荧光素酶 化学发光

手把手教你双荧光素酶报告实验萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。

荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。

荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。

然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。

结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

同时，为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂Luciferase Assay Reagent II时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。

定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo Reagent试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。

下面就介绍一下萤光素酶实验检测步骤：一、样品准备：1质粒转染细胞（1）细胞铺板：将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。

（2）转染：16h左右细胞约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。

首先设计四组：1.空白组（转染试剂+细胞）2.质粒组3.质粒+miRNA NC组4.质粒+miRNA mimics组2.1配制质粒组：按照每空50ng质粒，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为A。

2024年化学发光市场发展现状引言化学发光是一种通过化学反应产生光的现象，具有广泛的应用领域。

本文旨在介绍化学发光市场的发展现状，包括市场规模、应用领域和发展趋势。

市场规模化学发光市场在过去几年里取得了快速增长，主要受到以下因素的影响：1.市场需求增加：随着工业和科学领域的不断发展，对高性能发光材料的需求日益增加，推动了化学发光市场的扩大。

2.技术创新：化学发光技术不断创新，提高了产品的性能和品质，满足了市场需求，进一步推动了市场的发展。

3.成本下降：随着生产技术的不断成熟和规模效应的发挥，化学发光产品的制造成本逐渐下降，提高了产品的竞争力。

根据市场研究机构的数据，化学发光市场在过去五年里以每年8%的速度增长，预计未来几年将保持相似的增长趋势，市场规模有望进一步扩大。

应用领域化学发光技术在多个领域有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：生命科学化学发光在生命科学领域中起着重要作用，用于生物标记、蛋白质分析、细胞成像等。

例如，荧光素酶（Luciferase）被广泛用于基因表达分析，其反应发光的特性使得分析更为敏感和准确。

医疗诊断化学发光技术在医疗诊断领域具有广泛应用，如体外诊断试剂盒和免疫分析等。

化学发光产生的稳定且强烈的荧光信号，为快速、准确的诊断提供了有力的工具。

环境监测化学发光技术在环境监测中起着重要作用，如水质分析、大气污染监测等。

其高灵敏度和选择性使得化学发光成为一种理想的环境监测手段。

安防领域化学发光技术在安防领域有广泛应用，如指纹检测、荧光防伪等。

其独特的荧光特性使得化学发光成为一种高效可靠的安防技术。

发展趋势1.新技术的应用：近年来，有机发光材料、量子点技术等新兴技术得到了广泛应用，为化学发光市场带来了新的发展机遇。

2.自动化和智能化：市场对自动化和智能化设备的需求不断增加，推动了化学发光市场的进一步发展。

自动化和智能化设备提高了生产效率和质量，并降低了人工干预的风险。

3.环保要求：随着环保意识的提高，市场对环保型化学发光产品的需求逐渐增加。

化学发光法
化学发光法是一种研究物质特性及其变化规律的常用实验手段。

该法利用一种物质在受到外力作用后释放紫外线能量而发出微弱的光芒，以此追溯物质的来源，进行物质的鉴定。

化学发光法的工作原理是，当物质受到振荡而发出次级电子时，被激发的激发态次级电子将能量辐射出去，形成紫外线，从而发出微弱的光芒。

这种叫做感光物质，可以接受激发势，能从荧光物质中释放出更多的能量，从而实现发光的目的。

化学发光法的应用非常广泛，在痕量元素的检测方面非常有效，可以用于生物分子的结构表征、药物的识别、血液成分分析、病原微生物的检测及材料的鉴定等。

同时，该法也广泛用于医药、粮食安全领域的检测等。

由于采用化学发光法可以实现物质快速分析，因此，可以使用荧光素酶技术制备某类特定细胞，也可用于全新分子设计，进一步提高研究能力。

化学发光法是一种物质分析的重要手段，在痕量元素的检测、药物的发现、粮食安全的控制、试剂的鉴定以及其他各种新领域中，化学发光法都发挥着重要作用。

荧光素酶基因在转化烟草中的表达利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。

然后转化烟草，测定荧光素酶活性。

通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转化，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

技术背景1荧光素酶生物检测技术诞生于1990年，已有30年的发展史。

单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。

双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。

什么是双荧光素酶？2双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。

其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为61 kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36 kDa。

两种荧光素酶的区别是什么？3①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。

②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。

正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：实验原理4Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。

Promega化学发光检测仪使用说明
1．打开仪器电源，同时打开电脑上操作软件。

2．在仪器操作面板上选择所需运行程序，点击进入。

3．放入样品，点击“Measure”。

测得读数会在仪器和操作软件上均有显示。

以Promega公司双荧光素酶检测试剂盒为例：
1. 试剂准备
按照说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、
Stop&Glo检测液。

2. 样品准备
按照说明书使用PLB细胞裂解液裂解细胞，取
20ul细胞裂解液
3. 检测过程
a) 在1.5ml离心管中加入20ul细胞裂解液，然
后加入100ul的LARII溶液，混合后放入发光检
测仪检测第一次发光值；
b) 然后加入Stop&Glo检测液，终止第一次发光，
同时开始第二次发光，混合后放入发光检测仪检
测第二次发光值。

4.测定完毕后，取出样品，保存数据，关闭电源。

注意事项：
（1）仪器盖子上含有电器元件，开关请轻开轻关；
（2）该仪器请保持干燥，不要泼溅任何液体，如不慎滴入液体，请立即擦干；（3）测定完毕后一定要记得保存数据；
（4）仪器如果出现任何故障，请不要擅自修理，请及时报告管理员，通知相关专业维修人员。

海肾荧光素酶近红外萤火虫荧光素酶腔肠荧光素等一系列荧光活体成像试剂用于肿瘤光热治疗活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。

这项技术已被广泛应用于多个领域，常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，许多大中型城市，乳腺癌已居女性恶性肿瘤死亡率的首位。

乳腺癌复发转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，淋巴结阴性的患者中约有24%～30%出现复发转移，淋巴结阳性的患者中复发转移率高达50%～60%，而转移性乳腺癌的5年生存率仅为26%。

萤火虫荧光素酶（Luciferase）是一种常用的信号分子，可以用来标记肿瘤细胞.一．细胞方法将带有荧光素luc转酶报告基因的真核表达重组质粒pRc/CMV2-7，利用G418筛选，获得稳染人乳腺癌细胞株MCF-7-luc，并在稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆MCF-7体外评价其发光能力。

通过建立裸鼠移植瘤模型，利用活体生物发光成像系统检测肿瘤生长及转移情况，为下一步监测裸鼠移植瘤对药物作用的变化情从而为分析药物对肿瘤的治疗效果提供理想的状况.G418筛选浓度的确定：37℃细胞培养箱中常培养,G418按0、200、400、600、800、1000μg/ml设置6个浓度梯度。

在细胞接种24h后，加入6孔板中，每个浓度设2个孔在10～14d内全部死亡。

每天观察细胞生长情况，死亡最低的G418浓度，即为筛选质粒转染克隆MCF－7细胞的浓度。

萤火虫发光原理
萤火虫是一种神奇的昆虫，它们能够在黑暗中发出独特的绿色光芒，这种光芒不仅美丽，而且非常有用。

那么，萤火虫是如何发光的呢？萤火虫的发光原理是化学发光。

萤火虫体内有一种叫做荧光素的物质，它是一种发光色素。

荧光素在萤火虫体内与一种叫做ATP的物质结合，形成了一种叫做荧光素酶的物质。

当荧光素酶与氧气结合时，就会产生一种叫做荧光素酮的物质，同时释放出能量，这种能量就是萤火虫发光的能量。

萤火虫的发光过程非常神奇。

当萤火虫需要发光时，它会通过神经系统控制荧光素酶的活性，使荧光素酶与ATP结合，形成荧光素。

荧光素酶和荧光素之间的反应是一个氧化还原反应，荧光素酶会将荧光素氧化成荧光素酮，同时释放出能量。

这种能量会被荧光素酮吸收，使荧光素酮处于激发态。

当荧光素酮回到基态时，就会释放出能量，这种能量就是萤火虫发光的能量。

萤火虫的发光过程非常高效，它能够将化学能转化为光能，而且不会产生热能。

这种发光方式被称为“冷光”，与人类发光方式不同。

人类发光方式是通过电流激发荧光粉发光，这种发光方式会产生大量的热能，效率很低。

萤火虫的发光原理不仅仅是一种自然现象，还有很多应用价值。

例如，萤火虫的发光原理可以用于生物荧光成像、生物传感器、生物
标记等领域。

此外，萤火虫的发光原理还可以用于研究生物化学反应、生物分子结构等方面。

萤火虫的发光原理是一种非常神奇的化学发光现象，它不仅美丽，而且有很多应用价值。

我们应该好好保护萤火虫这种神奇的生物，让它们在地球上继续发光。

荧光素酶实验步骤
内容:
一、实验材料
1. 含有报告基因的重组质粒
2. 适合该报告基因表达的宿主细胞
3. 转染试剂
4. 培养基和培养皿
5. 荧光素钠盐等化学发光底物
二、实验步骤
1. 将重组质粒转染入宿主细胞,培养过夜使其表达报告基因。

2. 将转染后的细胞接种到培养皿中继续培养。

3. 当细胞长到适当密度时,吸除培养基,用PBS轻轻洗涤细胞。

4. 在无血清的培养基中加入适量荧光素钠盐,轻轻洗涤细胞后加入培养皿中。

5. 暗箱中孵育5-30分钟,然后使用发光成像系统观察并拍照。

6. 也可以使用酶标仪检测培养皿中溶液的相对发光值。

7. 对照组为未转染报告基因的细胞进行上述步骤,作为背景值。

三、结果分析
1. 发光成像看到转染组细胞发出荧光,对照组无荧光。

2. 转染组样品的发光值明显高于对照组背景值。

3. 转染效率高、报告基因表达水平高的样品,荧光信号越强。

以上是荧光素酶报告基因实验的基本步骤和分析方法。

荧光素酶报告实验原理荧光素酶报告实验是一种常用的生物化学实验技术，用于检测目标分子的存在和活性。

荧光素酶是一种发光酶，能够将底物荧光素转化为发光产物，并通过检测发光强度来定量分析目标分子的含量。

本文将介绍荧光素酶报告实验的原理及其在生物学研究中的应用。

荧光素酶报告实验的原理主要包括两个部分：荧光素酶的特性和荧光素酶报告基因的构建。

首先，荧光素酶是一种特殊的发光酶，它能够催化荧光素的氧化反应，产生强烈的蓝-绿色荧光。

荧光素酶的基本结构包括活性中心和底物结合位点。

在存在底物荧光素的条件下，荧光素酶能够与底物结合形成酶-底物复合物，通过催化作用将荧光素氧化为激发态的荧光素，产生可见光发光。

荧光素酶的发光反应是一种高度特异性和灵敏度的生物化学反应，因此被广泛应用于生物学研究和生物医学诊断领域。

其次，荧光素酶报告基因是一种重要的分子生物学工具，用于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等生物学过程。

荧光素酶报告基因通常由荧光素酶基因和感兴趣的启动子或调控序列构成。

在转染或转化目标细胞或组织后，荧光素酶报告基因的表达水平可以通过检测荧光素酶的活性来间接反映感兴趣的基因的表达水平或启动子的活性。

荧光素酶报告基因的构建和应用为研究基因调控机制、筛选药物和分析蛋白质相互作用提供了重要的技术手段。

在生物学研究中，荧光素酶报告实验被广泛应用于基因表达调控、蛋白质相互作用、信号转导通路等方面的研究。

通过荧光素酶报告实验，研究人员可以定量分析感兴趣基因的表达水平，筛选调控基因表达的小分子化合物，研究蛋白质的相互作用及信号转导通路的活化和抑制机制。

荧光素酶报告实验的高灵敏度、高特异性和便捷操作使其成为生物学研究中不可或缺的实验技术之一。

总之，荧光素酶报告实验是一种重要的生物化学实验技术，通过荧光素酶的特性和荧光素酶报告基因的构建，可以实现对目标分子的定量检测和分析。

在生物学研究中，荧光素酶报告实验被广泛应用于基因表达调控、蛋白质相互作用和信号转导通路等方面的研究，为生命科学研究提供了重要的技术支持。