来进行WB定量分析。
同样,Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法,此处只列举一种方法,具体步骤如下。
1、下载安装,并打开Image J软件。
2、导入WB条带图片。
File→Open→弹出对话框→选择文件夹→找到WB条带。
3、把图片转化成灰度图片:Image→Type→8-bit。
这时WB图片将会随之改变。
作者修回说明如下-------------------------------------------尊敬的南京医科大学编辑部编辑先生、女士:您好,首先向各位专家对本文提出的建议及指正表示感谢,因为个人缺乏投稿经验,在第一次修回过程中未将改动的地方标出,更未一一回答审稿人的问题,在此给审稿人带来的不便致以诚挚歉意。
以下将各位审稿人提出的问题,做出回答,并按照贵刊的要求作了详细修改,且在修改过的地方在文章中用“红色”标记出,尚有不妥之处敬请指正。
1.现已将英文摘要及分组的描述做出了修改并标记;对于p-smad的western条带与量化图也做了更正;并在所有实验结果描述部分均详细写出了蛋白上调或下调的具体数值。
2.对于审稿人提出“如果想要真正深入研究AGEs 对心肌成纤维细胞的老化作用研究,是否考虑做一些在体的工作再结合机制的研究更好?”,我们课题组对此正在进行相关临床研究,且也曾报道过AGEs与老年人血管硬化及心脏舒张功能的相关关系。
3.对于审稿人提出实验设计简单的问题,笔者会在以后的工作中对老化相关问题继续做进一步的研究。
而在此次修回稿中我们也相应的补充了研究数据,包括TGFβ/smad通路抑制剂干预后,老化相关指标的变化情况,以及TGFβ1、p-smad、MMP-2的表达水平,并对文章的题目稍作变动,现改为“晚期糖基化终产物对心肌成纤维细胞老化及纤维化的影响”。
此外,将每张附图的图题、图引标出,重复检测的样本数等也在文章中加以标注,并对标注和书写有误的地方做了修正。
若有不当之处,请加以指正。
此致敬礼晚期糖基化终产物对心肌成纤维细胞的老化及纤维化的影响[摘要]目的:探讨晚期糖基化终产物(AGEs)诱导心肌成纤维细胞老化及纤维化的相关机制。
方法: 用AGEs(200μg/ml)及抗-RAGE抗体(2μg/ml)、TGF-β/smad 通路抑制剂(SB431542,10μM)干预乳鼠心肌成纤维细胞72h。
ImageJ对WesternBlot进行灰度分析Western Blotting是生物学领域常用的分析蛋白质的实验技术,它可以提供蛋白质定量和免疫印迹图像。
Western Blot的数据分析需要使用图像处理软件,ImageJ是一款免费的开源软件,是生物医学图像处理分析领域的标准工具之一。
本文将介绍ImageJ如何对Western Blot图像进行灰度分析。
背景Western Blotting技术是分析蛋白质表达及功能的一种常用方法,它可以检测蛋白质的存在、分子量、相对表达量、修饰等信息。
通常利用免疫学方法检测Western Blot膜上的蛋白质,检测后得到的结果是一张黑白图像。
这个图像需要进行处理和分析,以得到蛋白质的数量和变化。
ImageJ是一个开源的图像处理和分析软件,它可以用于各种各样的生物医学图像分析,包括Western Blotting图像分析。
ImageJ提供了灰度分析的功能,可以实现对Western Blotting图像的结果定量分析。
灰度分析可以测量Western Blotting图像的灰度值,这个值可以代表蛋白质的含量,从而实现对蛋白质表达量的分析。
安装ImageJ和导入图像在使用ImageJ进行Western Blotting图像分析前,需要先安装并打开ImageJ。
安装完成后,可以通过以下步骤导入Western Blotting图像:1.打开ImageJ并选择“File”菜单中的“Open”选项。
2.找到Western Blotting图像并选择打开。
3.如果需要对导入的图像进行调整,可以使用ImageJ提供的功能或插件进行操作。
灰度分析灰度分析是Western Blotting图像分析的一个重要步骤,旨在定量分析蛋白质的含量。
以下是使用ImageJ进行灰度分析的步骤:1.进入“Analyze”菜单并选择“Gels”选项。
2.在“Gels”菜单中,选择“Lane Profile”选项。