家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PC_省略_GE和16SrDNA文库序列分析_相辉

青海省不同生态区蚕豆根瘤菌16S rDNA分析张小娟【期刊名称】《干旱地区农业研究》【年(卷),期】2018(036)004【摘要】为了阐明青海省蚕豆根瘤菌的遗传多样性和亲缘关系,同时为发现和获得新的根瘤菌物种提供资源,采集和分离了青海省不同生态区蚕豆主栽品种青蚕14中的根瘤菌,并对其中分离到的6个菌株(CD1～6)进行16S rDNA鉴定分析.将6株蚕豆根瘤菌的全序列结果与NCBI中已报道的序列进行相似性比对,发现其相似度较高,其中供试菌株CD4与KF008225.1相似度最高,达到98％,其余均在95％到96％之间.6株供试菌分属4个菌属,CD1和CD2共属节细菌属,CD3属于分枝杆菌属,CD4和CD5属于快生根瘤菌属,CD6属于中慢生根瘤菌属,表明来自不同地区的蚕豆根瘤菌存在较大差异.聚类分析结果显示,蚕豆根瘤菌的6个菌株分属5个不同系统发育分支,证明青海省不同生态区蚕豆根瘤菌种类多样性较为丰富.【总页数】5页(P259-263)【作者】张小娟【作者单位】青海大学生态环境工程学院,省部共建三江源生态与农牧业国家重点实验室,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S154.38+1【相关文献】1.不同刺槐种源根瘤菌16S rDNA的PCR-RFLP分析 [J], 张泽坤;韩骞;杨敏生;王进茂2.日照大豆、菜豆根瘤菌的16S rDNA多样性分析 [J], 马晓凡;李林3.我国蚕豆根瘤菌的数值分类及其16S rDNA PCR-RFLP研究 [J], 路敏琦;李俊;李力;姜昕;陈强4.含羞草、山蚂蟥等几种豆科植物根瘤菌的数值分类及16S rDNA PCR-RFLP分析 [J], 刘晓云;魏爽;刘庆辉;王立江;郭振国;郅慧梅5.利用16S-23S rDNA RFLP及16S rRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆(Vigna umbellata L.)根瘤菌系统发育的研究 [J], 潘峰;王平;胡正嘉;何绍江;冯新梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

DOI ：10.3969/j.issn.2095-1205.2016.05.01第50卷第5期2016年5月广东蚕业GUANGDONG CANYEVol.50,No.5May.2016家蚕作为我国重要的特种经济动物，在我国脱贫致富和国家出口创汇中发挥着特殊的作用。

但家蚕容易感病和饲料效率低是影响养蚕业发展的主要问题，因此增强家蚕的抗逆性和抗病性，提升叶丝转化率，提高蚕茧的产量和质量一直是养蚕业努力的方向。

近年来，微生态学得到较快的发展，肠道微生物在动物生长发育中所扮演的角色越发引起人们的重视。

随着家蚕等昆虫的肠道微生物种类和功能的研究不断深入，发现肠道微生物在昆虫的营养吸收、抵御病原微生物和促进机体免疫功能等方面都发挥了重要作用。

利用肠道益生菌作为饲料添加剂的研究也取得了较大进展，方丹等分离了鸡的肠道微生物并发现其中乳酸菌（lactobacillus ）有抑制沙门杆菌（Salmonella ）的效果，而且可促进鸡的生长。

将益生菌体外培养制成微生态制剂添加到饲料中，能提高畜禽的免疫能力和消化能力，增产增收。

顾金刚等研发了由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）和黑曲霉（Aspergillusniger ）组成的复合菌剂，能分别提高猪的日增重和鸡的生长速度。

家蚕肠道微生物的研究也有了可喜的进展，周洪英等介绍了关于家蚕肠道微生物对增强蚕体体质和提高吐丝量等有良好的效果。

除提高蚕茧产量外，以家蚕为模式动物研究肠道微生物的作用机理，对研究鳞翅目昆虫肠道微生物的功能和农作物害虫防控方面也将有重要的指导作用。

随着家蚕基因组计划的完成和生物技术研究的迅速发展，分子生物学技术的应用为肠道微生物的研究带来便利，也促进其快速的发展。

家蚕肠道微生物的研究也得到不断的推进，本文就家蚕肠道微生物的类群、肠道微生物的功能和影响肠道微生物生存的因素等方面对其进行综述，展示家蚕乃至昆虫的肠道微生物的最新研究进展。

1家蚕肠道微生物的类群家蚕肠道微生物的研究进展郝志华朱佳林黄志君（华南农业大学动物科学学院，广东广州510642）摘要家蚕肠道中存在着丰富的微生物群体，肠道微生物在家蚕消化吸收和抵御外界病原菌等方面都扮演着重要的角色，随着家蚕的生长发育，其肠道微生物也不断的变化，优势菌群的分布与家蚕的正常生长息息相关。

摘要本文采用数值分类、ＢＯｘ－ｐＣＲ、１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＲＦＬｐ、ＩＧＳＰＣＲ．ＲＦＬＰ、１６ＳｒＤＮＡ全序列测定分析、交叉结瘤和抗逆研究等实验技术，首次系统地对我国不同生态条件下蚕豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育进行了研究。

飙我国山西、四川、青海等ｉ１个省２４个地区，进行蚕豆根瘤豹采集。

经过分离、纯化、回接确定了７３株蚕豆根瘤菌代表菌株。

采用ＢＯｘｏｃＲ技术对这７３株蚕豆根瘤菌进行了多样性研究，同时和１４株参比菌株进行了比较，其指纹图谱分析聚类后，供试的蚕豆根瘤菌在７０％的相似水平上分成１８个群和５个独立分支；在此基础上选择５０株供试菌株及１１株参比菌株进行了１３８项生理生化特性测定。

去除全同性状后聚类结果表明：在８１％的相似水平上供试菌株分为４个群，除群２含有参比菌外，其他３个群均由蚕豆根瘤菌组成，且各群都存在地区交叉：基于表型特征的测定结果，选取２５株蚕豆根瘤菌代表菌株与１ｌ株参比菌株进行了１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ．ＲＦＬＰ分析，试验菌株在８５％相似水平上聚成４个聚类群，聚类结果与数值分类的聚类结果有很好的一致性；ＩＧＳＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析结果表明，供试菌株在７０％水平上分成６个遗传群，与１６ＳｒＤＮＡＲＦＬＰ分析结果比较，ＩＧＳＲＦＬＰ反映的多样性更明显，形成的遗传群较多，可用于菌株的鉴别；测定了数值分类３个群的中心菌株）（Ｚ．ｓｘ０１．６、ＳＣ－ＨＹｌ、Ｓｘ＿ＹＸｌｌ和另外两个代表菌株ｓＣ．ⅥＵ和ＳＸ．ＹＸｌ５的１６ＳｒＤＮＡ的全序列，与１５株己知菌的基因序列比对分析，５株蚕豆根瘤菌的序列与参比菌株Ｒ．１ｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍＵＳＤＡ２３７０的相似性达９９．９％。

可确认这些试验菌株蚕豆根瘩菌属于Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属豌豆生物型；选择１９株蚕豆根瘤菌和５株参比菌株进行了抗逆性实验，发现分离自广西的菌株ＣＣＢＡＵ５３０７２能在３％ＮａＣｌ的平板上生长，在口Ｈ１１．０的条件下亦能生长，但长势相对较弱，其它菌株也表现出不同程度的耐受性。

动物学报48（3）：375~383，2002Acta Zoolo g ica Sinica家蚕线粒体ND2、CO !和若干tRNA 基因的克隆及序列分析!廖顺尧刘运强鲁成!!周泽扬向仲怀（西南农业大学蚕桑丝绸学院，农业部蚕桑学重点开放实验室，重庆400716）摘要克隆并测定了家蚕（Bomb y x mori ）线粒体基因组3468b p 的Eco R !和Hind "双酶切片段序列，根据序列同源性比较，该DNA 片段包括3个蛋白质编码基因：ND2基因、CO !基因和CO #基因5'端399b p 的序列，以及6个IRNA 基因和一个尚待确定的IRNA MeI 基因。

家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约69.7%，CO !基因的同源性约83.8%，CO #基因5'端的同源性约80%，这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶基因保守。

6个推定的IRNA 基因序列与果蝇相应IRNA 基因序列差异较大。

另外，除IRNA GIn 基因的二级结构相似外，其它IRNA 基因的二级结构与果蝇相应IRNA 基因的二级结构也有较大差异。

关键词家蚕线粒体基因组3.5kb 片段基因组成基因结构2000-12-05收稿，2001-01-15修回!国家自然科学基金（30170719）资助项目!!通讯作者E-maiI ：Iuchen g @swau.c g .cn第一作者简介廖顺尧，女，28岁，博士。

研究方向：蚕桑生物化学与分子生物学。

E-maiI ：Iiaosh y @线粒体DNA 的发现，为核外遗传系统的研究展开了新的一页。

动物线粒体DNA 是共价闭合的环状双链DNA ，分为重链（H 链）和轻链（L 链），分子量较小（15~20kb ）。

一般动物线粒体基因组包括13个编码疏水性蛋白质亚基基因、22个IRNA 基因、2个rRNA 基因和非编码序列（包含复制起点区域）。

其中，除一个蛋白质基因（ND6）和8个IRNA 基因由L 链编码外，其余都由H 链编码。

四株细菌纤维素生产菌株16SrDNA序列分析及生产性能比较研究邹小周;曹张军;陈琳;洪枫【期刊名称】《纤维素科学与技术》【年(卷),期】2018(026)004【摘要】对实验室筛选保藏的DHU-HL-Z1、DHU-HL-Z2和DHU-HL-Z3三株细菌纤维素(bacterial nanocellulose,BNC)生产菌株和对照菌Komagataeibacter xylinusATCC 23770进行16SrDNA序列分析以及BNC生产性能比较.序列分析结果显示三株菌均属于木葡糖醋杆菌K.xylinus,与已报道的多株BNC生产菌株亲缘性较近.该三株菌的产量(12.8～14.8 g/L)均明显高于8.7 g/L(p>0.05).DHU-HL-Z1和DHU-HL-Z2所产BNC的结晶度(87.64％和86.65％)明显高于对照菌ATCC 23770(62.34％).凝胶膜力学性能方面,DHU-HL-Z2、DHU-HL-Z3和DHU-HL-Z1的杨氏模量分别为130 KPa、96 KPa和39 KPa,均高于ATCC 23770的23 KPa.结果表明三株保藏菌优良性能,在BNC研究和生产领域具有很好的利用价值.【总页数】9页(P1-8,38)【作者】邹小周;曹张军;陈琳;洪枫【作者单位】东华大学化学化工与生物工程学院,上海201620;东华大学化学化工与生物工程学院,上海201620;东华大学化学化工与生物工程学院,上海201620;东华大学化学化工与生物工程学院,上海201620【正文语种】中文【中图分类】Q81;O636.1【相关文献】1.利用16SrDNA序列分析和Biolog快速鉴定方法鉴定产脂肪酶菌株 [J], 张朝正;郭兰珍2.鞘氨醇单胞菌N1菌株的16SrDNA序列分析和溴氨酸降解的动力学 [J], 李莹;庄源益;蔡宝立3.降解烟碱的YC-68菌株16SrDNA序列分析及鉴定 [J], 袁仕豪;陈秀春;陈宇;易建华;沈卫国;莫湘涛4.根瘤菌新类群代表菌株的16SrDNA全序列测定及其系统发育地位 [J], 谭志远;陈文新5.石油降解菌株G516SrDNA全序列的系统学分析 [J], 洪斌;王丽非因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

利用de novo测序分析蚕豆瓣酱醅微生物多样性周评平;李治华;董玲;赵驰;朱永清【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2018(031)005【摘要】[目的]分析蚕豆瓣醅微生物多样性并比较与过去采用16S、ITS等扩增子测序的差异.[方法]利用de novo测序方法研究微生物菌群多样性.[结果]嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)是蚕豆瓣酱醅的优势微生物,相对丰度占一半以上(mOTUs方法为64.26％,Metaphlan2方法为50.80％),Metaphlan2方法发现破布子乳酸菌(Lactobacillus pobuzihii)也是优势菌株,其相对丰度为17.60％,另外,存在大量未分离到的微生物有待进一步研究.[结论]该方法能分析到蚕豆瓣醅微生物中种或菌株的水平,研究结果不仅为后续深入研究提供了技术支撑,而且对郫县豆瓣的微生物安全性评价提供了有效的方法.【总页数】3页(P1055-1057)【作者】周评平;李治华;董玲;赵驰;朱永清【作者单位】四川省农业科学院,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066;四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都610066【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.利用de novo组装策略解析猪的基因组变异 [J], 田仕林;唐茜子;李学伟;李明洲2.一株耐受蛋清蛋白的鸡蛋腐败菌S菌株的分离鉴定及其De novo测序分析 [J], 张璟;陈倩;顾丽红;阮瑶;张新帅;郭爱玲3.应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析巴东地区豆瓣酱中微生物多样性 [J], 赵馨馨;崔梦君;董蕴;倪慧;单春会;郭壮4.基于高通量测序分析玉米黄酒微生物多样性 [J], 李永翔;蒋海娇;郭建华5.不同来源及不同发酵阶段豆瓣酱微生物多样性的比较分析 [J], 杨帆;邓维琴;李恒;唐浪;马嫄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第三章应用１６ＳｒＤＮＡ序列探讨斑腿蝗科的单系性及其亚科睦坌类地位
圈丑ｌ■亚目臣虫１６ＳｒＤＩ＾碱基譬代慵况
ＦｌＥ．３．１ＰａＳｔａｓｏｆＪａｂｓｔ［ｔｕｔｉｍｅ。

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１６ＳｒＤＮＡ“＾’’代寰转攮．“·”代表篡丧［¨Ａ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｔｒａａｓｉｆｉｅ船硼“·”ｚ印ｒｅｓｅｘｔ把峭他垲ｉｏ船】
可以看出本研究中的１６ＳｒＤＮＡ碱基变异是颠换多于转换，且随着差异程度的增加，转换明显出现了饱和。

ＰＴＰｔｅｓｔ的结果表明用原始数据构建的简约树的树长明显比随机数据的短（ｐ≤０．００１），说明我们的数据符合简约假设。

所有的原始数据均含有较强的发育信息，可以用于系统发育分析的研究。

用Ｍｅｇａ软件分析碱基替代数和序列歧异，经Ｔａｍｕｒａ．ｎｅｉ模型校正后的转换颠换比（ＴＳ／ＴＶ）平均为Ｏ．７２３，颠换值比转换值平均还要高：经Ｔａｍｕｒａ—ｎｅｉ模型校正后的序
列歧异值平均为０．１５５。

利用ＭｒＢａｙｅｓ软件分析时根据对贝叶斯老化曲线的观察，将开始的２０，０００代作为老化数据舍弃，两次独立贝叶斯分析得到的碱基替代模型参数如表３３所示，两次分析得到的模型参数基本一致，表明马尔科夫链是收敛的，可以相信贝叶斯法的分析结果。

在６种碱基替换类型中，Ａ和０间的替换速率最高，其次是Ｃ和Ｔ
间的替换，这两种都是转换类型，而其它４种颠换类型发生的频率明显比这两种转换类型低得多。

家蚕肠道菌的多样性及研究方法进展
赵明晗;陈芳敏;夏琬婷
【期刊名称】《现代畜牧科技》
【年(卷),期】2024()4
【摘要】家蚕作为重要的经济昆虫和鳞翅目模式昆虫,近年对家蚕肠道菌结构和功能多样性的研究成为热点。

研究发现家蚕的品种、性别、龄期及不同的环境和饲养条件下家蚕肠道菌群数量和种类差异较大,且优势菌群也不尽相同。

该文介绍了家蚕肠道菌群结构、功能及研究方法的多样性研究进展,分析了肠道菌群的影响因素,对理解肠道菌与家蚕相互作用机制,以及对家蚕的生长发育、免疫及抗病力等方面具有重大意义,为后续推动蚕业可持续发展和肠道菌在其他领域的研究提供科研价值和实际应用推广价值。

【总页数】3页(P121-123)
【作者】赵明晗;陈芳敏;夏琬婷
【作者单位】沈阳大学生命科学与工程学院;沈阳大学
【正文语种】中文
【中图分类】S881
【相关文献】
1.蚊虫肠道菌群的多样性与应用研究进展
2.肠道菌群丰度和多样性对肝纤维化的加速或延缓作用及特殊菌群的防治研究进展
3.家蚕肠道微生物多样性及功能研究进
展4.野生鸟类肠道菌群多样性与生态适应研究进展5.不同喂养方式对婴幼儿肠道菌群多样性影响的研究进展
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中华蜜蜂肠道细菌群落的PCR-DGGE分析丁进;张国只;苏丽娟【摘要】肠道微生物与中华蜜蜂的生长发育密切相关，在为宿主提供营养、抵抗病原菌侵袭等方面起重要作用。

为了探究中华蜜蜂在封盖一日龄蛹、破巢幼蜂和采集蜂三个重要发育阶段肠道细菌群落的结构组成及差异变化，我们对细菌16S rDNA的V6-V8可变区进行PCR-DGGE和克隆测序，并计算封盖一日龄蛹、破巣蜂和采集蜂阶段中华蜜蜂肠道菌群的多样性指数和相似性系数，结果表明：采集蜂肠道内细菌多样性指数最大，而封盖一日龄蛹和破巣幼蜂之间的肠道菌群相似性较高；测序结果初步得到了Gilliamella、Snodgrassella、Carnobacterium、Neisseriaceae、Frischella、Janthinobacterium、Pseudomonas、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc十种菌属，其中封盖一日龄蛹和破巢幼蜂的优势菌属为Snodgrassella和Pseudomonas；采集蜂的优势菌属为Gilliamella和Snodgrassella 。

本研究旨在为提高中华蜜蜂的环境适应性和病虫害的防治提供依据。

%Gut bacterial communities are closely related to the growth and development of Apis cerana cerana,and such communities play important roles both in the insect nutrition and colonization resistance against invasion of exotic microbes. The purpose of this study is to investigate the diversities of gut bacterial communities in different developmental stages(first instar pupa,pharate adult bee and forager bee)of A. cerana cerana and the structural differences among them. We amplified the V6-V8 region of the 16S rDNA gene of samples using universal primers and separated by DGGE. Then the separated DGGE bands were extracted,cloned and sequenced. The diversity index and similaritycoefficient were calculated to reveal the constituents and dynamic changes of gut bacter ial communities in the three developmental stages of A. cerana cerana. The results showed that the microbial diversity of forager bee was significantly higher than that of first instar pupa and pharate adult bee. Compared with forager bee ,the similarities of intestinal microbes in instar pupa and pharate adult bee were much higher. The dominant bands of DGGE could be grouped into tengenera:Gilliamella,Snodgrassella,Carnobacterium,Neisseriaceae,Frischella,Ja nthinobacterium, Pseudomonas,Lactobacillus,Lactococcus and Leuconostoc. First instar pupa and pharate adult bee showed very similar bacterial community compositions in which Snodgrassella and Pseudomonas were the most important groups. However, the dominant genera in forager bee were Gilliamella and Snodgrassella. These results supply basic information for improving bee’s adaptability to environment,and controlling its diseases and insect pests.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】6页(P353-358)【关键词】中华蜜蜂;PCR-DGGE;肠道微生物;多样性【作者】丁进;张国只;苏丽娟【作者单位】河南农业大学生命科学学院，郑州 450002;河南农业大学生命科学学院，郑州 450002;河南农业大学生命科学学院，郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】Q938.1Key words：Apis cerana cerana；PCR-DGGE；gut bacterial community；diversity昆虫肠道中栖息着大量的微生物菌群，这些微生物菌群对宿主起着重要的作用，如营养功能、免疫功能和防御功能等［1-2］，它们能通过形成非特异性的局部保护菌膜［3］，引起机体产生“自然抗体”，增强免疫力，促进机体正常生态平衡的稳定，维持宿主健康，减少疾病等［4］.不同昆虫肠道内的菌群有一定差异性，研究发现，等翅目白蚁肠道内的优势菌群为厚壁菌门Firmicutes、螺旋体门Spirochaetes及变形菌门Proteobacteria［5-6］，鳞翅目舞毒蛾、棉铃虫、家蚕中肠的优势菌包括厚壁菌门肠球菌属Enterococcus及变形菌门Proteobacteria细菌［7-8］，直翅目沙漠蝗肠道的优势菌群为变形菌门肠杆菌属Enterobacter细菌［9］.蜜蜂肠道微生物菌群的研究也越来越引起人们的关注［10］.Moran等采集多地意大利蜜蜂（简称意蜂）成蜂，发现成蜂肠道内有Snodgrassella，Proteobacteria，Lactobacilli等菌群［11］.杨志波等从越夏期意蜂工蜂肠道中分离鉴定出芽孢杆菌属（Bacillus）、变形杆菌属（Proteus）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、泛生菌属（Pantoea）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和假单胞菌属（Pseudomonas）［12］.中华蜜蜂（Apis cerana cerana）（简称中蜂）为我国的本土蜂种，近些年在我国的分布及种群数量急剧减少，甚至达到了濒危的程度［13-14］，肠道微生物病害是其减少原因之一，而目前对中蜂肠道微生物群落结构组成的研究鲜有报道.本研究主要通过变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）的方法，探究中蜂在封盖一日龄蛹、破巢幼蜂和采集蜂三个重要发育阶段肠道微生物菌群的结构组成，以期了解中蜂肠道微生物菌群动态变化，为中蜂肠道微生物定植和更替机制的研究及相关疾病的防治提供依据.1.1 样品的采集与处理2014年4—5月份从健康中蜂蜂群中随机取样，分别取刚封盖的蛹虫（封盖一日龄蛹）、破巢新生幼蜂各20头，在蜂箱口取采集蜂20头，-20℃放置不超过一周或立即解剖.1.2 方法1.2.1 虫体解剖将虫体置于无菌离心管中，75%酒精浸泡3 min，再用无菌水换洗3次，无菌条件下解剖，取出肠道.1.2.2 基因组DNA的提取用OMEGA公司的Soil DNA Kit试剂盒［15］提取蜜蜂肠道中的总DNA，用酶标仪（Thermo Fisher Scientific，America）测定DNA浓度和纯度，并经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测片段.1.2.3 基因组16S rDNA V6-V8区PCR扩增以总DNA为模板，扩增细菌16S rDNA V6-V8高变区，扩增片段约为490 bp.采用的是Nubel等发表的引物［16］.引物（上海生工）序列为F968-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGC GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3’）和R1401（5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’）. PCR反应采用50 μL体系，包括25 μL的2×Taq MasterMix（北京康为世纪）、20 μM引物各1 μL、1 μL DNA 模板，22 μL ddH2O.PCR扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，60℃退火35 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min.扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，若无拖尾，取40 μL进行DGGE.1.2.4 DGGE凝胶电泳采用Bio-RAD D-code系统，10%聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度范围在35%～55%的聚丙烯酰胺变形胶（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的质量比为37.5∶1）进行DGGE，缓冲液1×TAE 60℃，电泳条件200 V，15 min；85 V，14 h.电泳后，EB染色20 min，在凝胶成像系统（UVP）中成像.用无菌刀片割下DGGE胶上目标条带，置于无菌0.2 mL EP管中，加100 μL70%乙醇，洗涤2～3次，风干10 min，将胶转移至新的无菌0.2 mL EP管中，加50 μL灭菌去离子水，4℃过夜.直接以凝胶混合液为模板进行PCR扩增，体系和程序同上，重新DGGE分离，切割同一位置条带，回收方法同上.1.2.5 DGGE条带克隆测序回收DGGE条带，PCR扩增，程序同上.所用引物（上海生工）为F968（5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’）和R1401（5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’）.将PCR产物用纯化试剂盒（上海生工）回收后与载体pMD19-T（TaKaRa，大连）连接，转化到大肠杆菌JM109中，采用T 载体通用引物进行菌落PCR扩增，所用T载体通用引物（上海生工）序列为M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和RV-M（5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’）.挑选出阳性克隆子经质粒提取鉴定无误后交由上海生工进行测序.1.2.6 数据分析用Quantity One 4.6.2对图谱条带进行结果分析，计算中蜂三个发育阶段肠道的微生物多样性指数（Shannon-Wiener，H）［17］，丰富度（Richness，S）和均匀度（Evenness，E），从多个角度对中蜂不同时期肠道微生物的分布进行研究.式中：Pi=Ni/N，Ni为样品上第i个条带吸收峰的面积，N为样品上所有条带吸收峰的总面积.式中：S为丰富度，即每一条泳道的条带数目.2.1 基因组16S rDNA V6-V8区PCR扩增将提取的样品DNA作为模板，针对细菌16S rDNA的V6-V8区进行扩增，扩增片段大小约为490 bp. PCR扩增后经1.5%琼脂糖电泳检测后备用，电泳条带如图1.2.2 DGGE指纹图谱分析对三种样品的16S rDNA V6-V8区PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，获得DGGE指纹图谱（图2）.根据DGGE对具有相同大小而序列不同的DNA片段的分离原理，可得知三个不同时期中蜂肠道中含有十几种指纹条带，每个独立分离的条带为一个操作分类单元（Operational Taxonomy Unit，OTU）.结果显示三种样品的OTU数分别为8、11、12，其中OTU14和OTU17为样品的公共条带，而公共条带信号强度有所不同，说明不同时期中蜂肠道菌群结构含有共同的细菌种属，但定植于中蜂肠道的菌群含量有所差异.同时，三种样品也有各自特异的条带，说明中蜂在化蛹到成蜂的发育过程中，其肠道内的细菌群落结构发生了明显变化. 中蜂肠道中的细菌多样性指数（H）、丰富度（S）和均匀度（E）结果如表1所示.三种样品中封盖一日龄蛹的S值、H值和E值较低，而破巢幼蜂和采集蜂相对较高，说明中蜂在幼虫到成蜂的发育过程中，其肠道内的物种多样性逐渐增高.为了研究不同时期中蜂肠道内菌群的相似性，计算出各个样品的Cs指数，Jaccard系数和Cody指数.其中Cs指数和Jaccard指数反应的是环境变化后物种群落之间的相似性，Cody指数则反映了环境变化引起物种的替代速率，结果如表1所示，可知，封盖一日龄蛹和破巢幼蜂的肠道菌群相似性较高，Cody指数最大值出现在破巢幼蜂和成蜂之间，说明中蜂从刚破巢到成蜂的过程中肠道菌群的替代速率较大.2.3 细菌系统发育分析选取DGGE图中19个条带进行切胶测序，将所测得序列与NCBI数据库（http：///Blast. cgi）中已登录的序列进行同源性比对（表2），结果得到10个种属，分别为Gilliamella、Snodgrassella、Carnobacterium、Neisseriaceae、Janthinobacterium、Frischella、Pseudomonas、Lactobacillus、Lactococcus和Leuconostoc.三个时期中蜂肠道细菌的种类及所占百分比见图3，封盖一日龄蛹和破巢幼蜂肠道细菌群落组成中，Pseudomonas（所占比例为24.8%～41.0%）、Snodgrassella（22.6%～35.5%）为主要细菌类群，Lactococcus（14.4%～17.7%）所占比例次之.而采集蜂肠道细菌群落组成中，Gilliamella和Snodgrassella为优势菌群，所占比例分别为22.8%，43.8%.该实验结果表明，封盖一日龄蛹和破巢幼蜂肠道菌群结构更为相似.昆虫肠道中丰富的微生物可帮助宿主完成多种生理生化功能并以较大的适应性应对外界环境的改变［18］，不同类群均有代表性种类并行使不同的功能［19］，蜜蜂肠道微生物菌群的研究也越来越引起人们的关注［10］.本研究通过比较中蜂从封盖一日龄蛹到成蜂的发育过程中肠道微生物菌群变化，发现肠道内微生物的丰富度（S）逐渐增大，并且采集蜂体内微生物多样性H指数最高，可能的原因是幼虫阶段排泄行为的缺失及随着幼虫成长发育其饮食的改变的影响［20］.破巢幼蜂和采集蜂之间Cody指数最大，说明中蜂采集花蜜和花粉的行为，影响了其肠道微生物的替代速率及结构组成.进一步分析发现，中蜂从封盖到出巢的整个蛹期，肠道微生物组成变化不明显，仅多了Janthinobacterium，而在采集蜂的肠道内也检测到Janthinobacterium，说明Janthinobacterium可能是在中蜂化蛹期间形成的.和蛹期相比，采集蜂肠道内并未检测到Leuconostoc和Lactococcus，但新增了Carnobacterium、Neisseriaceae、Frischella和Lactobacillus，说明随着中蜂的生长发育，肠道细菌会出现种属更迭，此现象也出现在日本蜜蜂肠道菌群中［21］.中蜂和意蜂肠道内菌群结构可能存在差异.本实验得到十种菌属，其中优势菌属为Gilliamella、Snodgrassella和Pseudomonas，均属于变形菌纲，Vojvodic通过研究意蜂幼虫，发现肠道优势菌群主要为Acetobacteraceae和Lactobacillus［20］，但本研究中并未检测出Acetobacteraceae.蜜蜂肠道内的Gilliamella和Lactobacillus有多种与碳水化合物相关的功能，包括合成果胶降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶等［22］，并且其肠道内的益生菌群Lactobacillus可诱导宿主蜂产生抗菌肽和防御素，增强蜜蜂的免疫能力［23-24］.Martinson等在意蜂和熊蜂体内检测到了Snodgrassella和Gilliamella，并指出到目前为止这两种菌仅见于蜜蜂和熊蜂［25］.研究表明Snodgrassella与熊蜂短膜虫感染能力的高低有显著关系，能在一定程度上提高宿主蜂对寄生虫的防御能力［26］.Snodgrassella还与东方蜜蜂微孢子虫病发病机理有关，Li等通过研究发现感染东方蜜蜂微孢子虫的蜂体内Snodgrassella细菌数量较正常蜜蜂少［27］，表明蜜蜂肠道细菌群落的组成可能影响蜜蜂对东方蜜蜂微孢子虫的敏感性.Carnobacterium菌属是在采集蜂肠道内分离得到的，刘莉等在贡嘎蝠蛾幼虫体内也发现了该菌属，并指出添加该菌的饲料对幼虫有促生长的作用［28］.我国是个养蜂大国，近些年来，病虫害侵袭是中蜂在我国的分布及种群数量急剧减少的重要原因之一，共生菌对宿主蜂有抑制病原菌生长、抵抗寄生虫侵染等作用，开展中蜂肠道微生物的研究对中蜂的养殖、病害防治和蜂产业的深度开发都有重要意义.本实验仅研究了中蜂在封盖一日龄蛹、破巢幼蜂和采集蜂三个重要发育阶段肠道微生物的菌落结构.若要更深入全面地了解中蜂肠道微生物群落结构，仍需进行大量研究.目前对共生菌在蜂体内的定殖和更替的机理仍然模糊不清，且对一些肠道共生菌功能的验证也比较粗浅，均需要更多的实验性研究.【相关文献】［1］ 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