食品分析第十章蛋白质和氨基酸的测定第一节概述1.蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。
主要由C、H、O、N、S五种元素组成。
某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。
在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。
食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。
这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。
无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。
蛋白质的测定方法分两大类：一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。
具体测定方法：凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。
双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法国外：红外分析仪氨基酸总量——酸碱滴定法测定。
各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。
有多种氨基酸分析仪。
第二节蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。
书中列举了5种染料。
二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）第三节蛋白质的定量测定一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。
例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉9.5%，兔肉21%，鸡肉20%，牛乳3.5%，带鱼18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黄瓜1.0%，苹果1.4%测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。
•一些蛋白质的含氮量一般为15%~ 17.6%，有的上下浮动可以测出总氮N一、凯氏定氮法由Kieldhl 于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。
书中只介绍前三种。
16%N = N ×6.25 = 蛋白质含量（一）常量凯氏定氮法1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。
然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。
根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定1.消化总反应式：<1>加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。
也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。
2NH 2（CH 2）2COOH+13H 2SO 4（NH 4）2SO 4+6CO 2+12SO 2+16H 2O一定要用浓硫酸（98%）<2> 加硫酸铜作为催化剂。
还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。
还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。
<3> 加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。
仪器：219页要防止爆沸。
另外：介绍“自动回流消化仪”2. 蒸馏消化液+ 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。
3. 吸收与滴定<1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。
指示剂红色绿色红色吸收滴定（酸）（碱）（酸）<2> 用过量的H2SO4 或HCl 标准溶液吸收，再用NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。
•操作方法：158页，其中讲“以奈氏试剂”检查氨是否全部蒸完，以奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕+离子，遇铵根，离子析检验NH4出黄色或红棕色沉淀。
配制方法1、 3.5g KI+ 1.3g HgCl溶于70毫升2水。
加30毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。
方法2、溶解11.5 g HgI+ KI 10 g于适量少2许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。
•结果计算：158页注意：F——氮换算为蛋白质的系数，一般为6.25也可查表。
•说明：①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。
③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。
④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。
⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3 m1 后再继续加热消化。
⑥若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。
⑦—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。
有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
⑧蒸馏装置不能漏气。
⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
氢氧化铜在70～90℃时发黑。
⑩蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。
二、微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。
3、蒸馏装置见159 页图10-2 。
10-2 10-2三、自动凯氏定氮法1、原理及适用范围同前2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。
（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。
可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。
北京福德泰和科技有限公司产品名称：凯氏定氮仪二、双缩脲法传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。
新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。
1.原理脲（尿素）NH 2—CO —NH 2加热至150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。
（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键—CO —NH —与双缩脲结构相似。
在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。
（560nm ）NH 2—CO —NH —CO —NH 2+NH 3NH 2—CO —NH 2+NH 2—CO —NH 2注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。
样品不用消化2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。
本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。
3.主要仪器：分光光度计，离心机（4000r/min）4. 试剂：(1)碱性硫酸铜溶液(2)四氯化碳5．操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。
三．紫外吸收法1．原理：利用蛋白质的特有基团，R│（—NH—CH—CO）对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。
2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。
3．主要仪器：①紫外分光光度计②离心机（3000 —5000 r/min）4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线第五节氨基酸的定性测定•利用各种显色反应（170～174页）。
第六节氨基酸定量测定一．氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法—基，又有1.原理：氨基酸本身有碱性—NH2酸性—COOH 基，成中性内盐，加入甲醛—结合，碱性消失，再溶液后，与—NH2用强碱来滴定—COOH 基。
2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。
（适于食品中游离氨基酸的测定）3．双指示剂：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。
②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性红50%乙醇溶液，④0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
4．操作：同时取两份样：①+ 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。
②+ 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。
二者之差可计算氨基酸含量（二）茚三酮的比色法原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。
二．个别氨基酸的定量测定介绍了8种氨基酸的定量测定方法。
第七节氨基酸的分离与测定一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法）Thin Layer Chromatography简介：近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。
因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。
它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。
（一）原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等值，不同成分则有不作用，同一物质具有相同的Rf同的R值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目f的。
然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。
•R f = a / bab样点溶剂前沿点样原点•优点：①展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。
②层析后得到的斑点小而清晰。
③能够使用多种显色剂。
④点样量少，灵敏度高。
（比纸层析高10—100倍）精确到0.01ug。
⑤也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备层析。
值重现性比纸上层析差。
•缺点：Rf•分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。
（三）操作方法：①薄层板制备②样品液制备③点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原点。
再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔1～2cm。
