酶法制备低分子量肝素及其活性研究

2000年2月 云南化工 Feb.2000　第27卷第1期 Yunnan Chemical Technology Vol.27,No1　低分子肝素及其制备董学畅1,张淑桂2,杨素仙1Ξ(1　云南民族学院化学系,昆明650003;　2　云南大学国际学术交流中心,昆明650091)摘　要:　扼要介绍和评述低分子肝素的化学结构、性质、作用机制及其制备方法。

关键词:　肝素;　低分子;　制备中图分类号:　O636.1+2 文献标识码:　A 文章编号:　1004-275X(2000)01-0044-02The Low Molecular Weight H eparin and Its PraperationDONG Xue-ch ang,ZH ANG Shu-gui,YANG Shu-xian(Department of Chemisty,Yunnan Nationalites Institute,Kunming650031,China)Abstract:　In this paper,the chemical structures,properites and reaction mechanism of the low molecular weight heparin and its preparation methods are introduced and reviewed briefly.K eyw ords:　heparin;　low molecular weight heparin;　preparation 肝素自1916年Molean发现其良好的抗凝作用以来,历经半个多世纪,作为一种重要的生化药物而被广泛地应用在医药临床上。

肝素不仅具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂等多种生物功能,同时也是一种防治深部静脉血栓、肺栓塞或其它血栓的有效药物。

但是肝素在临床应用时常伴有出血、血小板减少,骨质疏松等副作用,有时甚至可引起致死性颅内出血,据报道出血率高达35%。

浅析系列肝素药物质量分析及控制研究作者：田玉晔来源：《科技风》2020年第13期摘;要：肝素是临床医学较为常用的一种抗凝剂，近年来，临床医学和药理学两大学科的科研成果不断显现，使肝素的应用范围也随之扩大，尤其在抗炎杀菌、调节免疫、抗动脉硬化、抗肿瘤等药理学应用领域取得了突破性进展。

但是，由于肝素提取自天然动物组织，质量属性难于控制，无形当中增加了患者的用药风险。

因此，本文将以提高肝素药物质量的安全可靠性为主要目的，围绕系列肝素药物的质量分析与控制方法展开论述。

关键词：系列肝素药物;质量分析;控制方法本文利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对肝素分子量进行检测，利用离子色谱法对肝素中氨基糖的组成结构进行分析，对肝素中的硫酸根进行定量定性分析。

通过采用现代仪器分析法，能够深入探究肝素中各个成分的结构特点，进而对肝素药物的质量进行有效控制，以降低患者的用药风险，为肝素药物在临床医学与药理学的实际应用提供确凿的数据支持。

1 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析肝素分子量1.1 质量分析基本原理聚丙烯酰胶凝胶电泳检测法将聚丙烯酰胺凝胶作为中间介质，该介质主要由甲叉双丙烯酰胺以及丙烯酰胺聚合而成，较为常见的两种聚合方法为化学聚合与光聚合。

化学聚合的基本反应原理是：S2O82-+e-→SO42-+SO4-，如果R·表示自由基，M表示丙烯酰胺单位，聚合过程反应式可以表示为：R·+M→RM·，RM·+M→RMM·，RMM·+M→RMMM·;ect·当CH2=CH-乙烯基依次聚合，就构成了丙烯酰胺长链，进而为甲叉键交联创造了有利条件，然后在甲叉键交联作用下形成一个三维网状结构。

而用于光聚合的催化剂是核黄素，该物质在光合作用下，本身产生自由基，并在两到三小时之内就可以完成化学聚合反应。

1.2 实验阶段此次分析肝素分子量实验采用的标准样品是检定合格的肝素钠，实验样品来自于国内某制药企业，而酶部分降解低分子量肝素与肝素8糖样品均产自美国Sigma-Aldrich公司。

肝素原应用研究进展陈祥娥【摘要】Heparosan is a polysaccharide found in the capsule of certain bacteria ,as well as the biosynthesis precursor of heparin and heparan sulfate of animals .Now researches mainly focus on the non‐animal origin produc‐tion of heparin which employs chemical or biological modifications and takes the heparosan from fermentation as precursor .It has been recently found that heparosan can serve as a good drug carrier and regulate the intestinal flora and so on .This article reviews the latest progress of its application .%肝素原（heparosan）是某些细菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，同时也是肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前体。

以发酵获得的肝素原为前体骨架多糖，采用化学或生物修饰生产肝素及其类似物是目前非动物来源肝素生产的研究热点。

近来发现，肝素原还可作为良好的药物载体，具有调节肠道菌群等作用。

本文对其应用研究作一综述。

【期刊名称】《济宁医学院学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P153-155,158)【关键词】肝素前体;肝素;药物载体;肠道菌群【作者】陈祥娥【作者单位】济宁医学院生物科学学院，山东日照 276826【正文语种】中文【中图分类】Q533肝素原（heparosan，又称 N－acetylheparosan），（－4－β－D－GlcA－1，4－α－D－GlcNAc－1）n（其中 GlcA 代表葡糖醛酸；GlcNAc代表乙酰氨基葡糖）［1］，是某些细菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，同时也是肝素和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的生物合成前体。

酶法合成硫酸软骨素和肝素糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）是一类以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖（N-乙酰氨基半乳糖）为二糖单位组合而成的聚合物并经硫酸化、变构化修饰而成的酸性、直链多糖,广泛存在于动物细胞表面和周围基质中。

糖胺聚糖具有多种生物学功能包括调节细胞生长、增殖和分化等,被开发成一系列的化妆品、医美和医药产品,其中硫酸软骨素是一种治疗骨关节炎的药物,肝素用于治疗抗坏血栓及作为术后抗凝血药。

目前硫酸软骨素和肝素主要从动物组织中提取,需消耗大量的酸碱,而且该方法制备的硫酸软骨素和肝素中含有大量的其他糖胺聚糖,不仅降低它们的药效,甚至危及生命。

因此,合成结构单一的硫酸软骨素和肝素势在必行,对它们的临床应用和新功能的开发尤为重要。

本文采用酶法催化软骨素和肝素前体合成单一的硫酸软骨素和肝素。

在此过程中,硫酸化所需的硫酸化修饰系统和硫酸基供体3?-磷酸腺苷-5?-磷酸硫酸（3?-phosphoadenosine-5?-phosphosulfate,PAPS）再生系统尤为重要。

本论文通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达鼠源酰基磺酸转移酶（Aryl sulfotransferase IV,ASSTIV）,构建PAPS再生系统;通过在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达动物源硫酸转移酶及差向异构酶构建硫酸化修饰系统。

在此基础上,整合PAPS再生系统及硫酸化修饰系统合成硫酸软骨素和肝素。

主要研究结果如下:（1）优化ASSTIV表达构建PAPS高效再生系统。

分别以pET20b和pColdIII为载体在E.coli BL21中表达ASSTIV,由SDS-PAGE和酶活分析可知pColdIII比pET20b更适合ASSTIV的表达。

为了纯化及突变方便,选择10种信号肽构建ASSTIV的分泌表达系统,结果表明YebF,Cex及PelB等3种信号肽能实现ASSTIV的分泌表达,其中PelB的分泌能力最强,胞外上清的酶活达到0.36±0.01 U/mL。

肝素钠制备技术发展史引言肝素钠（Heparin Sodium）是一种重要的抗凝血药物，广泛应用于医疗领域。

本文将深入探讨肝素钠制备技术的发展历程，并详细介绍各个阶段的重要里程碑。

早期发现与研究1.1 发现肝素的初期研究肝素是由充满糖类的糖蛋白分子构成的抗凝血剂，最早被发现于1916年。

但直到1935年，人们才第一次成功地从猪肺中提取出纯净的肝素。

1.2 肝素的制备方法改进随着对肝素的研究不断深入，人们开始探索更高效的制备方法。

20世纪50年代，科学家们首次成功地通过牛肺提取出肝素，并对其进行纯化和结构分析。

这一突破推动了肝素制备技术的发展。

初级制备技术的应用2.1 动物组织法制备肝素最早的肝素制备方法是利用动物组织（如牛肺、猪肠等）作为原料，通过酶解和纯化等步骤提取肝素。

这种方法虽然简单直接，但对原材料的需求量大，且提纯过程繁琐。

2.2 酶法制备肝素20世纪60年代，酶法制备肝素成为制备肝素钠的主流方法。

该方法使用酶催化剂促进肝素分子的降解，从而提取出肝素的活性片段，再经过纯化和结构修饰等步骤得到肝素钠。

高效纯化技术的发展3.1 离子交换层析技术的应用肝素制备过程中，纯化步骤起着至关重要的作用。

20世纪70年代，离子交换层析技术的引入，使得对肝素的纯化能够更加高效和准确。

这种技术通过选择性吸附和洗脱，迅速去除掉杂质，提取出纯净的肝素。

3.2 亲和层析技术的应用亲和层析技术是另一种重要的纯化方法。

通过将具有对肝素具有亲和力的配体固定在层析柱上，可以特异性地将肝素分子吸附在柱中，然后用特定溶液将其洗提，实现肝素的纯化。

制备技术的改进与创新4.1 基因工程法制备肝素随着基因工程技术的不断发展，基因工程法成为制备肝素的新途径。

通过将肝素相关基因导入细菌或酵母等微生物中，使其表达并产生具有肝素活性的蛋白。

该方法不仅提高了肝素的产量，还实现了工业化生产。

4.2 化学合成法制备肝素另一种重要的创新是化学合成法。

肝素的提取与鉴定设计实验报告一、实验目的本实验旨在了解肝素的提取方法和鉴定方法，掌握肝素的提取技术和纯化方法，并能够利用凝胶过滤层析法进行肝素的鉴定。

二、实验原理1. 肝素的提取：肝素是一种聚糖类物质，可从动物组织中提取。

常用的提取方法有碱水解法、酸水解法和酶解法。

本实验采用酶解法进行肝素的提取。

将动物组织经过清洗、切碎后加入适量的蛋白酶进行酶解，然后经过离心分离得到上清液，再经过乙醇沉淀得到粗品。

2. 肝素的纯化：通过凝胶层析法对粗品进行纯化。

将粗品溶于缓冲液中，然后加入凝胶柱中，利用凝胶柱中不同孔径大小的孔隙分离出不同分子量大小的肝素，并收集相应分子量大小范围内的肝素。

3. 肝素含量测定：利用显色反应测定肝素含量。

将样品与显色剂混合，经过显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算出肝素含量。

三、实验步骤1. 肝素的提取（1）清洗组织：将动物组织用生理盐水清洗干净。

（2）切碎组织：将清洗干净的组织切成小块。

（3）加入蛋白酶：将切碎后的组织加入适量的蛋白酶中进行酶解。

（4）离心分离：将酶解后的混合液进行离心分离，得到上清液。

（5）乙醇沉淀：将上清液加入等体积的乙醇中进行沉淀，得到粗品。

2. 肝素的纯化（1）制备缓冲液：配制0.1mol/L pH7.4磷缓冲液。

（2）柱层析：将粗品溶于缓冲液中，然后加入凝胶柱中进行层析。

收集不同分子量大小范围内的肝素。

3. 肝素含量测定（1）制备标准曲线：取一系列不同浓度的肝素标准品，加入显色剂后测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）测定样品：将纯化后的肝素样品加入显色剂中，经过显色反应后测定吸光度，根据标准曲线计算出肝素含量。

四、实验结果经过酶解和乙醇沉淀得到的粗品经过凝胶层析法进行纯化，得到了不同分子量大小范围内的肝素。

利用显色反应测定肝素含量，计算出不同分子量范围内的肝素含量。

五、实验结论本实验通过酶解法提取动物组织中的肝素，并通过凝胶层析法进行纯化。

最后利用显色反应测定肝素含量。

低分子肝素制备实验报告1. 掌握低分子肝素制备的方法；2. 了解低分子肝素的结构和性质。

实验原理：低分子肝素是肝素的衍生物，具有抗凝血活性和抗血小板聚集作用。

低分子肝素的制备方法一般包括酶解法和酸水解法。

其中，酸水解法是常用的制备方法，它通过将肝素与强酸（如硫酸、盐酸等）反应，在适当的条件下，使肝素断裂为较短的多肽链，并保留肝素的抗凝活性。

实验步骤：1. 预先准备所需试剂：低分子肝素（肝素钠）、酸（如盐酸）、稀土系列盐（如Cl3Ln）、氨水等；2. 将肝素溶解于适量的溶剂中，制备肝素溶液；3. 在适当的实验条件下，将肝素溶液与酸反应，使肝素水解为多肽链；4. 通过添加氨水中和酸，使反应溶液达到适当的pH值，停止反应；5. 通过稀土系列盐与反应溶液中的肝素结合，形成稀土-肝素络合物；6. 通过适当的处理和纯化，制得低分子肝素。

实验结果：经过上述步骤制备的低分子肝素，其结构和性质可以通过质谱分析、红外光谱等方法进行分析。

低分子肝素的结构一般由多肽链组成，具有较短的分子量。

在实验中，还需对低分子肝素的抗凝活性进行测试，以确定制备的有效性。

实验讨论：低分子肝素是肝素的衍生物，具有肝素的抗凝血活性，但由于其较短的分子链，其抗凝活性相对较弱，生物利用度较高。

因此，低分子肝素在临床应用中更为常见，常用于预防和治疗血栓疾病等。

总结：通过本实验，我们掌握了低分子肝素的制备方法，并了解了其结构和性质。

低分子肝素是肝素的衍生物，具有抗凝血活性和抗血小板聚集作用，是一种重要的抗凝剂。

低分子肝素的制备方法包括酶解法和酸水解法，其中酸水解法是常用的方法。

通过实验，我们制备了低分子肝素，并对其进行了结构和性质的分析。

实验结果表明，制备的低分子肝素具有较短的多肽链和较弱的抗凝活性，是一种有效的抗凝剂。

3种复合酶法从肠渣中提取肝素钠的对比研究作者：孙学超黄顾林朱晓雯等来源：《安徽农业科学》2014年第04期摘要[目的] 为肝素钠的大规模生产提供依据。

[方法] 利用3种复合酶从肠渣中提取肝素钠，通过测定提取肝素钠的质量、蛋白含量以及效价对3种复合酶法进行评价。

[结果]由木瓜蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量最高（47%），效价为15 USPU/mg；由胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量为29%，而其效价为34 USPU/mg。

由2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量最少（24%），效价最高（39 USPU/mg）。

[结论] 2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶能有效提取肠渣中残留的肝素钠。

关键词肝素钠；肠渣；酶解；复合酶中图分类号S852文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01074-01基金项目江苏省农业科技支撑项目（BE2012400）。

作者简介孙学超（1987- ），男，山东惠民人，硕士，从事多糖类药物研究。

*通讯作者，高级经济师，从事肠衣及肝素钠的经营及相关技术、工艺研究。

肝素主要来源于动物富含肥大细胞的组织（如肝、肺、内肠等），以O-连接形式与核心蛋白（Core protein，CP）形成肝素蛋白聚糖（Heparin proteoglycan，HepPG）形态存在[1]。

肝素可以与百余种蛋白（如LDL、VLDL、LPL、SOD、AT Ш、IgG等）相互作用，呈现出降血脂[2]、抗动脉粥样硬化[3]、免疫调节[4]、抗炎、抗肿瘤[5]、抗单纯孢疹病毒[6]、抗凝血[7]等生物活性。

肝素于1920年就开始其大规模制备研究，并于1935年应用于临床，是目前世界上产量和销售量最大的来自天然的糖类药物，10 mg肝素钠能在4 h内抑制500 ml血液凝固[8]，目前还没有任何一种药物可以代替它。

在肝素生产中，盐解法具有操作简单且提取的肝素中杂质少等优点从而被国内有很多的厂家采用，但是盐解法在高温使蛋白变性时会包裹肝素钠形成肠渣，造成了肝素钠提取率降低的现象，从而带来损失。

低分子肝素钠分子量1. 介绍低分子肝素钠（Low Molecular Weight Heparin Sodium，简称LMWH）是一种由天然肝素经酶解或化学修饰得到的药物。

它具有许多优点，如生物利用度高、半衰期长、剂量易于控制等，因此在临床上得到广泛应用。

本文将重点介绍低分子肝素钠的分子量及其相关内容。

2. 低分子肝素钠的结构和特点低分子肝素钠是由天然肝素经过化学修饰得到的药物。

它是一种多聚糖，由葡萄糖胺和尿酸两种单糖单位交替连接而成。

与普通肝素相比，低分子肝素钠的特点主要体现在其分子量上。

普通肝素是一种高分子多糖，其平均分子量约为15000道尔顿（Dalton）。

而低分子肝素钠则是通过对普通肝素进行酶解或化学修饰得到的，其平均分子量约为2500-10000道尔顿。

由于其较小的分子量，低分子肝素钠在体内的生物利用度更高，分布更广，清除速度更快。

此外，低分子肝素钠还具有以下特点：•抗凝作用：低分子肝素钠通过与抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin Ⅲ）结合，增强抗凝作用。

它能够抑制凝血酶的活性，从而阻止血液在血管内部形成血栓。

•抗炎作用：低分子肝素钠能够通过调节炎症因子的释放和细胞黏附分子的表达，发挥抗炎作用。

这种作用对于一些炎症性疾病的治疗具有重要意义。

•抗肿瘤作用：低分子肝素钠通过干扰血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMPs）等信号通路，发挥抑制肿瘤生长和转移的作用。

3. 低分子肝素钠的制备方法低分子肝素钠的制备方法主要有两种：酶解法和化学修饰法。

3.1 酶解法酶解法是将普通肝素通过酶的作用进行降解得到低分子肝素钠。

常用的酶有肝素酶、纤溶酶和乳糖酶等。

这些酶能够选择性地降解肝素链中的硫酸基团，从而使分子量减小。

3.2 化学修饰法化学修饰法是通过对普通肝素进行化学修饰，改变其分子结构从而得到低分子肝素钠。

常用的化学修饰方法有羟基乙基化、羧甲基化和N-乙氧羰基化等。

4. 低分子肝素钠的临床应用由于低分子肝素钠具有较好的药代动力学特性和抗凝特性，它在临床上有广泛的应用。

肝素的提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素的研究肝素的提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素的研究摘要：肝素是一种由肝脏以及其他动物组织中提取的天然多糖类化合物，具有广泛的药理活性。

本研究旨在通过提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素，以探究其可能的生物医学应用。

1.引言肝素作为天然多糖类化合物，具有很多药理活性，例如抗凝血、抗炎症和抗肿瘤等。

然而，由于其分子量过大，限制了其在药物递送中的应用。

因此，提取精制和制备低分子肝素成为了研究的热点。

2.肝素的提取精制肝素的提取通常通过酶解法。

首先，将肝脏组织加入到一定量的缓冲液中，使用特定的酶（如糖脂酶和肝素酶）进行酶解，释放出肝素。

接下来，对酶解产物进行过滤、沉淀、洗涤等步骤，最终得到纯化的肝素。

3.亚硝酸法制备低分子肝素为了制备低分子肝素，亚硝酸法被应用在本研究中。

首先，将肝素溶液加入到一定体积的亚硝酸中，加热反应一段时间。

亚硝酸可以将肝素分解成较低分子量的产物。

随后，使用酸性溶液进行中和，使得低分子肝素析出。

最后，通过过滤、干燥等处理步骤，得到低分子肝素。

4.结果与讨论通过对低分子肝素制备的实验，我们发现使用亚硝酸法可以有效地降低肝素的分子量。

在不同反应时间和不同亚硝酸浓度的条件下进行实验，可以得到不同分子量的低分子肝素。

此外，通过对低分子肝素的红外光谱和核磁共振谱的分析，确定了其结构。

5.应用前景低分子肝素具有较原始肝素更小的分子量，因此在药物递送中具有更好的渗透性和生物利用度。

同时，低分子肝素在抗凝血、抗炎症和肿瘤治疗等方面也显示出良好的活性。

因此，低分子肝素具备了广阔的应用前景。

6.结论本研究通过肝素的提取精制以及亚硝酸法制备低分子肝素，探究了低分子肝素的制备及其可能的生物医学应用。

虽然研究结果还需要进一步验证和研究，但低分子肝素在药物研发和临床治疗中具有重要的潜力。

通过本研究的实验和分析，我们成功地提取和纯化了肝素，并使用亚硝酸法制备了低分子肝素。

实验结果表明，亚硝酸法可以有效地降低肝素的分子量，并得到不同分子量的低分子肝素。