ABO血型鉴定正反定型试验方法

abo血型系统定型原则和实验方法
ABO血型系统定型原则是利用凝集试验技术，通过正定型（红细胞定型）和反定型（血清定型）两组试验来准确鉴定ABO血型。

具体步骤如下：
1. 正定型：取75×12mm干净小试管2支，分别标记抗A、抗B。

按标记滴加抗A、抗B试剂血清1滴。

再各滴加3-5%待检者红细胞悬液1滴，混匀。

2. 反定型：取75×12mm干净小试管3支，分别标记A细胞、B细胞、O 细胞。

3管各滴加待检者血清1滴。

按标记分别滴加混匀的A型、B型、O 型试剂红细胞1滴，混匀。

5管同时2档（3400转/分-15秒）离心。

3. 轻轻摇动试管，观察反应结果。

对于结果解释，如果被检红细胞膜上有与该试剂血清抗体相对应的抗原，或者被检血清中有与该试剂红细胞抗原相对应的抗体，则为阳性，即凝集为阳性。

如果不凝集，则为阴性。

以上是ABO血型系统定型原则和实验方法，仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。

ABO血型鉴定标准操作规程1.检验原理：根据红细胞上有或无A抗原或／和B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。

可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定ABO血型。

所谓正定型，是用已知抗—A和抗—B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或／和B抗原；所谓反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗—A或／和抗—B。

2.试剂和材料：1、抗—A（B型血）、抗—B（A型血）及抗—A十B（O型血）分型血清，2、5％A、B及O型试剂红细胞盐水悬液。

3、受检者血清；4、受检者5％红细胞盐水悬液。

3.方法3.1.试管法（1）取洁净小试管（内径10mm×60mm）3支，分别标明抗—A、抗—B和抗—A十B，用滴管分别加抗—A、抗—B和抗—A十B。

分型血清各l滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者5％红细胞盐水悬液1滴，混合。

（2）另取洁净小试管（内径10mm×60mm）3支，分别标明A、B和O细胞。

用滴管分别加入受检者血清l滴于试管底部，再分别以滴管加入A、B和O型5％试剂红细胞悬液l滴，混合。

（3）立即以1000r／min离心lmin。

（4）将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象。

如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。

（5）观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或cisAB的发现。

（6）凝集强度判断标准4十红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。

3十红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。

2十红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细胞。

1十肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞土镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞MF 混合凝集外观（mixed field）是指镜下可见少数红细胞凝集，而绝大多数红细胞仍呈分散分布。

一表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。

3.2.玻片法（1）取清洁玻片1张（或白瓷板1块），用蜡笔画成方格，标明抗-A、抗-B 和抗-A十B，分别用滴管滴加抗-A、抗-B和抗-A十B分型血清 l滴于标明的方格内，再各加受检者2％红细胞悬液1滴，混合。

ABO血型鉴定正反定型试验方法正定型试验是通过将被测血清与已知的A和B抗原的红细胞混合反应来确定被测血型。

具体步骤如下：1.准备供试者的血液样本。

采集一个血液样本，可以是静脉血或者指尖血。

2.分别将供试者的血液样本分为两个离心管中。

在两个离心管中加入等量的稀释液，使血液与稀释液比例为1：2，充分混合。

3.在一个离心管中加入已知含有A抗原的红细胞悬液，同时在另一个离心管中加入已知含有B抗原的红细胞悬液。

充分混合。

4.将两个离心管分别离心，离心后可观察到两个离心管中红细胞的沉淀情况。

5.如果被试者的血清与含有A抗原的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有B血型。

如果与含有B抗原的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有A 血型。

如果与两者都沉淀，说明被试者具有AB血型。

如果与两者都未发生沉淀，说明被试者具有O血型。

反定型试验是通过将被测血清与已知的A和B型抗体的红细胞混合反应来确定被测血型。

具体步骤如下：1.准备供试者的血液样本。

采集一个血液样本，可以是静脉血或者指尖血。

2.分别将供试者的血液样本分为两个离心管中。

在一个离心管中加入已知含有A型抗体的红细胞悬液，同时在另一个离心管中加入已知含有B 型抗体的红细胞悬液。

充分混合。

3.将两个离心管分别离心，离心后可观察到两个离心管中红细胞的沉淀情况。

4.如果被试者的血清与含有A型抗体的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有B血型。

如果与含有B型抗体的红细胞混合后沉淀，说明被试者具有A血型。

如果与两者都沉淀，说明被试者具有AB血型。

如果与两者都未发生沉淀，说明被试者具有O血型。

在正定型试验和反定型试验中，如果在任意一次实验中发生了沉淀反应，就能确定被试者的血型。

如果在正定型试验和反定型试验中都未发生沉淀反应，则需要重新进行试验或者采用其他额外的手段来鉴定个体的血型。

需要注意的是，血型鉴定是一种简单、安全、快速且可靠的方法，但在特殊情况下，如婴儿出生后的一段时间内，由于母婴免疫传递可以导致血型存在变化。

ABO疑难定型一、ABO疑难血型鉴定的方法（一）正反定型：正定型：-A, -B，-AB, -H, -A1反定型：Ac, Bc, Oc, 自身对照1. ABO正定型中各种试剂用途疑难定型中正定型用抗血清抗-A及抗-B抗-AB:确认弱A和弱B抗原,与弱A及弱 B抗原亲和力强,会产生强反应抗-H:用于检查亚型及孟买型, A亚型红细胞上的H抗原多于正常A型抗-A1: 用于A亚型(如A2, A3)检测2. H抗原在红细胞上的分布3. ABO反定型中各种试剂的用途反定型中试剂红细胞的意义A及B细胞: 确认抗-A或抗-B抗体O型红细胞:检查是否存在ABO系统以外抗体干扰ABO反定型自身对照: 用于确认正反定型结果的有效性,排除自身抗体对定型的干扰(如冷凝集等)A2细胞: 用于亚型的鉴定, 尤其是在怀疑是A亚型且又存在抗-A1抗体的情况下（二）型物质测定型物质准备：1~2ml唾液，沸水煮10分钟，离心后得到的上清。

标清的调制：标清用盐水稀释至其效价为1：16中和：将0.5ml型物质与调制后的标清0.5ml等体积混合,室温放置30分钟检测：用Ac检测中和后的抗-A, Bc检测中和后的抗-B.结果判断：如果抗-A被中和，则被检者为A型，如果抗-B被中和，则被检者为B 型。

（三）吸收放散吸收用RBC：盐水洗涤5次的被检者压积RBC 1ml。

吸收用的标准血清将压积RBC和标清按等体积比例混合，在相应的温度条件下（4℃）孵育1小时，每隔15分钟混匀一次用盐水洗涤孵育后的细胞6次，得到压积RBC，加入等量盐水。

56℃水浴震荡10分钟，离心获得上清即为放散液。

用标准试剂红细胞检测放散液。

（四）O型筛选红细胞的应用抗原组成:三组合细胞,要求必须具备全部的Rh因子I: O型R1R1(CDe/CDe); II:O型 R2R2(cDE/cDE); III: O型rr(cde/cde)用途: 用于受血者、献血员及孕产妇等的ABO系统以外不规则抗体的筛选目的: 在配血之前,有针对性、按比例的去寻找与带有抗体的病人相配合的血（五）自家冷凝集血样的ABO定型正定型用红细胞的准备:血样采集后,立即离心,获得压积红细胞用37℃温盐水洗涤红细胞45℃热放散3分钟巯基试剂处理: 破坏IgM抗体自家冷凝集血样的ABO定型反定型用血浆或血清的准备血样采集后放置4℃冰箱静置24小时,使红细胞充分吸收自身冷凝集抗体用自身红细胞吸收去除自身冷抗体用O型红细胞吸收去除ABO系统以外的非特异性及特异性抗体（六）获得性B1. 获得性B及多凝集现象获得性B:肠紊乱及感染病人, 细菌酶影响A抗原的受体肠内壁通透性增加,而后细菌多糖吸附在红细胞表面多凝集现象:异常或变形的RBC被所有正常人的血清凝集(微生物酶作用暴露或激活膜隐蔽受体多凝集血样中的血清不与自身反应)2. 获得性B产生的主要机理二、ABO正反定型不符的问题分析（一）ABO定型问题经常发生的情况为：1. 明显缺失应该出现的抗-A或抗-B：(1) 新生儿血样(2) 免疫缺陷、免疫紊乱(3) 前带现象(4) 血型型物质过多(5) 抗原太弱，常规方法检查不出来，相应血清中无抗体(6) 亚型，反应是混合视野2. 由于试剂被污染，或试剂中有额外抗体3. 明显多出抗原(或多出抗体)(1) 亚型，如A2型可能血清中有抗-A1(2) 自家凝集(3) 获得性B（二）引起ABO正反定型不一致的原因分析1. 技术因素：(1) 试剂贮存不当(2) 使用技术错误(3) 使用错误的试剂(4) 使用污染或失效的试剂(5) 离心速度不当2. 存在IgM性质的自家冷抗体由于自家冷抗体(冷凝集病,CHD)而导致自家溶血的病人，在低于37℃时血细胞自发凝集，影响正反定型。

ABO及RhD血型鉴定试验标准操作规程(一)检验目的检测红细胞表面ABO血型抗原、RhD抗原及血清(或血浆)中抗A、抗B抗体，确定受检者ABO及RhD血型。

(二)检验原理1.手工试管法、玻片法或纸板法利用标准IgM抗A／B血清鉴定红细胞表面ABO抗原即正定型，利用已知ABO 血型反定型红细胞鉴定同一标本血清(或血浆)中的抗A／B 抗体即反定型，综合正反定型结果确定受检标本ABO血型；利用标准IgM抗D直接鉴定RhD血型。

2.微柱凝胶法ABO／RhD卡的微管中装填有葡聚糖凝胶颗粒和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，凝胶颗粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶颗粒中，未凝集的红细胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。

3.玻璃珠微柱法ABO／RhD卡的微管中装填有玻璃微珠和抗A、抗B、抗D标准血清，如果红细胞表面存在A或B或D抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，玻璃微珠具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下通过玻璃微珠，使其悬浮在玻璃微珠层的上端，未凝集的红细胞则可以通过玻璃微珠之间的微小空隙到达微管底部。

(三)适用范围适用于手工、半自动、全自动ABO血型及RhD血型鉴定试验。

(四)设备性能参数各种血型检测系统性能指标参见相应血型检测系统说明书。

(五)器材与试剂1.器材WADiana全自动血型配血系统、SWING-SAXO 血型配血系统、Techno全自动血型配血系统、Othro AutoVue Innova全自动血型配血系统、B600-A型低速离心机、KA-2200血清学专用离心机、阅片灯箱、塑料软试管、塑料硬质试管(100m m×12mm和75m m×l2mm)、血型鉴定专用纸板、玻片、试管架、一次性塑料滴管、记号笔。

2.试剂Diana DG Gel ABO-CDE血型卡、DiaMed ABO／RhD血型卡、OTHROBiovueABO／RhD血型卡、2％氢氧化钠溶液、生理盐水、抗A／B标准血清、抗D标准血清、3％～5％反定型试剂红细胞、1％反定型试剂红细胞。

实验十五 ABO血型鉴定一、正定型法【目的】掌握用盐水介质法进行ABO血型系统(ABO group)正定型(direct typing)的原理、操作方法和结果判断。

【原理】用已知的IgM类特异抗体（标准血清）与被检红细胞在室温条件下、盐水介质中反应，根据红细胞是否出现凝集现象来测定被检红细胞膜上有无与血型抗体相对应的抗原，从而判断和鉴定被检者的血型。

【器材】1. 1.小试管、记号笔、蜡笔、试管架。

2. 2.尖滴管、胶吸头。

3. 3.吸管、吸耳球。

4. 4.载玻片或有凹槽的玻璃板或白瓷板。

5. 5.离心机。

6. 6.显微镜。

【试剂】1．标准抗A、抗B血清（商品）分为人血清ABO血型抗体和人ABO血型单克隆抗体，要求如下：（1）人血清ABO血型抗体：①特异性高。

②凝集效价：抗A不低于1∶128 ，抗B不低于1∶64。

③亲和力：反应开始15s内即出现凝集，3min时明显凝集，血凝块大于1mm2。

④稳定性高。

⑤已灭活补体。

（2）人ABO血型单克隆抗体：①特异性：抗A抗体特异凝集具有A型红细胞抗原的A1、A2、A1B、A2B；抗B抗体只凝集含B抗原的B和AB型红细胞。

②亲和力：以开始反应到出现凝集的时间表示抗血清的亲和力，国家标准是抗A对A1、A2、A2B分别为15s、30s、45s；抗B对B型红细胞为15s。

③凝集效价：国家标准是抗A1、抗B均大于1∶128。

④稳定性：较人血清抗体的稳定性低。

2．生理盐水。

【标本】抗凝静脉血或末梢血。

【操作】制备被检者5％红细胞生理盐水悬液：抗凝血离心或红细胞自然沉降后取试管下层的红细胞2滴于小试管中，加入生理盐水2ml，用尖滴管将红细胞与生理盐水充分混匀。

2 500r/min离心3 min 后弃去上清液，重复洗涤3次。

自管底吸取1滴压积红细胞加入19滴生理盐水中混匀，此即为5％的红细胞生理盐水悬液。

操作示意见图4-1。

图4-15％红细胞生理盐水悬液制备操作示意图1．玻片法（1）标记玻片或白瓷板：取洁净的载玻片或白瓷板1块，用蜡笔画出小格，标明抗A、抗B。

ABO血型鉴定正反定型试验方法正定型试验方法：1.准备试验所需材料：A、B和O型血浆，还原血红蛋白（RBCs），生理盐水（PBS）和试管。

2.在试管中加入一定量的PBS。

3.取一滴A型血浆滴在PBS中的一根试管中，取另一滴B型血浆滴在PBS中的另一根试管中，取一滴O型血浆滴在PBS中的另一根试管中。

4.在每个试管中分别加入一滴RBCs。

5.轻轻摇晃每个试管，观察RBCs和血浆的反应。

反定型试验方法：1.准备试验所需材料：A、B和O型RBCs，A和B型血浆，抗人类血球定向凝集试验（AHG试剂），患者的血清和试管。

2.在试管中加入一定量的患者血清。

3.取一滴A型RBCs滴在血清中的一根试管中，取另一滴B型RBCs滴在血清中的另一根试管中，取一滴O型RBCs滴在血清中的另一根试管中。

4.分别制备三个试管，将A、B和O型RBCs与患者的血清混合。

5.将三个试管分别加入AHG试剂。

6.轻轻摇晃每个试管，观察RBCs和血清的反应。

分析结果：正定型试验的结果是通过观察每个试管中RBCs与血浆的反应来确定的。

如果A型血浆与A型RBCs在试验中凝集，B型血浆与B型RBCs在试验中凝集，而O型血浆不与任何RBCs发生凝集，则可以初步断定该患者的血型是A型、B型或O型。

反定型试验的结果是通过观察每个试管中RBCs与患者血清和AHG试剂的反应来确定的。

如果A型RBCs与患者血清和AHG试剂在试验中凝集，B型RBCs与患者血清和AHG试剂在试验中凝集，而O型RBCs与患者血清和AHG试剂不发生凝集，则可以最终确定该患者的血型。

总结：。

ABO 血型鉴定操作规程1. 原理根据红细胞上和血清(或者血浆)中有无 A 抗原和(或者)B 抗原及其抗体，将血型分为A 型、B 型、AB 型及O 型。

可利用红细胞凝集试验，通过正、反定型鉴定ABO 血型。

正定型是指用已知抗正定型-A、抗-B 血清来检测受检红细胞上有无相应的 A 抗原和(或者) B 抗原；反定型是指用已知反定型A1 型、B 型红细胞来检测受检血清 (或者血浆) 中有无相应的抗-A 和(或者)抗-B。

2. 原始样品要求5 mL 静脉全血。

3. 样品容器和添加剂样品容器和添加剂样品容器和添加剂样品容器和添加剂真空试管，EDTA.K2 抗凝/普通试管，不抗凝。

4. 检测环境要求检测环境要求检测环境要求检测环境要求温度：18℃~27℃，湿度：30%~70%。

5. 所需材料和设备所需材料和设备所需材料和设备所需材料和设备5.1 设备普通离心机、免疫血液学离心机、显微镜、恒温水箱、定时器。

5.2 材料抗-A、抗-B 血清、ABO 标准抗原红细胞试剂、移液器、加样吸头、生理盐水(NS)、干净空试管。

6. 检测操作过程检测操作过程检测操作过程检测操作过程6.1 将受检标本以1000g 离心5min，使标本血浆/血清与红细胞分离，吸取红细胞，用NS 洗涤三次后，配成3%~5%红细胞悬液。

6.2 取6 支小试管，分别标记“-A”、“-B”、“自身”、“Ac”、“Bc”、“Oc”。

6.3 在“-A”、“-B”管中分别加入抗-A 和抗-B 血清各50 μL ，其余管加入受检血浆/血清各100 μL 。

6.4 在“-A”、“-B”、“自身”管中加入受检者3%~5%红细胞悬液各50 μL ，摇匀。

6.5 在“Ac”、“Bc”、“Oc”管中分别加入A1、B、O 红细胞试剂各50 μL ，摇匀。

6.6 1000g 离心15sec，轻轻悬浮红细胞，观察结果并记录。

6.7 根据实验需要，除室温下观察结果外，另可增加在4℃、37℃下观察结果。