如何利用dnasp软件计算单倍型多样性,核苷酸多样性,单倍型数量PAUP软件构建MP树

前言做分子标记的同学都知道，数据分析基本全靠软件。

目前网上有很多软件可以用，POPGENE、NTSYS、AMOV A是最常用的，几乎所有文献中都有用到这三种，另外如果要计算异交率、自交率还要用到MLTR软件，但是这个软件我在网上找了好久都没有中文的使用说明，自己摸索了一段时间，虽然数据格式算是弄懂了，但数据分析时参数的设置还是搞不懂，所以索性没用这个软件分析了。

我的课题是用ISSR检测遗传多样性的，当时在网上搜罗软件的时候就发现，各种软件都有热心网友进行了总结，也写了使用攻略，只是一般都是单个软件写的，找起来挺麻烦，当时找了好几个论坛才找齐，所以我当时对自己说，等我写好论文，我要把这些软件的使用方法全总结在一起，方便大家使用，现在论文撰写总算告一段落了，也该实践这个承诺了。

下面我就依次把POPGENE、NTSYS、AMOV A的使用方法通过图文的方式展现给大家，数据用我自己论文的数据。

不过我的水平有限，也只会对有限的几个参数进行检测，这篇文章也只能作抛砖引玉了，希望有更多的朋友把自己的心得发上来，如果有会用MLTR的也希望能把使用方法拿出来共享一下啦！生物秀ID：bobolove第一部分POPGENE 1.32POPGENE这个软件可以用来测很多遗传多样性参数，包括等位基因数（Na，Ne）、Nei’s 遗传多样性指数（He）、shannon’s多样性信息指数（I）、多态位点百分率（PPB）、遗传分化值（Gst）、基因流（Nm）、遗传距离等等，是用来检测遗传多样性最普遍的软件，使用起来也不难，只要把数据格式弄好就可以了。

1.1 数据格式数据格式在所有软件使用里都是最重要的，把我们检测到的条带在EXCLE里转换成01矩阵后，要再输入TXT里才能在POPGENE中使用。

图1-1是在TXT文档里的数据格式。

图1-1 POPGENE数据格式1.2 打开软件，载入数据依次执行：file→load data→dominate marker data(对ISSR来说是显性标记)→目标TXT 文档，打开后如图1-2所示。

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(2):281~285*基金项目：国家重点基础研究发展规划项目(No.2006CB102100)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 博导， 主要从事分子遗传与动物育种研究。

E­mail:<xqzhang@>. 收搞日期：2007­07­25 接受日期： 2007­09­29 ·研究论文· 利用 DNA 池和测序技术快速筛查候选效应单倍型*杜红丽 1 ，崔建勋 2，张细权 3 **（1.华南理工大学生物科学与工程学院， 广州 510640； 2.广东省农业科学院科技情报研究所， 广州 510640；3.华南农业大学动物科学学院，广州510642） 摘要： 选取产蛋性能具有明显差异的 4 个鸡 （） 品种 （莱航鸡、 阳山鸡、 丝羽乌骨鸡和隐性白洛克鸡）构建品种 DNA 池， 通过测序研究鸡催乳素基因 5'­ 侧翼调控区部分序列 （1028bp ） 的单倍型， 快速筛查到由 4 个单核苷酸多态性 （SNP ） 位点 （C­2402T 、 C­2161G 、 C­2062G 和 G­2040A ） 组成的 2 种最常见单倍型 CCCG 和 TGGA ， 其中 CCCG 在莱航鸡品种中的频率接近 1， 可能利于产蛋。

再利用 RFLP 和 SSCP 将这 4个位点在品种及家系中进行基因分型， 基因分型之后的统计结果与测 序的结果基本相符。

利用农大褐伊泰和丝羽乌骨鸡家系检测CCCG 单倍型的效应， 发现含有此单倍型的单倍型组合具有更高的 产蛋量。

由 6个位点组成的单倍型H3 （CCTCTG ， 由CCCG 再加上T­2101和T­2054组成） 在莱航鸡的频率为 1， 在参考家系中 检测H3的效应， 发现含有 H3的单倍型组合具有很高的产蛋量， 并且与其它类型达到显著性差异。

应用软件计算生物多样性指数在生物多样性研究中，计算生物多样性指数是一项关键任务。

随着科技的进步，应用软件的发展为这类计算提供了极大的便利。

本文将介绍一款应用软件，并阐述如何使用它来计算生物多样性指数。

本文的主题为“应用软件计算生物多样性指数”。

在此主题下，我们将介绍一款专门为此目的设计的软件，并详细说明如何使用它来计算生物多样性指数。

本款应用软件名为“生物多样性计算器”，它是一款专门为生物多样性研究者设计的工具。

软件界面友好，操作简便，并能有效处理大规模数据。

通过该软件，研究者可以轻松计算生物多样性指数，从而更好地进行生物多样性评估与保护工作。

(1)数据输入：用户可以直接输入生物种类和种群数量等数据，或者导入外部数据文件。

(2)数据分析：软件内置多种生物多样性指数计算方法，如Simpson 指数、Shannon-Wiener指数等。

(3)数据可视化：软件支持将计算结果以图表形式呈现，方便研究者进行结果分析。

(4)数据导出：用户可以将计算结果和可视化图表导出为CSV或PNG文件，以便进一步处理和使用。

(1)下载并安装“生物多样性计算器”软件。

(2)打开软件，在主界面中选择需要计算的生物多样性指数类型，如Simpson指数或Shannon-Wiener指数。

(4)点击“计算”按钮，软件将自动计算并显示出生物多样性指数。

(5)如果需要，可以使用软件提供的数据可视化功能，将计算结果以图表形式呈现。

(6)可以将计算结果和可视化图表导出为CSV或PNG文件，以便进一步处理和使用。

在撰写本文时，我们始终注重逻辑清晰和条理分明。

首先介绍了应用软件计算生物多样性指数的主题，然后阐述了软件的基本概念和功能，最后详细讲解了如何使用该软件进行生物多样性指数计算。

通过逐步展开情节的方式，使读者能够轻松理解整个计算过程。

在本文的撰写过程中，我们始终注重语言的准确性和简洁性。

通过使用通俗易懂的语言，以及避免使用口语化和夸张的表达方式，我们确保了文章的语言表达准确无误。

如何利用dnasp软件计算单倍型多样性，PAUP软件构建MP树1、利用BioEdit和Clustalx对所有需要构建系统进化树的个体进行序列比对2、将Clustalx比对结果中的*.aln文件利用BioEdit打开，在其中删除clustal cons文件，这时候有一行“*******”消失，将该文件转存为*.fst格式文件。

3、用dnasp软件打开该文件，弹出对话框选择关闭，然后选择analysi s→DNA polymorphism，弹出对话框看一下序列长度对不对，然后点击OK，在弹出的对话框中的Number of Haplotypes,后面对应的数值即为单倍型多样性，Standard Deviation of Haplotype diversity后面对应为SD（标准差）值。

在该对话框中Nucleotidy diversity即为核苷酸多样性。

注：单倍型多样性即指在某一个种群或几个种群中存在差异序列的数量。

4、用dnasp软件打开该文件，弹出对话框选择关闭，然后选择Genetate→Haplotype Datefile，弹出对话框看一下序列长度对不对，然后点击OK，在弹出的对话框中输入保存的路径和文件名（注意不要修改扩展名），点击确定，在弹出的对话框中给出了单倍型数量和每个单倍型中包含的样本信息，在后续处理中每个单倍型只需选择一个样本。

5、用dnasp软件打开该文件，弹出对话框选择关闭，然后选择Overview→polymorphismdate，弹出对话框看一下序列长度对不对，然后点击OK，里面有单倍型多样性和核苷酸多样性信息。

6、由于PAUP并不识别该格式软件，因此需要利用dnasp软件将其转存为*.nex格式，方法如下，用dnasp软件打比对后的*.fat格式文件，在菜单中选择fil e→save/export date as →NEXUS file format，命名，选择路径。

7、打开PAUP软件，打开刚才利用dnasp转存的文件。

R软件计算生物多样性指数R软件计算生物多样性指数R软件中有众多的程序包可以进行生物多样性指数的计算，这里介绍一下用vegan包计算生物多样性指数的方法：将R软件安装好后，输入以下命令，即可计算出常用的生物多样性指数。

#第一步#是矩阵的整理，建议在Excel中整理成如下格式，再用R整理成物种矩阵,注意:列的名字要完全一致，包括大小写。

plotname species abundanceplot1 sp1 3plot1 sp2 6plot1 sp3 1plot1 sp4 2plot1 sp5 1plot2 sp1 8plot2 sp3 30plot3 sp4 2plot3 sp2 1plot3 sp6 1plot3 sp7 3.....#在Excel中，另存为csv格式，如存名称为 herbplots.csv。

#第二步读取文件herb.data<- read.csv("D:/herb/herbplots.csv", header=T)#第三步转换为矩阵#导入spaa程序包，如果没有安装的话，需要用install.packages('spaa')安装library(spaa)herb.mat<- data2mat(herb.data)#此时生成的矩阵，形式如下：plots sp1 sp2 sp3 sp4 sp5 sp6 sp7plot1 3612100plot2 80300000plot3 0102013#导入vegan ，如果没有安装的话，需要先安装vegan程序包install.packages("vegan")library(vegan)#计算Shannon-Wiener指数Shannon.Wiener <- diversity(herb.mat, index ="shannon") #计算Simpson指数Simpson <- diversity(herb.mat, index ="simpson")#计算Inverse Simpson指数Inverse.Simpson <- diversity(herb.mat, index ="inv")#计算物种累计数S <- specnumber(herb.mat)plot(S)#计算Pielou均匀度指数J <- Shannon.Wiener/log(S)。

基因测序数据分析的方法与工具介绍基因测序是一种广泛应用于生物学和遗传学研究的技术，它可以揭示生物体的基因组结构和功能。

然而，从测序仪中获得的原始数据是一大批序列片段，需要经过严格的数据分析和解释才能提取有用的信息。

本文将介绍基因测序数据分析的一些常用方法和工具，帮助读者更好地理解和应用基因测序数据。

1. 数据预处理基因测序数据通常包含原始测序片段，这些片段需要进行一系列的预处理步骤，以确保数据质量和一致性。

预处理可以包括去除低质量碱基、去除引物序列、纠正读长和碱基错误等。

常用的工具包括Trimmomatic、Cutadapt和FastQC等。

2. 序列比对与拼接在数据预处理之后，将测序片段与参考基因组或相关数据库中的序列进行比对和拼接，以确定样品中的基因组成。

常用的比对工具有Bowtie、BWA和BLAST等。

拼接工具可以将测序片段组装成连续的序列，如SOAPdenovo和SPAdes等。

3. 变异检测与注释变异检测是基因测序数据分析的重要一环，可以帮助鉴定基因组中存在的变异，如单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（Indel）和结构变异等。

常用的变异检测工具有GATK、Samtools和VarScan等。

注释工具可以对检测到的变异进行功能注释，如SnpEff和ANNOVAR等。

4. 转录组分析转录组测序是研究基因表达的重要手段，可以揭示不同条件下基因的表达差异和转录本变异。

转录组分析通常包括表达量估计、差异表达基因分析和功能富集分析等。

常用的工具有Cufflinks、DESeq2和GOseq等。

5. 小RNA测序分析小RNA是一类长度较短的RNA分子，具有多种生物学功能。

小RNA 测序分析可以帮助研究者鉴定和定量各种类型的小RNA，如miRNA、siRNA和piRNA等。

常用的工具有miRDeep、mirBase和RNAhybrid等。

6. 元组分析元组分析可以从基因组和转录组的角度研究微生物群落的组成和功能。

主页/SHEsisMain.htm计算页面/myAnalysis.phpShesis软件使用说明1． Choose the analysis you need，选择你所需要的分析种类，一共有3种：I Single site analysis 也就是对每个位点进行分析，主要是进行等位基因频率，基因型频率的统计，以及针对等位基因和基因型分别进行case组和control组的卡方检测和odds ratio的计算，最后当然也会分别对case组和control组进行HWE的检测。

II Pair-loci D’/r2 value 选择了这个选项后，软件会对输入的所有位点进行两两的D’和r2的计算。

比如说输入了3个位点的数据，那么就会进行12，13和23这三种组合的计算。

D’和r2都是用来对位点间LD紧密程度进行度量的两个值。

III Haplotype analysis 选择了这个选项的话，就可以对单倍型进行分析了。

分析结果包括这些位点形成了哪些单倍型，每个单倍型的频率，以及单倍型频率在case和control中的分布是否有差异。

这时候软件会为每种单倍型都给出一个p值，这个值代表这种单倍型是否在分组中有差异，另外还会给出一个总的p值，这个值是对所有单倍型综合考察后得出的。

最后也会给出odds ratio的值。

以上3项至少选1项，可以3项都选。

2． Number of sites 这里输入你所需要分析的位点数，不要输错哦。

3． Selected sites for haplotype analysis 在这里你可以通过输入一个字符串来选择对哪些位点进行单倍型分析，比如你输入了4个位点的数据，但是你只想分析第一，第二，第四个位点形成的单倍型的情况，那么你可以输入1 1 0 1，这样的话第三个位点就不会被分析了。

如果不输入，默认是所有位点都分析。

4． Calculate linkage disequilibrium in 这个下拉菜单可以让你选择在计算LD的时候，是只在case中或者control中计算还是全都计算。

浙江大学学报(农业与生命科学版)37(5):485~492,2011Journal of Zhejiang University(Ag r ic1&Life Sci1)文章编号:1008-9209(2011)05-0485-08DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2011.05.003多倍体植物中单核苷酸多态性(SNPs)的开发贺道华,邢宏宜,赵俊兴,赵艳宁,齐程,王艳婷(西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100)摘要:单核苷酸多态性(SN P)是指在基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的一种DN A序列多态性.在人、拟南芥、水稻等二倍体生物中,已经开发出大量的SNP标记并被用于群体结构分析、关联作图等研究,而在棉花、油菜、小麦等多倍体植物中,SN P的开发与应用却进展迟缓.为促进多倍体植物中SN P的开发,本文对多倍体植物中SN P标记开发所遇到的难题进行了阐述,并对多倍体中SN P标记开发方法进行了梳理,包括位点特异性引物的PCR片段直接测序,利用多倍体的近缘二倍体区分SN Ps和部分同源序列间的差异(homoeo log ous sequence var iants,H SV s),利用2代测序技术大规模发掘SN Ps,基于公共数据库的序列通过生物信息学分析获取候选SNP s,通过遗传(分离)模式的研究验证SN Ps等.利用上述方法可实现多倍体植物中SN P标记的大规模开发.关键词:多倍体;单核苷酸多态性;标记开发;部分同源性中图分类号:Q78文献标志码:AH E Dao-hua,XIN G H ong-y i,ZH A O Jun-x ing,ZHA O Y an-ning,Q I Cheng,W A NG Yan-ting(Colleg eof A g ronomy,N or thw es t A&F Univer sity,Yang ling,Shaanx i712100,China)Single nucleotide polymorphism(SNP)discovery in polyploid plants.Jo urnal o f Zhejiang U niver sity (Ag r ic1&L ife Sci1),2011,37(5):485-492Abstract:Sing le nucleot ide po ly mor phism(SN P)is a kind of DN A polymor phism in g eno me w hichr esult s fro m the v ariance of sing le nucleotide.In diplo id org anisms(such as human,A r abidop sis thaliana,Or yz a sativa,et c.),many SN P mar ker s w ere disco ver ed as g enet ic mar kers,and had been w idely used fo r population par ameter estimat ion and asso ciation mapping.H ow ever,SN P discov ery and applicatio n in the po ly ploid or ganisms(such as Goss y p ium hir sutum,B rassica nap us,T r iticum aestivum,etc.)w ere limited and lag ged.In o rder to facilitate SN P disco ver y in polyplo id plants,thispaper rev iew ed the g eno mic co mplexity of po ly ploidy,t he obstacle and the so lutions o f SN Ps discov ery in polyplo id plant s,including these methods of sequencing o f polymer ase chain reactio n(PCR)amplico nsfr om locus-specific pr imer,distinguishing SN Ps fr om homo eolog ous sequence var iants(H SV s)thr oughliving models of allo po ly ploid ancest ral genomes,use of nex t-generation sequencing for SN P disco very,scanning along seeking po tential SN P s by bio informat ics too l,M endelian t ransmission test o f candidate SN Ps.In conclusion,the applications of solutions mentioned abov e a re feasible and reliable for the high-收稿日期:2010-09-30基金项目:国家自然科学基金资助项目(30971821);陕西省自然科学基金资助项目(2010JQ3005);西北农林科技大学唐仲英育种基金资助项目(A212020901).作者简介:贺道华(1975)),男,湖北随州人,博士,副教授,主要从事棉花育种与生物技术方面的研究.E-mail:daohuahe@ n w .通信作者:邢宏宜,男,副研究员,主要从事棉花遗传育种研究.E-mail:xinghongyi1169@.浙江大学学报(农业与生命科学版)thro ughput SN P discov ery in polyploid plants.Key words:polyplo id;single nucleo tide po lymo rphism(SN P);mar ker disco ver y;ho moeolog y单核苷酸多态性(sing le nucleo tide po lymor phism,SNP)是指在基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性.SNP现象在基因组中广泛存在,并具有很高的信息含量,在分析遗传变异、群体结构、图谱构建、数量性状位点(quantitative trait locus,QT L)定位、关联作图、图位克隆和标记辅助选择等方面具有广阔的应用前景[1].随着SN P检测和分析技术的进一步发展,尤其是与DNA芯片等技术的结合,它已成为第3代遗传标记,并有望取代目前最常用的简单序列重复(sim ple sequence repeat,SSR)技术进入基因应用研究领域[2].SNP分析技术有近百种,其中只有极少部分可用于开发SNPs,大部分只能检测已知的SN Ps但不能发现新的SNPs[3].对未知SNPs 进行分析,即找寻未知的SNPs,是SNPs标记进入应用领域的前提.检测未知SN P有许多方法,如梯度凝胶电泳(g radient g el electr ophoresis,GGE)、单链构象多态性(single-strand co nform ation polym orphism, SSCP)、变性的高效液相色谱检测(denaturing hig h perform ance liquid chromatog raphy, DH PLC)、限制性片段长度多态性(restr ictio n frag ment length po lymo rphism,RFLP)、分子杂交、异源双链核酸分子多态性分析(hetero duplex nucleic poly morphism assay, H PA)、简化代表性鸟枪法测序(reduced representation shotgun sequencing,RRS)和错配裂解法(mism atch cleavag e,M C)等[4],但这些方法只能发现DNA序列(或片段)中含有SN Ps,不能探明突变的精确位置和碱基类别.要想探明突变的位置和碱基类别,必须对那些含有SNPs的DNA链进行测序.借助于人类基因组SNP研究的方法和结果,研究者在植物中进行了SNPs的开发,已经在拟南芥(A rabidop sis thaliana)、水稻(Or y z a sativ a)、玉米(Zea m ay s)等二倍体植物中取得了大量的研究成果.然而在多倍体植物中,如甘蓝型油菜(Br assica nap us)、陆地棉(Gossy p ium hir sutum)、普通小麦(T riticum aestivum)、甘蔗(Sacchar um of f icinar um)、马铃薯(Solanum tuber osum),SNPs的开发却相当缓慢.本文对多倍体植物中SN P标记开发所遇到的难题进行了阐述,并对多倍体植物中SNP标记开发方法进行了梳理,以期为多倍体植物中SNP标记的大规模开发提供参考.1多倍体植物中SNPs开发的障碍植物界,特别是与人类生产生活密切相关的栽培物种,大部分都是多倍体,如甘蓝型油菜、陆地棉、烟草、花生等属于异源四倍体,普通小麦属于异源六倍体;即使是大豆,也属于古四倍体(paleo tetraploidy).还有一些植物如甘蔗、马铃薯、香蕉等属于高度杂合的同源多倍体.由于其多倍体(poly ploid)及古多倍体(paleopo lyploidy;如棉属[5]、大豆)的特性,基因组中存在直向同源(o rtho logous;不同物种之间的同源性)基因和数量不等的横向同源(paralogo us;一个物种内由同一祖先复制而来的多个基因的同源性)基因,使得许多SNP开发、验证和检测方法不能完全从二倍体直接引用到多倍体的研究中来.当前在多倍体物种中,通过序列比对所发现的÷SNPs"很多是品种内的多态性[也就是部分同源(异源多倍体内亚基因组间的同源性)序列间的差异(hom oeolog ous sequence variants,H SVs),或者基因家族成员间的核苷酸变异(paralog ous sequence variants,PSV s)],而不是品种间的多态性[即不是等位同源(homo logo us)序列间的差异,不是真正的SNPs].多倍体中SNPs的开发非常复杂,因为研究者必须区分:1)基因家族成员间的核苷酸变异(PSVs);2)部分同源序列间的核苷酸差异(H SV s);3)测序错误486第37卷贺道华,等:多倍体植物中单核苷酸多态性(S NPs)的开发(sequence errors);4)等位同源序列间的差异(SNP).只有后者才可以作为遗传标记的SN Ps.多倍体植物中SNPs的开发还要考虑:1)多倍体植物的繁殖方式;2)是同源多倍体还是异源多倍体(autopo lyploid or allopo lyploid).对于自花授粉和常异花授粉的异源多倍体(如普通小麦、陆地棉等),通过多代自交可获得基因型纯合体,因此源自单个的基因型纯合体的单核苷酸差异通常仅包括PSV s和H SVs的2种序列差异,即由一个个体的扩增子测序出的多个单体型(haplotypes)必定不会来自同源基因.而对于同源多倍体(如甘蔗)和专性异交的异源多倍体(如三叶草),基因型高度杂合,由单个个体的扩增子测序出的多个单倍型还可能来自同源基因,即同一个体中存在的单核苷酸差异包括等位同源、横向同源和部分同源的3种序列差异;因此,在同源多倍体和专性异交的异源多倍体中,通过扩增子测序比对而预测出的许多÷SNPs"不能通过孟德尔遗传试验的验证,也就是说,80%以上的÷SNPs"属于H SVs和PSVs,或者是测序错误[6],不能作为遗传标记使用.Ravel等[7]以26个小麦品系为材料,针对21个基因进行PCR扩增,并直接进行测序;通过序列比对,挖掘SNPs.结果发现:检测出的大多数÷SNPs"属于2个不同位点间的单核苷酸差异;因多倍化导致的基因组过大使得普通小麦中SN P的开发相当困难.又如陆地棉中逆境应答基因GhN A C家族至少含有6个成员[8] (GhN AC1~GhN A C6),且具有保守的内含子-外显子结构,蛋白质序列也高度相似.对于这样的家族式基因,由于横向同源基因的干扰,开发SN Ps的难度极大.当然,多倍体中也有部分基因不存在基因家族,如棉属中控制细胞壁合成与纤维伸长的基因GhX T H1,在陆地棉中只有2个拷贝(分别位于部分同源的At、Dt亚基因组上),而在陆地棉的祖先基因组的二倍体现代种)))亚洲棉和雷蒙德氏棉中只有1个拷贝[9].对于这种非家族式基因,不存在横向同源基因的干扰;但是这种低拷贝(不存在基因家族)的基因,在多倍体中也只是极少的一部分,大多数基因是以基因家族的形式存在的,排除横向同源基因的干扰是无法回避的问题.总的来说,和二倍体相比,因部分同源基因的干扰(主要是异源多倍体中)和高度杂合(主要是同源多倍体中)的特性,多倍体植物中SNPs的开发相当缓慢.2位点特异性引物的PCR片段直接测序开发SN Ps根据候选基因或EST序列设计PCR引物,对PCR产物进行克隆测序;或者利用检测未知点突变的技术,先发现/确认点突变的存在,然后对突变区进行测序.在测序的基础上应用软件Genalys或DNAStar和Clustal等,分析测序结果,排除测序错误,开发SNPs.为了消除部分直向同源、横向同源位点的干扰,使PCR扩增子仅源自等位同源位点,必须设计基因(位点)特异性引物,只对单个特定位点进行扩增,获得单扩增子,然后对PCR产物进行克隆测序[10].如何设计基因(位点)特异性引物?通常,内含子的序列多样性高于外显子[11].通过多倍体中亚基因组间内含子的序列差异可以设计位点特异的引物,从而挖掘等位基因间的多态性[12].例如:利用物种间的共线性,Blake等[12]通过小麦cDNA-水稻gDNA的序列比对,确定小麦内含子的位置,设计外显子锚定(exo n-anchored)的引物;以小麦g DNA为模板对内含子进行扩增,然后通过扩增产物对内含子进行测序,即获知目标基因的内含子序列(部分同源的3个内含子拷贝分别位于A、B和D亚基因组上).利用部分同源的3个内含子的序列差异,设计亚基因组特异的引物,针对多倍体中的单个位点进行扩增,通过测序和个体间序列的比较,发现SNPs.Blake等[12]对小麦淀粉合成途径中的3个基因(A gp-L,S UT,Wx)各开发出了亚基因组特异的引物(3对,分别对应于A、B和D亚基因组).Small等[13]采用这种途径对陆地棉中A dh基因进行了拷贝数和序列差异的研究.Ishikaw a等[11]对此法进行了修正,即选择水稻中的单拷贝基因(与小麦的487第5期浙江大学学报(农业与生命科学版)UniGene序列高度同源),确定为基因标点(landmark unique g ene loci,LUGs),然后对LU Gs和小麦的U niGene进行序列比对,推测外显子的连接点,获得TaEST-LUGs以设计PCR引物(锚定在外显子上可对内含子进行扩增),最终开发出内含子中的InDels,从而为根据内含子的序列差异来设计位点特异的引物奠定了基础.目前,小麦中有大量的研究项目在利用基因(位点)特异性引物PCR和扩增子测序的手段进行SN Ps的开发.3利用多倍体的近缘二倍体区分SNPs和H SV s异源多倍体均是由二倍体种间杂交后天然加倍而来.研究表明:三叶草(T r if olium rep ens)中具有部分同源性的O、Pø亚基因组分别与T.occidentale、T.p allescens的基因组高度相似[14];甘蓝型油菜(B.nap us)中具有部分同源性的A、C2个亚基因组分别与白菜型油菜(B.rap a)、甘蓝(B.oleracea)的基因组维持着较高水平的共线性[15];陆地棉(G. hir sutum)中具有部分同源性的At、Dt亚基因组分别与亚洲棉(G.ar bor eum)、雷蒙德氏棉(G.r aimondii)的基因组具有极小的序列分歧[16].这些二倍体被认为是异源多倍体祖先基因组的现代种.二倍体与多倍体亚基因组间的相似性、共线性为多倍体中区分SNPs和H SV s提供了材料基础.H and等[14]利用T.occid entale和T. p allescens来区分三叶草中等位同源和部分同源的序列多态性.由于三叶草的亚基因组O与T.occidentale的基因组存在高度的相似性,从而可以充分地确认来自亚基因组O的序列,其余的即为来自三叶草亚基因组Pø的序列,据此H and等[14]在三叶草中开发出9个基因的SNP 标记.Rahman等[17]利用白菜型油菜(B.r ap a)和甘蓝(B.oleracea)的BAC克隆,分别对甘蓝型油菜(B.nap us)的部分同源基因B n-FA E1. 1和Bn-FA E1.2的侧翼序列进行测序,发现这2个基因的侧翼序列存在差异.据此设计位点特异性引物,在甘蓝型油菜中消除了Bn-F AE1.1的干扰,开发出Bn-FA E1.2的SNP 标记[17].A n等[18]根据基因R2R3-M YB的序列设计简并引物,对陆地棉(G.hir sutum)、亚洲棉(G.arboreum)和雷蒙德氏棉(G.raimondii)3个物种的g DNA进行扩增、克隆和测序(测序须有重复,以识别测序错误,并使被测克隆包含该基因的2个部分同源位点),再对所得序列进行系统发育聚类(phylo genetic cluster ing),排除陆地棉中的H SVs,开发出该基因的SNP 标记.4利用第2代测序技术发掘SN Ps第2代测序(next g eneration sequencing, NGS)技术的发展使得测序费用大幅度地降低,测序效率极大地提高,大规模地DNA变异研究变得经济可行[19],SNPs的开发和应用也因而进入快速发展阶段[20].利用NGS技术(So lex a,Roche454和SOLID等),可以对大量个体的全基因组或转录组进行快速的测序,对所获得序列进行生物信息学分析,发掘候选SNPs.Oliver等[21]选择燕麦(异源六倍体)的4个品种构建了cDNA文库,通过Ro che454测序获得100万条序列,组装成127000余个重叠群,利用生物信息学分析筛除重叠群中H SVs,获得了9448个候选SNPs;对其中的96个位点,Oliver等[21]利用高分辨率溶解(hig h-resolution m elting,H RM)分析进行候选SNPs的验证,发现52个(占54%)位点在作图群体的亲本间存在多态性,48个在作图群体中的分离符合孟德尔比例,44个SNPs被定位到连锁图谱上.H yten等[20]把Roche454和Solex a2种NGS结果结合起来,在大豆基因组中进行高通量的SNPs开发,通过组装比对获得了3487个候选SNPs,其中2795个候选SNPs含有足够的侧翼序列,适宜设计SNP分型方法;Sang er测序表明86%的候选SNPs是真实的;利用Go ldenGate分型鉴定表明,827488第37卷贺道华,等:多倍体植物中单核苷酸多态性(S NPs)的开发个(占79%)候选SNPs获得确认.Trick等[22]对甘蓝型油菜的cDNA文库进行Solexa测序,然后利用M AQ软件(Ver0.6.8)进行序列比对和SNPs的筛查.Bundock等[23]通过Roche 454测序在甘蔗基因组中开发SNPs;类似的研究在陆地棉中也已经启动[24].5基于公共数据库的序列信息,通过生物信息学分析开发SN Ps公共数据库中已有大量的表达序列标签(ESTs)、序列标签位点(STSs)、cDN A文库和gDNA等序列信息,在这些序列之间必然存在大量的重叠区域.运用计算机软件[25](如Poly bayes和SNP pipeline等),对重叠区域进行序列比较,并运用一些软件(如XGA P)删除由测序造成的碱基错读,就可得到候选SN P甚至真正的SNP.这种策略可大大降低成本,已被用于SN P标记的大规模开发[26].首先把下载的序列组装为重叠群(co ntig),通过序列比对获得重叠区段的单核苷酸多态性.当然这些多态性包括同源序列SN Ps、H SVs和PSV s,以及测序错误;而且多倍体中因部分同源序列的存在会导致重叠区具有较高的序列多态性[27],若重叠群中有÷横向同源序列"的存在,则重叠区的多态性更高;若重叠群仅含÷等位同源序列",则重叠区的多态性较低.如:小麦的部分同源序列间的变异频率是1H SV/24bp,同源序列间的变异频率为1 SN P/540bp[28].一般情况下,真正的SN Ps会共分离,数个多态性位点的核苷酸是协同变化的(即共分离从而形成特定的单体型[27,29-30]),而测序错误不会共分离(non-co-seg regating),且因测序错误所产生的伪SNPs其冗余度(redundancy)较低.Batley等[31]利用SN PSer ver和AutoSNP计算重叠区中单核苷酸多态性的冗余度和共分离的冗余度.在排除测序错误的基础上,Barker等[27]把÷SNP"分类为品种内(直向同源、横向同源)SNPs和品种间(等位同源)SNPs;若SNPs所在序列在品种内无变化,仅在品种间有变化,则该SNPs通过验证的可能性较大,可以作为分子标记.在异源六倍体小麦中,通过重叠区的序列比对尽管发现大量的序列多态性,但Barker等[27]认为只有一部分(占26%)可作为分子标记.Barker 等[27]的方法的缺点是低估了SNPs的数量,因为同一品种内的基因家族成员间、部分同源序列间不可能完全序列一致.T ang等[29]开发出软件QualitySNP,从而利用生物信息学的方法来排除测序错误、÷横向同源序列"和÷部分同源序列"3方面的干扰.首先对来自公共数据库的序列进行聚类,则÷等位同源序列"和÷横向同源序列"、÷部分同源序列"都汇聚到同一簇(cluster)中;然后在该簇中定义单体型,根据所定义的单体型,识别出÷部分同源序列"亚群、÷横向同源序列"亚群和测序错误,最后的÷等位同源序列"亚群中的单核苷酸多态性即为候选的SN Ps.基于比较基因组学的知识,根据模式植物水稻的序列信息,对来自公共数据库的麦属EST s序列,先用CAP3程序进行组装(结果是所有的同源序列和部分同源序列、横向同源序列聚集到一起),再用SNP分析算法[32](SNP-analy sis algo rithm)把横向同源与部分同源序列分离出来.这种分析可通过Wheat Estim ated Tr anscript Serv er(WhETS)来完成.Lucyshy n等[33]查询GenBank获得了353个EST可能为TaRP L3的序列,通过组装和SNP分析法则获得了6个重叠群;根据重叠群中EST s序列的信息,推测这6个重叠群对应于横向同源的2组基因(R PL3-A和R PL3-B),并开发了RFLP标记以区分各组基因中3个部分同源基因:对于T aRPL3-A的3个部分同源基因(RP L3-A3,RP L3-A2,RP L3-A1),可以用E co72I和E co147I进行酶切;对于T aR PL3-B的3个部分同源基因(RPL3-B2, R PL3-B1,R PL3-B3),可以用N co I和Stu I进行酶切.因部分同源基因间的酶切位点不同,酶切后均产生各基因位点特异的片段,从而有效地区分T aR PL3基因家族的6个成员;通过RACE、TA克隆和测序,用DNAStar和GENEDOC进行序列分析,开发出T aR PL3-A3基因的SNP标记.Spangenberg等[34-35]利用软件Auto SNP489第5期浙江大学学报(农业与生命科学版)对三叶草的42017条EST序列进行拼接,在各重叠群的重叠区域进行SNP的挖掘,发现1409条基因序列中含有18517个SNP位点. Co gan等[36]对这些SNP位点进行了实验验证,并探讨了横向同源和部分同源对SN Ps开发的干扰效应.6通过遗传(分离)模式研究验证SN Ps通过上述扩增子测序、近缘二倍体协助判别、高通量测序平台和生物信息学分析所获得的单核苷酸多态性只能称为÷电子SNP (electronic SNP,eSNP)".多倍体的这些eSNP 绝大部分是亚基因组间的多态性(H SV s),而非亚基因组内的SNP,因此只能称为÷半SNP (hem-i SNPs)".如:T rick等[22]在甘蓝型油菜(B.nap us)中发现,2个品种间的单核苷酸多态性有23330~41593个,但这其中的大多数(87.5%~91.2%)属于部分同源(A亚基因组与C亚基因组间)基因间的多态性.另外,有部分eSNP是因为未能完全剔除测序错误而产生的,故只能称为÷伪SNP(negative SNP)".一般序列分析的错误率是1bp/100bp,刚好相当于许多植物种内SNPs发生的频率[37];详细地搜索SNPs要检测许多基因型,这样又混合了序列错误[38].如果测序错误没被及时检测出来,将导致÷伪SNP"的产生.若要使挖掘出的eSNPs能够作为分子标记,从而用于连锁图谱构建、QTL定位、关联作图等工作,则需进行SNP验证.利用eSNP对孟德尔分离群体进行分型,研究eSNP在分离群体中的分离模式(即是否符合孟德尔分离比例)是验证eSNPs的最佳途径.Law less等[6]发现:多倍体的eSNP位点的等位基因,大部分在孟德尔分离群体(即家系作图群体、亲本和近缘二倍体物种的材料)中的分离不符合孟德尔分离法则,严重偏离孟德尔分离比例.此结论说明来自多倍体的eSNP大部分属于H SVs(即半SN Ps)、PSV s和÷伪SNPs",不能通过SNP验证[14].Trick等[22]利用DH群体对所挖掘的SN Ps的遗传模式进行了研究,发现SNPs的等位基因的分离模式基本上符合基因组标记的分离比.只有经过孟德尔遗传试验验证,符合孟德尔分离比的eSNP才是真正可作为遗传标记的SNP.7结语与展望当前,SNPs的研究已成为后基因组时代的主要内容之一,顶尖杂志在近几年发表了大量的开发SNPs的论文;高通量的SN P分型技术也在不断发展更新.国际上SN P数据库,如美国NCBI的dbSNP,欧洲的H GVbase,麻省理工学院的SNP数据库等,也在不断积累大量的SNP信息.Solex a,Roche454和SOLID等高通量的2代测序平台的成熟,海量序列信息的快速增长和生物信息学软件的不断推出为SNPs的开发提供了极大的便利.从某种意义上说,我们已进入SNPs时代.对人类SNPs的开发、描述及其在确定表型中的成功标志着一个新里程碑的出现[39],极大地促进了SNPs在动植物基因组研究中的应用.植物的高度遗传多样性更有利于SN Ps的开发.利用植物的近等基因系直接分析单体型SNP;利用内含子的序列差异,设计位点特异性引物,获得单扩增子,通过测序和个体间序列的比较,发现SNPs;利用多倍体的近缘二倍体来排除H SVs,从而开发SNPs;基于高通量NGS 平台对大量个体的基因组或转录组进行测序,积聚含SNPs的序列;利用生物信息学分析开发候选SNPs;利用孟德尔分离群体分析eSNP 的遗传分离模式从而验证SNP的真实性.这些都为多倍体植物中SNP的开发提供了可行的方案.通过大批量、高通量SNPs的挖掘与验证,再加上高效低廉的SNP检测手段,有望为多倍体植物中SNP单体型遗传图谱的构建和关联分析等提供快速有效的途径,为多倍体植物基因组研究绘制出更加精细、实用的蓝图.References:[1]Ganal M W,Altmann T,RÊder M S.SNPiden tification in crop plants[J].Current Opinion in490第37卷贺道华,等:多倍体植物中单核苷酸多态性(S NPs)的开发Plant Biology,2009,12(2):211-217.[2]DU We-i nan,SU N Hong-xia,FANG Fu-de(杜玮南,孙红霞,方福德).Th e res earch developmen t of singlenu cleotide polymorphis m[J].Acta AcademiaeMedicinae Sinicae(中国医学科学院学报),2000,22(4):392-394.(in Chin ese)[3]TANG Di,WANG Zh-i m in(唐棣,王志民).Advancesin methods for SNPs detection[J].Journal of 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