金银花提取物中绿原酸含量测定方法(H)

金银花中绿原酸成份的提取方法分析研究陈茜【摘要】目的对金银花中绿原酸的提取方法进行分析研究.方法针对绿原酸的性质,设计了纯乙醇提取、50％乙醇提取、水提取与超声波提取方法对比实验、醇提法与超声波提取方法对比实验,并对每种提取方法的优缺点进行了分析.结果50％的乙醇水溶液比纯乙醇提取效果好.与传统的醇提取法相比较,超声波法提取绿原酸的提取效果更好.研究亦表明,增加乙醇的浓度,提取绿原酸的浓度会增加,但是当绿原酸浓度到达最高峰后,随着乙醇浓度的增加,绿原酸的含量却呈降低趋势.传统醇提法乙醇的最佳浓度是70％,超声波醇提法乙醇的最佳浓度是60％.结论与水提法相比较,醇提法提取效果较好,绿原酸的提取效率也较高,加入超声波后提取效率变得更高,提取物绿原酸的含量也会增加.【期刊名称】《中国中医药现代远程教育》【年(卷),期】2018(016)005【总页数】3页(P88-90)【关键词】金银花;绿原酸;超声波;乙醇提取;中药化学【作者】陈茜【作者单位】锦州市妇婴医院中药局,辽宁锦州121000【正文语种】中文金银花为常用中药，具有清热解毒，保肝利胆、凉风散热，抗病毒等功能[1]。

近年来研究表明，金银花还具有抗人类免疫缺陷病毒、抗肿瘤的功效，具有广阔的临床应用前景。

金银花的主要成分包括绿原酸、肌醇、木犀草素、异绿原酸以及三萜皂苷等，其中，绿原酸是金银花的抗菌有效成分，一般常用绿原酸的含量高低来评价金银花质量的好坏[2]。

绿原酸是一种有机酸，同时含有羧基和邻二酚羟基，易溶于醇溶液、丙酮和水等溶剂。

当前，从金银花当中提取出绿原酸的常用提取方法包括传统的水提法、乙醇提取法、酶提取法等。

本文将对绿原酸的常用提取方法进行实验和分析总结，并根据绿原酸的性质，设计出了水提取、纯乙醇提取、50%乙醇提取、超声波提取方法与醇提法对比实验、水提法与超声波提取方法对比实验，对每种提取方法的优缺点进行了分析。

1 材料与方法1.1 仪器和试药电子天平、烧杯若干、量筒、锥形瓶、漏斗、超声波发生器（郑州予华仪器制造有限公司）、离心机（江苏天瑞仪器股份有限公司）、高效液相色谱仪（上海仪电分析仪器有限公司）。

高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸的含量【摘要】目的建立金银花提取物中绿原酸含量的HPLC测定方法。

方法国产C18柱（4.6 mm×250 mm，7 μm）;流动相为乙腈：0.4%磷酸（12∶88）；检测波长为327 nm；流速1 ml・min-1；进样量10 μl；柱温25℃。

结果绿原酸在0.071 6～0.644 4 μg范围内线性关系良好，r=0.999 6；平均回收率99.99%，RSD=1.61%（n=6）。

结论该方法简便、快速、准确，可用于金银花提取物的含量测定及质量控制。

【关键词】金银花提取物；绿原酸；高效液相色谱法AbstractObjectiveTo establish a method for the determination of Chlorogenic acid in the extract of Flos Lonicerae.MethodsThe chromatographic conditions were as follows: C18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm，7 μm)，a mobile phase of acetonitrile and 0.4%H3PO4(12:88)，the detection wavelength at 327 nm and the flow rate being 1 ml・min-1. ResultsA linearity of Chlorogenic acid in the extract was obtained in the range of 0.071 6～0.644 4 μg r=0.999 6(n=6).The average recovery was 99.99% and RSD=1.61%(n=6). ConclusionThis method is easy，sensitive and accurate for the determination of Chlorogenic acid in the extract of Flos Lonicerae.Key wordsChlorogenic acid; HPLC; Determination金银花Flos Lonicerae又名忍冬、双花，为临床常用中药，具有清热解毒、凉散风热之功效，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等［1］。

金银花检验标准操作规程一、目的：建立金银花检验标准操作规程，确保检验结果的真实性和准确性。

二、依据：《中华人民共和国药典》(2010年版一部)。

三、范围：本检验规程适用于金银花的检验项目、限度和操作方法。

四、责任者：QC检验员、质量部负责人五、内容:1、标准依据：原药材质量标准2、【性状】：2.1 仪器：直尺2.2 方法：取本品,置日光下观察,并用直尺测量本品呈棒状，上粗下细，略弯曲，长2～3cm，上部直径约3mm，下部直径约1.5mm。

表面黄白色或绿白色(贮久色渐深)，密被短柔毛。

偶见叶状苞片。

花萼绿色，先端5裂，裂片有毛，长约2mm。

开放者花冠筒状，先端二唇形；雄蕊5个，附于筒壁，黄色；雌蕊1个，子房无毛。

气清香，味淡、微苦。

3、【鉴别】3.1 薄层鉴别3.1.1 仪器与试剂：三用紫外分析仪、托盘天平、回流装置、层析缸、硅胶GF254板、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸等。

3.1.2 方法: 取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，放置12小时，滤过，滤液作为供试品溶液。

另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取供试品溶液10～20µl、对照品溶液10µl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(7：2.5：2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

4、【检查】4.1 水分：不得过12.0%4.1.1 仪器：电热鼓风干燥箱、分析天平、粉碎机、药筛等。

4.1.2 方法：取供试品2-5g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，打开瓶盖在100－105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重至连续两次称重的差异不超过5mg为止。

HPLC-绿原酸检测方法2020版本药典有效成分测定参考2020版《中国药典》金银花项下绿原酸和木犀草苷测定的方法，采用高效液相色谱法测定其含量。

2.3.4.1 供试品溶液制备取本品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率35kHz)30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液4ml，置5ml离心管中，摇匀，即得。

2.3.4.2 绿原酸的高效液相色谱检测方法(1) 标准品溶液的配制取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1ml含50µg的溶液，即得对照品溶液10℃以下保存。

(2) 检测条件色谱条件：色谱柱为安捷伦SB-C18柱（250mm×4.6mm，5µm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（13:87）；检测器为安捷伦G1314B可变波长紫外检测器；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；检测波长为327nm；进样量为10µl。

用外标法进行定量。

(3) 标准曲线的绘制分别吸取绿原酸对照品溶液2、4、6、8、10、20µl注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以进样量为横坐标X，色谱峰峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程Y = 830.69X -16.516(R2=1)。

(4) 精密度实验取同一浓度的对照品溶液每次进样10µl，连续进样6次，按上述色谱条件测定绿原酸含量，根据检测结果计算相对标准偏差（RSD）。

(5) 稳定性考察分别取同一浓度的对照品溶液10µl，每隔两小时进样一次，连续进样检测６次，根据结果计算相应的相对标准偏差（RSD），检测10小时之内绿原酸的稳定性。

(6) 重现性实验取同一批次的提取样品，在设定的HPLC条件下连续进样6次，测定绿原酸含量，计算标准偏差（RSD）。

金银花金银花是忍冬科的植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。

忍冬是一种中药，它的使用历史较为悠久，很早以前就被用来治病。

金银花作为38种常用的中药材之一，具有清热解毒、凉散风热的功效，被广泛使用到医疗中。

金银花的主要成分有绿原酸、异绿原酸、黄酮类化合物、芳樟醇和双花醇等，对于肿瘤、病菌、病毒等有很好的抵抗作用。

忍冬半常绿藤本；幼枝暗红褐色，密被黄褐色、开展的硬直糙毛、腺毛和短柔毛，下部常无毛。

叶纸质，卵形至矩圆状卵形，有时卵状披针形，稀圆卵形或倒卵形，极少有1至数个钝缺刻，长3～5（～9.5）厘米，顶端尖或渐尖，少有钝、圆或微凹缺，基部圆或近心形，有糙缘毛，上面深绿色，下面淡绿色，小枝上部叶通常两面均密被短糙毛，下部叶常平滑无毛而下面多少带青灰色；叶柄长4～8毫米，密被短柔毛。

总花梗通常单生于小枝上部叶腋，与叶柄等长或稍较短，下方者则长达2～4厘米，密被短柔后，并夹杂腺毛；苞片大，叶状，卵形至椭圆形，长达2～3厘米，两面均有短柔毛或有时近无毛；小苞片顶端圆形或截形，长约1毫米，为萼筒的1/2～4/5，有短糙毛和腺毛；萼筒长约2毫米，无毛，萼齿卵状三角形或长三角形，顶端尖而有长毛，外面和边缘都有密毛；花冠白色，有时基部向阳面呈微红，后变黄色，长（2～）3～4.5（～6）厘米，唇形，筒稍长于唇瓣，很少近等长，外被多少倒生的开展或半开展糙毛和长腺毛，上唇裂片顶端钝形，下唇带状而反曲；雄蕊和花柱均高出花冠。

果实圆形，直径6～7毫米，熟时蓝黑色，有光泽；种子卵圆形或椭圆形，褐色，长约3毫米，中部有1凸起的脊，两侧有浅的横沟纹。

花期4～6月（秋季亦常开花），果熟期10～11月。

华南忍冬半常绿藤本；幼枝、叶柄、总花梗、苞片、小苞片和萼筒均密被灰黄色卷曲短柔毛，并疏生微腺毛；小枝淡红褐色或近褐色。

叶纸质，卵形至卵状矩圆形，长3～6（～7）厘米，顶端尖或稍钝而具小短尖头，基部圆形、截形或带心形，幼时两面有短糙毛，老时上面变无毛；叶柄长5～10毫米。

广西南宁市部分市面流通的金银花中绿原酸含量测定目的检测广西南宁市部分市面流通的金银花的中绿原酸的含量。

方法采用高效液相色谱法，以绿原酸为检测指标对购置于南宁市场上28批不同单位的金银花进行含量测定。

结果所测定的28个广西南宁市流通的金银花样品中所含绿原酸的量均超过药典规定的1.5%标准。

结论本次试验检测广西南宁市流通的金银花样品的绿原酸含量均符合国家药典标准。

标签：金银花；绿原酸；HPLC金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥花蕾或带初开的花。

其性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪，既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等证，均效果显著[1]。

绿原酸作为金银花中的一种次生代谢物，为中国药典控制金银花的质量指标之一[2]；其具有清除自由基、抗菌消炎、降糖、降血脂、保肝利胆等多种功效[3-5]。

金银花在广西南宁常用于治疗急性呼吸道感染、肺部感染、感冒、急性扁桃体炎、肺炎、流行性脑脊髓膜炎等疾病[6]。

因此本实验研究以绿原酸为检测指标对广西南宁市流通金银花进行质量监控具有一定现实意义。

1 仪器与材料Agilent 1100高效液相色谱仪；Waters Symmetry C-18液相色谱柱（150×4.6mm，5μm）；德国赛多利斯公司BP211D电子分析天平；Millipore simplicity-185超纯水器；SB3200T超声波清洗器；乙腈（色谱纯）；甲醇（分析纯）；超纯水；其他试剂为分析纯。

绿原酸（中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413）；28批金银花样品均于2015年3月购置于南宁是不同区域的药店、药房、医院及批发部。

经过广西中医药大学廖月葵高级实验室鉴定为忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥花蕾或带初开的花。

2 方法与结果2.1色谱条件采用高效液相色谱法进行含量测定，以绿原酸为供试品定量指标，色谱条件为：Waters Symmetry C18液相色谱柱（150×4.6mm，5μm），乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）为流动相，柱温：35℃，检测波长为327nm。

金银花中绿原酸含量测定摘要】目的：通过测定金银花中主要特征成分绿原酸含量评价金银花品质。

方法：高效液相色谱法。

采用C185柱（250mm×4.6mm），流动相为乙腈-1.0%冰醋酸溶液，0.45μm滤膜抽滤，流速为1.0ml/min，检测波长为242nm。

结果：绿原酸进样量在0.2～1.0μg范围内与峰面积线性关系良好，精密度RSD为1.13%，平均回收率为101.2%。

结论：高效液相色谱法测定金银花中绿原酸含量操作简便，结果准确，可用于对金银花品质的评价。

【关键词】高效液相色谱法；金银花；绿原酸；含量；测定【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）06-0374-02金银花具有清热解毒之功效，绿原酸是其中的主要特征成分，而且也是目前所发现的金银花中药理活性最强的物质。

绿原酸是植物进行有氧呼吸过程中产生的苯丙素类化合物，经现代药理研究证实，这种化合物不仅能够抗病毒，而且可以止血、利肝利胆、抗氧化。

因此，绿原酸含量是金银花品质评定的重要依据。

通过提取绿原酸，并测定绿原酸含量，将为金银花药物开发与利用提供支持。

本文将探讨采用高效液相色谱法测定金银花中的绿原酸含量。

1．材料与方法1.1 材料与仪器材料：将采摘的金银花放置阴凉处，直至质量稳定。

使用粉碎机将金银花粉碎，过40目筛，以备试验使用。

试剂：绿原酸对照品（批号110753-200413）由中国药品生物制品检定所提供；水为纯化水；乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

仪器：采用美国安捷伦公司生产的全自动液相色谱仪系统Aligent1100（四元梯度洗脱泵、二极管检测器、温柱箱等）；昆山市超声波仪器有限公司生产的超声波清洗器；梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产的电子分析天平。

1.2 试验方法1.2.1试样制备将金银花粉末精确称取1.0g，放置在100ml量瓶中，加入50%甲醇10ml，放入超声清洗器中震荡，进行减压过滤，然后将滤液放置在25ml量瓶中定容。

内容：本品为金银花经加工制成的提取物。

[制法] 取金银花,加水煎煮两次,每次加10倍量水,煎煮2小时,合并煎煮液,滤过,滤液加入石灰乳调节PH值至10~12,静置,滤取沉淀,加水适量,用硫酸调节PH值至6~8,搅匀,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.33~1.35(60℃)的稠膏,减压干燥,即得。

[性状] 本品为棕黄色粉末，味苦，具吸湿性。

[鉴别] ⑴取本品约15mg，加水1ml使溶解，加5%硝酸钠与10%硝酸铝溶液各3~5滴，立即生成棕黄色沉淀，再加氢氧化试液2ml，沉淀立即溶解，溶液显棕红色。

⑵取本品0.1g，加甲醇10ml，湿热，振播10分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。

另取绿原酸对照品，用甲醇1ml含1ml 的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法试验，吸取试品溶液及对照品溶液各10ml，分别点于同一以羧甲基纤维素纳为粘合剂的硅胶II板上，以乙酸乙酯—甲酸—水（7：2.5：2.5）的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。

[检查] ⑴水分：按中国药典（2005年版）附录水分测定法（第一法）测定，不得过6.0%。

⑵溶化性：取本品5g加热水100ml，搅拌5分钟，立即观察，应能全部溶解化，不得有残渣或焦屑等异物。

⑶粒度：取本品10g，过60目筛，应全部通过。

⑷微生物限度：取本品按微生物限度检查法检查，每1g中细菌数不得过300个，霉菌和酵母菌不得过30个，大肠埃希菌不得检出。

[含量测定]照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录VID）测定色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.4%硫酸溶液（13：87）为流动相；检测波长327nm。

理论板数按绿原酸峰计应不低于5000。

对照品溶液的制备取绿原酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加50%甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

金银花中绿原酸的分离与测定新方法蔡霄英刘永乐（长沙电力学院食品生物工程系长沙〃410015）摘要：对湖南益阳县黄蜂山所采金银花进行了提取、分离及组分鉴定，解决了绿原酸易分解的问题，得到纯度较高的绿原酸。

关键词：金银花；绿原酸；分解中图分类号：TS201.4 文献标识码：A 文章编号：1005-9989（2003）05-0104-03Separation and identify of the chlorogenicacid in Lonicera japonica thunbCAI Xiao-ying LIU Yong-le(Changsha University of Electric Power,Changsha,410015)Abstract: Carry thr ough separ ation, pur ification and identify. Chlorogenic acid w as isolated from lonicer a japonica thunb. It is collected from vespidhill in yiyang country, hunan prov ince.The problems of oxygenation and disassembly of chlorogenic acid is solved.Key words: lonicera japonica thunb; chlorogenic acid; disassembly0 前言金银花又名忍冬花、银花、双花、茶叶花等，为忍冬科植物忍冬(lonicera japonica tumb) 的花蕾。

金银花中含有绿原酸、异绿原酸、肌醇、黄酮、皂素及多酚类物质等，具有抗菌、抗病毒、消除体内有毒物质、降血压、改善机体免疫功能等多种保健作用。

我国对金银花这一清热解毒中药的研究处于世界领先地位。

我国作为金银花产地，从原料着手，在金银花炮制、有效成分分析、含量测定等方面都有了一定研究。

金银花中绿原酸提取法(索氏提取法为最佳提取方法)1 . 1 主要材料与仪器金银花( 购自药房) , 无水乙醇( AR ), 甲醇( A R 厂) , 乙酸乙酯( AR )。

索氏提取器(上海洪纪仪器设备有限公司),ESJ2 05 4型电子天平( 沈阳龙腾电子有限公司),UV 22 50 型紫外分光度计( 日本岛津) , 水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂) , KD M 型可调控温度电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司), 800 1 离心机(江苏金坛市荣华仪器制造有限公司), K Q 50 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。

1 .2 标准曲线的绘制准确称取绿原酸对照品1 0 m g , 用60 %乙醇溶解并定容至50 m L ,备用.然后分别取0 . 0 、0 . 5 、1 . 0 、2 . 0 、3 . 0 、4 . 0 、5 . 0 mL , 再用60 %乙醇定容至50 mL以4号标准样在200 ~ 600 n m 波长范围内进行波长扫描, 测出绿原酸的最大吸收波长为326 n m。

然后以60 % 乙醇作空白对照,测定每个标准样的吸光度( A ) 值。

再以吸光度( A )值为纵坐标, 以标准样品质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

得到回归方程y = 9 . 8019 x+ 0 . 0186R2= 0 . 999 3 。

1 ) 索氏提取法干燥的金银花用研钵研碎, 称取10 g , 用滤纸包好, 置于索氏提取器中, 取有机溶剂80 mL , 先往索氏提取器中加70 % 的甲醇至与虹吸管相平, 剩余液体加入圆底烧瓶中, 对样品浸泡2 h , 然后在水浴锅上加热回流, 控制温度在70 左右, 虹吸5 次。

把回流液倒于蒸馏瓶中进行减压蒸馏至30 mL , 超声溶解, 用0 . 25 u m 滤膜过滤, 测定其吸光度。

2 ) 超声波法干燥的金银花用研钵研碎, 称取6 g , 置于锥形瓶中, 加入准确量取的100 mL 蒸馏水, 超声溶解,一段时间后过滤, 向滤渣中再加100 mL 蒸馏水,重复上述步骤, 把所得的滤液在离心机以3 000 r /m i n离心10 m i n .在把溶液进行减压蒸馏至30 mL ,得待测液, 测定其吸光度。