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TG电转感受态制备与主要影响因素

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高效TG1电转感受态 化转感受态的制备与主要影响因素

高效TG1电转感受态 化转感受态的制备与主要影响因素
加预冷10％甘油到总体积500ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离 心10min。 • 倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预冷10％甘油到总体积 250ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离心10min。 • 倒去甘油上清液，2.5ml的预冷10％甘油重悬菌体，用无菌枪头吸取100ul/管转 入1.5ml微量离心管中（离心管作好标记且在-80℃冻存至少半小时）。马上用 于电转或将离心管马上放入液氮中，冻存至少1小时，再放入-80℃冻存。
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
2020-04-12
• 相关概念 • 菌生长特点 • 实验原理 • 方法特点 • 实验步骤 • 影响因素 • 电转杯重复利用方法
一、相关概念
感受态细胞
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进 入的一种细胞状态。
电脉冲强度对电转化效率的影响
• 电场强度的影响机制 较为复杂 ，目前还 不是 十分清楚。 Kimoto的研究表明：电脉冲前 ，DNA和细胞是随机分布 的 ；电脉冲早 期，DNA 和细胞向阳极运动 ；电脉冲的 后期 ，DNA插入细胞的外膜或者进一步进 入细胞质问 隙 ；随后在 37℃孵 育期 问 DNA渗透通过 内膜进入细胞浆 。高场强下 ，可瞬间击穿细胞壁和质膜 ，形成能通过外 源物质 的跨膜 孔道；而低场强的作用下 ，需累计电荷达 到一定的强度，才可作用于质膜 ，形成孔道 ，这样易使 已形成孔道的细胞因内含物外流而引起死亡 。所以选择 合适的脉冲强度对外源 DNA的导人非常关键 。
质粒DNA不同量时对E.coli转化效率影响
质粒 DNA的结构 、大小 、含量对电转化效率的 影响也很大。选用 pUC19作为质 粒材料，就其含量对电转化效率的影响进行了探讨 ：在 40ul菌液加 入 了 4种不 同含量 的质 粒 DNA，分 别 为 0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng，结 果 表 明 用 量 为1.0 ng质粒 DNA时，电转化效率最高 ，而且电转化 效 率与 外 源 DNA 的含 量 在 一 定 范 围 内成 正 比 ；但当加入 的外源DNA的量过多或体积过大时，则 会 使转化效率下降。即 DNA溶液 的体 积不应超过感受态细胞体积 的5 %，1 ng 的质粒 DNA 即可使 50ul的感受态细胞达到饱和 。

△Tg影响因素分析及改善

△Tg影响因素分析及改善

△Tg影响因素分析及改善祝锁郝聪颖李俊莹【摘要】摘要多层压合是多层板生产中的重要制程，聚合度的控制是影响多层板品质的重要指标，聚合度低会造成PCB在使用过程中的一系列的可靠性风险，而△Tg是目前衡量聚合度的主要手段，本文从理论角度分析影响聚合物聚合度的主要因素入手，并通过实验测试的方式对影响固化程度的条件进行确认，希望能够对于大家有所启发。

【期刊名称】印制电路信息【年(卷),期】2014(000)004【总页数】7【关键词】关键词多层压合；聚合度；固化因素1 背景多层板的压合过程是半固化片中的聚合物单体或低聚物聚合成高分子聚合物的过程，也是整个PCB生产流程中的重要环节，衡量压合过程好坏的重要指标是固化程度（即高分子的聚合度），聚合度不满足要求的PCB会在下游的加工或使用过程中出现一系列的可靠性问题，例如：衡量聚合度高低的重要的指标为△Tg，通常情况下，对于传统FR4板材，△Tg 的规格限为≤3 ℃。

基于△Tg对于可靠性的严重影响，许多下游的SMT厂商对于△Tg的要求，也越来越严格，TPC在2013年的一次样板认证过程中，就遇到了这样的问题，客户要求使用Tg150的无铅板材，同时要求△Tg≤3 ℃，而样板实际测试的△Tg却达到了5.33 ℃，造成样品认证不合格，因为，此客户为TPC新导入的客户，样品认证不合格将直接导致认证过程失败，这对TPC将意味着巨大的经济损失，为了分析造成的△Tg不合格的原因，并保证补做的样品顺利通过认证，因此我们对此进行了立项，并对影响△Tg的因素进行了系统的分析及研究。

2 概念及测试方法为了帮助大家对于△Tg更好的理解，下面先对Tg及△Tg的概念进行简单的阐述：高分子聚合物不同于无机物，没有固定的组成，而是由一系列不同聚合度的分子链构成的，这种特点决定了高分子聚合物没有固、液、气三态的变化，同时也决定了高分子聚合物没有熔点及沸点的概念，取而代之的是，高分子聚合物存在力学三态的变化，分别是玻璃态、橡胶态、粘流态，处于这三种力学状态下的高分子聚合物主要的区别是不同力学状态下弹性模量的变化，直观的表现则是，施加外力后，形变量的大小，图2为对一高分子聚合物样品施加一定的外力后，在等速升温的过程中，对形变量进行测量，取得的温度——形变曲线，又称为热-机械曲线。

电转化注意事项

电转化注意事项

电转化注意事项作者: global.wun(站内联系TA)发布: 2009-10-20一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min ）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。

如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP 管分装，-70 或-80 摄氏度保存。

另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

电转化注意事项

电转化注意事项

电转化注意事项作者: global.wun(站内联系TA)发布: 2009-10-20一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。

1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其O D值是否呈线性关系）。

每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。

高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。

正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。

可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。

3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。

用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。

整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。

山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。

三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。

如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或-80 摄氏度保存。

另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48 小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

trans1感受态制备

trans1感受态制备

trans1感受态制备感受态制备是一种心理训练方法，通过调整自身的情绪和心态，来提升自己的幸福感和生活质量。

在现代社会中，人们常常面临各种压力和困扰，感受态制备可以帮助我们更好地应对这些挑战，保持积极向上的心态。

感受态制备要求我们学会关注当下的感受和情绪。

我们常常被过去的遗憾或未来的担忧所困扰，而忽视了眼前的美好。

通过感受态制备，我们可以训练自己专注于当下的感受，享受每一个瞬间的美好。

比如，当我们在大自然中散步时，可以专注于呼吸的感觉、阳光的温暖以及风吹过皮肤的感觉，这样可以帮助我们放松身心，提升幸福感。

感受态制备可以帮助我们调整消极情绪。

每个人都会遇到生活中的挫折和困难，这些困难可能会导致我们产生消极的情绪，如焦虑、沮丧等。

通过感受态制备，我们可以学会观察和接纳这些情绪，而不是逃避或抵抗。

当我们能够正视自己的情绪，接受自己的内心感受时，我们就能够更好地处理困境，找到解决问题的方法。

感受态制备也可以帮助我们培养积极的心态。

积极心态是成功和幸福的关键。

通过感受态制备，我们可以训练自己寻找和欣赏生活中的积极方面。

比如，当我们遇到挑战时，我们可以关注自己的成长和进步，而不是过分纠结于失败或困难。

这样的心态可以激发我们的内在动力，推动我们不断前进。

感受态制备还可以帮助我们建立良好的人际关系。

通过关注他人的感受和情绪，我们可以更好地与他人建立连接和共情。

当我们能够倾听他人的需求和感受时，我们就能够更好地满足他人的需求，建立起良好的人际关系。

而良好的人际关系又是幸福和满足感的重要来源之一。

感受态制备是一种重要的心理训练方法。

通过关注当下的感受和情绪，调整消极情绪，培养积极心态，建立良好的人际关系，我们可以提升自己的幸福感和生活质量。

在现代社会中，我们常常面临各种挑战和困扰，而感受态制备可以帮助我们更好地应对这些问题，保持积极向上的心态。

因此，学会并运用感受态制备是非常重要的。

希望大家都能通过感受态制备，拥有一个幸福美满的生活。

感受态几种制备方法及效率比较

感受态几种制备方法及效率比较

感受态(2011-04-14 10:45:00)转载▼标签：杂谈方法一A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。

将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。

划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。

用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。

取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。

洁净是最重要的。

无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。

离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。

涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。

涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。

预冷是必要的。

整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。

高效TG1电转感受态 化转感受态的制备与主要影响因素17页PPT

高效TG1电转感受态 化转感受态的制 备与主要影响因素
1、 舟 遥 遥 以 轻飏， 风飘飘 而吹衣 。 2、 秋 菊 有 佳 色，裛 露掇其 英。 3、 日 月 掷 人 去，有 志不获 骋。 4、 未 言 心 相 醉，不 再接杯 酒。 5、 黄 发 垂 髫 ，并怡 然自乐 。
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联

影响Tg的因素


的Tg = 150℃。
3
The flexibility of main chain
Isolated double bond孤立双键
C-C Single bond单键
Conjugated double bond 共轭双键
主链柔性
Tg
-Si-O- > -C-O- > -C-C-
CH3
Si O n
CH3
共聚作用
共聚物的Tg介于两种(或几种)均聚物的Tg之间，并随其中 某一组分的含量增加而呈线性或非线性变化。
如果由于与第二组分共聚而使Tg下降，称之为“内增塑 作用”
例如：苯乙烯(聚苯乙烯的Tg＝100℃)与丁二烯共聚后， 由于在主链中引入了柔性较大的丁二烯链，所以Tg下降。 共聚物的Tg可用如下Fox方程计算：
-H -CH3 -C6H5
9
(C) 侧基数量
①.若是刚性侧基，则数量大，Tg上升
SBR 中 S 含量 10 30 60 70 80
Tg（℃） -80 -72 -24 -4 14
10
②.若是柔性侧基，则侧基大，Tg下降
聚丙烯
-CH3
-20
聚丁烯-1
-CH2-CH3
-24
聚戊烯-1
-CH2-CH2-CH3
n
CH3
CH2 C n CH3 12
分子间作用力
极性：极性越大，Tg越高。 CH2 CH n Cl 87oC
CH2 CH n
CN
104oC
氢键：氢键使Tg增加。
O
O CH2 O C
6
O
H
H
N CH2 N C
6
离子键：使Tg增加。
O

电转感受态制备

电转感受态制备一、试剂准备（2L为例）大肠杆菌菌株1管、无抗性平板1个、500ml灭菌离心管4个、1ml、200ul灭菌枪头各一盒，0.5ml灭菌离心管一盒（约500个）、灭菌ddH2O 6瓶、500ml 10%甘油、5ml灭菌枪头5个、40ml LB培养基1瓶、250ml LB培养基8瓶。

二、制备过程1．菌株活化，将大肠杆菌菌株划线，37℃温箱，过夜，待其生长为单克隆后放在冰箱中，24小时内挑单克隆；2．挑单克隆至40ml LB培养基，37℃摇床，250 r/m过夜；3．扩大培养，每250 ml LB培养基接菌液4-5ml，37℃摇床，待其菌液OD值在0.4-0.5之间（绝对不超过0.6）时取出菌液放置于冰上冰浴15-20min；4．（以下在低温无菌下操作）将菌液转移至预冷的500ml灭菌离心管中，（预冷离心机）4℃，7000转离心10min，同时在冰上预冷ddH2O；5．弃上清，将剩余菌液至500ml灭菌离心管中，重复4；6．加如约20ml预冷ddH2O，5ml枪吹打均匀（5ml灭菌枪头预冷）后，加入约300ml 预冷ddH2O平衡后重复4（转速加到7500）；7．弃上清，重复6（转速加到8000，4离心管合成2离心管,时间延长为12min）；8．弃上清，加入20ml预冷10%甘油，吹打均匀，2离心管合成1离心管，加入约400 ml预冷10%甘油，用水平衡另一离心管后8500离心15min9．弃上清，看情况加入2-4ml10%甘油，用枪将菌液搅匀；10．分装，用分装枪分装，每管约20ul，注意分装枪充电；11．分装后将感受态放置在液氮中速冻5min后置于-70℃冰箱中待用；12．转化效率验证，取一管感受态，100ng质粒，电转，涂皿，计算转化效率。

三、附：培养基配方（1L）：酵母粉：5g蛋白胨：10gNaCl:：10g500ml离心管、量筒、烧杯、玻璃棒要经过严格清洗：自来水2遍、蒸馏水3遍、ddH2O3遍500ml灭菌离心管、1ml、200ul灭菌枪头、0.5ml灭菌离心管用前必须在-20℃冰箱中冰冻，灭菌ddH2O、10%甘油用前必须在冰上冰浴至低温。

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究_朱森康


2011 年第 10 期
朱森康等： 制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究
207
pUC18 均为本实验室保存。 1. 1. 2 主要试验仪器及培养基 分光光度计 Ultrospec 3300 pro 购自 Amersham Biosciences（ Sweden） 。 0. 2 cm 电击杯和 gene Pulser II 电脉冲基因转移仪 均购自 Bio-Rad 公司。LB 培养基： 1% （ W / V） 蛋白 胨，0. 5% （ W / V ） 酵 母 粉，1% （ W / V ） 氯 化 钠。 SOC 培养基： 2% （ W / V） 蛋白胨，0. 5% （ W / V） 酵 母粉，0. 05% （ W / V） 氯化钠，0. 186 g / L 氯 化 钾， 0. 95 g / L 氯化镁，3. 6 g / L 葡萄糖。甘油为国产分 析 纯，氨 苄 青 霉 素 （ Amp ） 购 自 TaKaRa 宝 生 物 公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 感受态细胞的制备 从新鲜活化 LB 平板 上挑取单菌落，接种于 50 mL LB 培养基中，37℃ ， 220 r / min 振 荡 培 养 过 夜 制 备 种 子 液。种 子 液 按 1% 转 接 到 一 定 装 液 量 的 LB 培 养 基 中，37℃ ， 220 r / min 振荡培养。培养一定时间，测定菌液浓度 OD600 达 到 一 定 值 后，取 出 培 养 三 角 瓶，冰 浴 冷 却 20 min，4℃ ，5 000 r / min 离心 15 min，倾去上清液； 将细胞重悬于预冷的去离子水中，4℃ ，5 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。再将细胞重悬于预冷 的 10% （ V / V） 甘油溶液中，4℃ ，8 000 r / min 离心 10 min，重复清洗 3 次。最后细胞用 1 /1 000 初始菌 液体积的预冷 10% （ V / V） 甘油溶液重悬，100 μL 分 装至 1. 5 mL 离心管中，保存于 － 85℃ 备用。 1. 2. 2 电转化及转化效率的计算 取 100 μL 感受 态细胞，冰上融化后，迅速加入 1 ng pUC18 质粒，转 入预冷的电击杯（ 间隙 0. 2 cm） 中，一定电场强度电 击 后 迅 速 加 入 900 μL 37℃ SOC 培 养 基，37℃ ， 220 r / min 培养一定时间。以一定倍 数 稀 释 后，取 100 μL 菌液涂布于 Amp 抗性平板上，37℃ 恒温培 养过夜，菌落计数后按下式计算转化效率。转化效 率（ CFU / μg DNA） = （ 每皿转化子平均数 × 10 × 菌 悬液稀 释 倍 数） / 质 粒 微 克 数，每 一 样 本 同 时 转 化 3 份。
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电转时注意事项
1.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在 无菌条件下进行, 所用器皿,所有的试剂都要灭菌, 且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污 染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 2.感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到 其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅 速。 3.为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。 4.电击完之后一定要温浴50-60min。
质粒DNA不同量时对E.coli转化效率影响
质粒 DNA的结构 、大小 、含量对电转化效率的 影响也很大。选用 pUC19作为质 粒材料，就其含量对电转化效率的影响进行了探讨 ：在 40ul菌液加 入 了 4种不 同含量 的质 粒 DNA，分 别 为 0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng，结 果 表 明 用 量 为1.0 ng质粒 DNA时，电转化效率最高 ，而且电转化 效 率与 外 源 DNA 的含 量 在 一 定 范 围 内成 正 比 ；但当加入 的外源DNA的量过多或体积过大时，则 会 使转化效率下降。即 DNA溶液 的体 积不应超过感受态细胞体积 的5 %，1 ng 的质粒 DNA 即可使 50ul的感受态细胞达到饱和 。
E.coli DH5a在不同时间的转化效率
•
注：
E.coli TG1在不同时间的转化效率
•
电击杯间隙为 0．2 cm
注：
E.coli 在对数期不同时间的转化效率探讨
• 选用对数生 长期 的细胞的感 受态细胞是提高电转化效率 的一个重要的因素。 如果选择没有达 到对数生长期或超过对数生长期的细胞，转化效率很低 。对 对 数生长期大肠杆 菌菌株 (A600nm 在 0．2 ～ 1．0之间)的电转化效率作 了比 较 ，通过E. Coli的生长曲线图可 以 看 出 两 种 菌 株 的 生 长 趋 势 基 本 一 致 ，只 是 在 前 、中 、后期 的持 续 时 间 存 在 差 异 。结 合 E.coli 在 不同时间的转化效率可 以看 出，在相 同条件下制备的感受态细胞 ，大肠杆 菌 (Escherichia coli)TG1在 A600nm为 0．5～0．7之 问时，其转化率明显高 于其它时期 ；而 E．coli DH5a 则有两个峰值：在 A600nm在 0．3～0．5之间 和 0．7～0．9 之间，即处于对数生长早期和后期 。并且 DH5a的 最大转化 率 比TG1的要高。这是由于菌株大小、形 状 、细胞壁 和细胞 膜组成不 同， 导 致对 相 同强 度 的电 脉冲敏感程度不一样 ，而且 各时期 的活 细胞数目也 不相同，所以不同菌株在不同时期的转化效率各异。
• •
各方法特点
一般的构建重转化 方法是最佳的途径。
E. Coli的生长曲线
• 从 0～4 h，测定 E. coli的细菌浓度(A600nm )，绘制对 数 期 生 长 曲线 (A600nm≤ 1)，如 图所 示 。 E. coli TG1和 E. coli DH5a的 生 长 曲 线 均 在 100min后开始 成对数生长趋势 ，在100～15O min之间， E. coli TG1菌株的生长速度 比 E. coli DH5a菌 株快。
电脉冲强度对电转化效率的影响
• 电场强度的影响机制 较为复杂 ，目前还 不是 十分清楚。 Kimoto的研究表明：电脉冲前 ，DNA和细胞是随机分布 的 ；电脉冲早 期，DNA 和细胞向阳极运动 ；电脉冲的 后期 ，DNA插入细胞的外膜或者进一步进 入细胞质问 隙 ；随后在 37℃孵 育期 问 DNA渗透通过 内膜进入细胞浆 。高场强下 ，可瞬间击穿细胞壁和质膜 ，形成能通过外 源物质 的跨膜 孔道；而低场强的作用下 ，需累计电荷达 到一定的强度，才可作用于质膜 ，形成孔道 ，这样易使 已形成孔道的细胞因内含物外流而引起死亡 。所以选择 合适的脉冲强度对外源 DNA的导人非常关键 。
TG1电转感受态细胞的制备
• • • • • • 用10ul无菌枪头挑取TG1单克隆划线接种于2YTG板(2YT培养基中加2％的葡萄 糖)，37℃过夜培养。 挑取TG1单克隆到25ml 2YT培养基中，250rpm、37℃过夜培养。 早上将摇过夜的菌液分别取5ml接种于2个500ml的2YT培养基中，250rpm、 37℃摇到OD600≈0.6。 下面的操作全部在冰上进行： 将摇好的菌液在超净台中分装到2个无菌的 500ml 离心杯中，4℃、3000rpm离心10min。 在超净台中小心倒去上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预冷10％甘油 到总体积500ml。4℃、3000rpm离心10min。 倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，将菌液转到一个离心瓶中。 加预冷10％甘油到总体积500ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离 心10min。 倒去甘油上清液，10ml的预冷10％甘油重悬菌体，加预冷10％甘油到总体积 250ml。另一个离心瓶用水平衡。4℃、3000rpm离心10min。 倒去甘油上清液，2.5ml的预冷10％甘油重悬菌体，用无菌枪头吸取100ul/管转 入1.5ml微量离心管中（离心管作好标记且在-80℃冻存至少半小时）。马上用 于电转或将离心管马上放入液氮中，冻存至少1小时，再放入-80℃冻存。
电转杯清洗
1.先用清水将电击杯冲洗一下。 2.75%酒精浸泡至少2h。 3.弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后 用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍 以上。 4.无水乙醇中浸泡至少30分钟。 5.弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。 6.将清洗好的电击杯放入-20 入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它 是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
二、实验原理
化学方法
CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是： 细胞处于 0 ～ 4 ℃的CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。 转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细 胞表面，经 42 ℃、90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。 DNA分子通过复制、表达、实现遗传信息的转移，使细胞获得新的遗 传性状。常制备的感受态菌株：DH5α 、TOP10、DE3、JM109等。
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
2014-12-23
• 相关概念 • 实验原理 • 方法特点 • 实验步骤 • 影响因素
一、相关概念
感受态细胞
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进 入的一种细胞状态。
电转化法
电转化法利用瞬 间高压电脉 冲，使 细胞表面产生暂时性 的孔 隙， 可在细胞 膜表 面形成小孔 ，同时 由于电击作用可促 使细胞膜 融 合 ， 最后 在细胞膜上 形成大 的孔 道，易于 DNA 进入 。常制备的感受态 菌株：TG1。
化学感受态细胞制备
• 取－70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃ 培养过夜。 • 第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中， 37℃振荡培养过夜。 • 次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，37 ℃剧 烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。 • 当菌落600nm OD值达到0.3－0.4时，将烧瓶取出放置冰上10~15分 钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,4000g离心10分钟。 弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。 • 加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。 4℃,4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残 留的培养液. • 加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体。每管0.2ml分装，至4℃ 保存备用，24－48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于 －70℃的低温冰箱中。