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Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定Spl基因RNA干扰载体的构建及鉴定目的:构建干扰载体pSilencer 3.1-spl,并初步研究其对Spl基因的干扰作用.方法:根据Spl cDNA编码序列,设计并合成针对Spl基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer 3.1-Hl neo干扰载体中,构建Spl基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体pSilencer 3.1-Spl;分别将阴性对照载体pSilencer 3.1与重组载体pSilencer 3.1-Spl经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Spl基因的转录与表达水平.结果:构建了Spl基因siRNA真核表达载体pSilencer 3.1-Spl,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果.结论:特异性siRNA能明显抑制Spl基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Spl的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.作者：曲璇陈苏宁吴琳申亮亮林伟赵华栋刘新平张健 QU Xuan CHEN Su-Ning WU LinSHEN Liang-Liang LIN Wei ZHAO Hua-Dong LIU Xin-Ping ZHANG Jian 作者单位：曲璇,吴琳,申亮亮,林伟,赵华栋,刘新平,张健,QU Xuan,WU LinSHEN,Liang-Liang,LIN Wei,ZHAO Hua-Dong,LIU Xin-Ping,ZHANG Jian(第四军医大学,基础部生物化学与分子生物学教研室,国家肿瘤生物学重点实验室,陕西,西安,710032)陈苏宁,CHEN Su-Ning(第四军医大学,基础部生物化学与分子生物学教研室,国家肿瘤生物学重点实验室,西京医院药剂科,陕西,西安,710032)刊名：生物技术通讯ISTIC 英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 2008 19(4) 分类号： Q78 关键词：RNA干扰 Spl基因小干扰RNA。
细胞生物学实验动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术一、实验目的1、学习和掌握外源基因导入动物细胞的方法，观测外源基因的表达（绿色荧光蛋白），并了解细胞转染技术在细胞生物学相关领域的应用。
2、学习和掌握RNA干扰技术原理，学习观测利用化学合成的GFP-siRNA对GFP蛋白的抑制效果。
二、实验原理（一）绿色荧光蛋白1、GFP荧光蛋白的发现1962年,下村修在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。
它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。
马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。
1993年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。
1994年在美国《科学》杂志上发表《作为基因标识的绿色荧光蛋白》一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。
2、GFP荧光蛋白的应用GFP已被广泛应用于：细胞内分子标记、药物筛选、融合抗体基因表达检测、分子间相互作用等。
GFP具有如下特性：GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.（二）转染1、转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。
RNAi的实验设计及使⽤步骤RNAi的实验设计及使⽤步骤RNA ⼲扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的⼴泛存在于⽣物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之⼀的，dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21-25 个核苷酸组成的⼩⼲扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA 作为介导⼦引起特异性地降解相同序列的mRNA，从⽽阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
siRNA 设计A.哺乳动物siRNA 设计基因抑制的有效性很⼤程度取决于⽬的基因序列的选择。
⽬的序列可以随机选择也可以通过在⽬的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
哺乳动物siRNA设计需要注意的⼏个⽅⾯1．从转录本（mRNA）的AUG 起始密码开始，寻找“AA”⼆连序列，并记下其3'端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。
正义链和反义链都采⽤这19 个碱基(不包括AA 重复)来设计。
2．避免在起始密码⼦或⽆义区域附近选择⽬的序列。
3．siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。
4．在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的⾮编码区（untranslatedregions，UTRs），原因是这些地⽅有丰富的调控蛋⽩结合区域，⽽这些UTR 结合蛋⽩或者翻译起始复合物可能会影响siRNA 核酸内切酶复合物结合mRNA 从⽽影响siRNA 的效果。
5．将挑选的序列在公共数据库中进⾏⽐较以确保⽬的序列与其它基因没有同源性。
将潜在的序列和相应的基因组数据库（⼈，或者⼩⿏，⼤⿏等等）进⾏⽐较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使⽤BLAST （/doc/e0a96be6591b6bd97f192279168884868662b862.html /BLAST/）。
芸薹属ANR(BAN)基因家族RNA干扰载体的构建摘要：花青素还原酶(ANR)是原花青素生物合成的关键酶，对种皮色素的积累起重要作用。
黄子是油莱的重要优质性状，但甘蓝型油菜中其基因型缺乏，表型不稳定，分子机理不清。
该实验克隆了芸薹属ANR基因家族的RNA干扰片段BANRI，将其反反片段、正义片段采用NcoI+AatII、BamHI+Xbal分别插入到改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间，形成重组载体pFGC5941M—BANRI(简称为pBANRI)，复合PCR鉴定表明载体构建成功，并转化根癌农杆菌菌株LBA4404，获得工程菌株。
pBANRI 的构建有助于揭示芸薹属物种种皮色素合成的机理。
探索对油莱等植物种皮色素进行分子育种的可能性。
关键词：芸薹属；甘蓝型油菜；原花青素；ANR(BAN)；RNAi；载体芸薹属(Brassica)植物甘蓝型油菜(B.napus L.)是世界上重要的油料作物之一，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)亲缘关系较近。
在相同遗传背景下，黄子油菜比黑子油菜具有种皮薄，出油量高，油和饼粕中色素、木质素含量低等优点，因此黄子性状是油菜遗传改良的一个重要目标。
甘蓝型油菜中不存在天然的黄子基因型，但通过远缘杂交培育的黄子甘蓝型油菜存在黄子表型欠稳定、一致性差的问题。
对拟南芥等植物的研究表明，主要种皮色素是原花青素(Proanthocvanidin.PA)，也叫缩合单宁。
PA经公共苯丙烷一核心类黄酮一原花青素复合途径而合成，先后涉及12个关键酶(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3，H、DFR、LDOXJANS、LAR、ANR、LAC)的催化反应和3种转运蛋白(GST、MATE、ATPase)的胞内转运，并有6种转录因子(WIP ZF、MYB、bHLH、WD40、WRKY、MADS)参与调控PA的合成与积累。
一、磷酸钙转染法【实验原理】磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。
磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。
该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器、用具CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3CsCl纯化的表达质粒DNA（三）试剂1．完全培养液DMEM 90mlFCS 10ml2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用3．2×HEBS (g/500ml)NaCl 8.0KCl 0.38Na2HPO4.7H2O 0.19HEPES 5.0葡萄糖 1.0用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。
【方法与步骤】1．在10cm的培养板上接种1×106个BALB/c 3T3细胞第二天进行转染2．准备CaPO4沉淀2.1 准备两组试管在A管中加入：15μg质粒DNA69μl 2M CaCl2460μl重蒸水在B管中加入：550μl 2×HEBS2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。
【注意事项】1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
第1篇一、实验目的本实验旨在探究RNA干扰技术在抑制苹果多酚氧化酶（PPO）表达，从而减少苹果氧化褐变方面的应用效果。
通过对比实验组与对照组的褐变程度，评估该技术的可行性和有效性。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：- 品种：‘北极苹果’（PPO表达量较高）- 试剂：RNA干扰试剂盒、TRIZOL试剂、RT-PCR试剂盒、DNA marker、引物等- 仪器：离心机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、超净工作台等2. 实验分组：- 实验组：通过RNA干扰技术抑制PPO表达- 对照组：未进行RNA干扰处理三、实验方法1. RNA提取：分别从实验组和对照组苹果中提取总RNA，并进行浓度和纯度测定。
2. cDNA合成：将提取的总RNA反转录为cDNA。
3. 引物设计：针对PPO基因设计特异性引物。
4. RT-PCR：以cDNA为模板，进行RT-PCR扩增PPO基因。
5. 实验组处理：按照RNA干扰试剂盒说明书进行操作，构建PPO基因的siRNA表达载体，转化苹果细胞，筛选阳性转化子。
6. 阳性转化子鉴定：通过PCR和测序鉴定阳性转化子。
7. 阳性转化子表达检测：采用RT-PCR方法检测PPO基因在阳性转化子中的表达水平。
8. 褐变程度评估：将实验组和对照组的苹果分别切成小块，置于相同条件下进行氧化处理，观察并记录褐变程度。
四、实验结果与分析1. RT-PCR结果：实验组PPO基因表达量显著低于对照组，表明RNA干扰技术能够有效抑制PPO表达。
2. 阳性转化子鉴定：成功筛选出阳性转化子，并经过PCR和测序验证。
3. 阳性转化子表达检测：PPO基因在阳性转化子中的表达量显著低于对照组，进一步证实RNA干扰技术的有效性。
4. 褐变程度评估：实验组苹果在氧化处理后的褐变程度明显低于对照组，表明RNA干扰技术能够有效抑制苹果氧化褐变。
五、结论本研究通过RNA干扰技术抑制苹果PPO表达，成功降低了苹果的氧化褐变程度。
shRNA实验步骤试剂image.png实验步骤1.合成Nestin干扰序列2.干扰序列退火将正反向干扰序列以10μM浓度溶于ddH2O，按以下体系将正反向干扰序列退火形成双链粘末端DNA：10 μL Forward oligo10 μL Reverse oligo5 μL 10x NEB buffer 225 μL ddH2O置于100度水，自然降温3.将Nestin干扰序列克隆至PLKO.1载体质粒3.1 PLKO.1载体质粒酶切AgeI HF+ EcoRI HF酶切pLKO.1载体质粒，体系如下：image.png37°C孵育1.5h。
(酶切时间可延长到＞2h)琼脂糖凝胶电泳，可见1kb和7kb两个条带，切胶回收7kb条带（靠凹槽的那条）。
Run digested DNA on 0.8% low melting point agarose gel until you can distinctly see 2 bands, one 7kb and one 1.9kb. Cut out the 7kb band and place in a sterile microcentrifuge tube.1、配制成1%琼脂糖胶（0.5小时）0.7g+70ml 1TAE溶液（浓度越大，区分度越小），加10000的核酸染剂（amino acid stain）7µl。
2、电泳槽中，黑色为负电极，红色为正电极，凹槽对着负极。
大凹槽可加50µl，小凹槽可加10µl。
3、吸取5µl DL5000 DNA marker加入电泳槽。
4、吸取5µl 10*DNA loading buffer加入PLKO酶切液中。
5、参数设定100V，20min左右（条带跑到胶中间比较合适）。
6、暴光200ms以上，观看条带。
When visualizing DNA fragments to be used for ligation, use only long-wavelength UV light. Short wavelength UV light will increase the chance of damaging the DNA.7、剪下条带，称重。
RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程，小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解，阻断相应基因表达。
我们为您提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段（SiRNA）和构建载体RNA （SnRNA）两种形式，客户只需提供干预基因名称或基因序列ID，我们免费设计合适的干预位点，保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达，抑制效率不低于70%。
RNA干扰流程步骤一确定干扰基因，设计并合成合适的小干扰RNA（片段型或载体型小干扰RNA）。
步骤二预转染实验，进行细胞培养，摸索转染条件、时间并进行必要的检测（WB，PCR 等），确定干预效果最佳的一对小RNA。
步骤三正式实验，设置合理实验分组，进行瞬时或稳定转染。
步骤四转染后检测，根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。
以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。
RNA干扰检测细胞检测细胞增殖毒性MTT 细胞凋亡细胞周期细胞迁移细胞侵袭蛋白检测免疫印迹WB 免疫细胞化学ICC 免疫荧光IF 流式细胞术FCM 酶联免疫ELISA分子生物检测RT-PCR 实时荧光定量PCR 甲基化特异性PCR(MSP)生化检测酶类检测脂类检测糖类检测1.材料报价片段型（SiRNA）1980元/套（含3组小RNA+阴性对照）载体型（SnRNA）2800元/套（含4组小RNA+阴性对照）；2.RNA干扰预实验报价片段型（SiRNA）2000元/每项目（含3组小RNA+阴性对照组+WB检测+定量RT-PCR检测）载体型（SnRNA）2500元/每项目（含4组小RNA+阴性对照组+ WB检测+定量RT-PCR检测）；3.RNA干扰正式试验报价细胞培养（普通培养）200元/瓶；细胞培养（转染培养）250元/瓶；细胞爬片50元/片注：每组WB检测需要1瓶细胞；PCR检测以及FCM检测需要1瓶细胞，细胞培养瓶子规格为T25（5×5cm）；4.RNA干扰下游检测报价参见各章节报价RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
RNA干扰步骤范文RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过介导靶向mRNA的降解或抑制翻译的机制来沉默基因表达的方法。
RNAi技术因其高效、具有选择性和可逆性等特点，被广泛应用于研究基因功能和治疗疾病。
下面是RNA干扰的常规步骤。
一、设计siRNA序列siRNA（short interfering RNA）是RNAi中最常用的工具。
它们由20-25个碱基组成，包含正链和反链。
设计好的siRNA序列特异性地与靶向mRNA结合，从而引发RNAi反应。
siRNA序列可以来自基因序列，也可以使用在线工具进行设计。
二、纯化siRNA合成完的siRNA可能含有未反应完全的杂质。
常见的提纯方法有丝染和HPLC，用于去除杂质并保留合适的siRNA。
三、转染siRNA将siRNA引入靶细胞内是RNAi实验的一步关键。
目前常用的转染方法有离心转染、电穿孔法、磷脂体转染和病毒载体转染等。
选择合适的转染方法要考虑细胞类型、实验目的和资源的可用性。
四、评估RNA干扰效果为了确定RNAi的有效性，可以使用定量PCR、Western blotting和免疫细胞化学等技术来检测目标基因的表达水平。
同时，还可以使用质粒转染RNA干扰对照组进行比较。
五、验证RNA干扰效应验证RNA干扰效应可以通过细胞增殖试验和细胞凋亡分析等方法来确定，以进一步验证RNAi技术的可靠性和有效性。
六、RNA干扰后的功能研究七、RNA干扰的限制和改进尽管RNAi技术在研究和治疗领域有潜力，但也存在一些限制，如序列特异性和细胞内递送的问题。
为了克服这些限制，研究者们正在努力改进siRNA的设计和输送系统。
总结起来，RNA干扰的步骤主要包括设计siRNA序列、纯化siRNA、转染siRNA、评估RNA干扰效果、验证RNA干扰效应以及RNA干扰后的功能研究。
通过这些步骤，研究人员可以有效地沉默目标基因的表达，揭示其生物学功能和分子机制，为基因功能研究和疾病治疗提供重要的工具和思路。
RNA干扰载体的构建的实验流程
RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA 干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了干扰载体的构建的实验流程。
产品技术背景
pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。
H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。
由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。
由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。
pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。
本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。
插入寡核苷酸设计
pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。
合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。
正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体XhoI，BglII位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。
连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。
1. 选择干扰序列
在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。
我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：
推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。
RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。
RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平(推荐GC含量在35%到50%之间)。
不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。
确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。
方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。
设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。
这里提供的设计原则可以为您设计RNA干扰序列提供帮助。
但是，值得注意的是，遵循这些原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。
针对一个目标基因，我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干扰效果好的序列。
2. 寡核苷酸设计。
（1）设计正义寡核苷酸链(5’-3’方向)。
a) 5’TCGACCC
b) 19nt干扰序列正向序列(与目标mRNA一致)。
c) TTCAAGAGA(环状结构)。
d) 19nt干扰序列的反向互补序列。
e) TTTTT。
（2）设计反义寡核苷酸链(5’-3’方向)。
a) 去掉正义链寡核苷酸中5’TCGA
b) 将步骤a)中得到的序列做反向互补。
c) 在步骤b)中得到的序列的5’端加上碱基GATC。
一个设计好的例子见下图：
实验流程
概述：
以下为使用pRI载体的方法概述。
1. 将合成的正义和反义寡核苷酸链退火。
2. 用BglII和XhoI双酶切载体。
3. 将退火的寡核苷酸链与酶切后的线性载体连接。
4. 连接产物转化大肠杆菌。
5. 转染细胞。
6. 观测荧光表达(含有GFP的载体)或筛选稳定表达细胞(含有抗性的载体)。
7. 检测目标基因蛋白或mRNA表达水平
载体构建
对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。
对于酶切、DNA纯化以及转化等步骤，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。
步骤1：退火寡核苷酸链
根据我们的经验，脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。
但是不同供应商提供的引物纯度差别很大，如果您连接和克隆遇到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物，或者使用其他供应商提供的引物。
用水将寡核苷酸稀释为100 μM。
按以下体系配制退火反应体系：正义寡核苷酸(100 μM) 5 μl
反义寡核苷酸(100 μM) 5 μl
NaCl 100 mM
Tris-Cl pH7.4 50 mM
加水补足50 μl
将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR以上，运行以下程序：90 ℃4 min，70 ℃10 min，55 ℃10 min，40 ℃10 min，25 ℃10 min。
退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20 ℃长期保存。
步骤2：酶切载体
用XhoI和BglII双酶切2 μg载体。
酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。
通常情况下用大约20-30单位的酶在大约3小时可以酶切完全。
酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。
将回收后的载体体积稀释为30 μl。
对线性化的载体进行去磷酸化处理是没有必要的。
充分酶切后的载体具有不匹配的末端，一般不会发生载体自连。
步骤3：连接载体
用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。
按照以下体系配制连接反应体系：
T4 DNA 连接酶5 U
线性化载体 2 μl
稀释后寡核苷酸2 μl
10×连接酶Buffer 1 μl
加水补足10 μl
接连反应条件和时间参照您购买的连接酶说明书进行。
为了减少空载体自连，连接反应完成后，在连接反应体系中加入1 μl BglII，37 ℃反应30 min，切割连接上的空载体。
(选做)
步骤4：转化大肠杆菌感受态
用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。
市场上常见的大肠杆菌感受态细胞(例如Top10，DH5-α)均可以使用，您也可以按照分子克隆中
的方法自己制备感受态细胞。
转化方法按照供应商的说明书或者您实验室中常用的方法进行。
在氨苄抗性的琼脂平板上37 ℃培养转化后细菌，大约14-16小时后，平板上出现单个细菌菌落。
挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。
鉴定方法可以采用PCR鉴定或酶切鉴定。
PCR鉴定采用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和
M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)进行鉴定，空载体扩增产物长度为308 bp，阳性克隆扩增产物为361 bp。
酶切鉴定采用HindIII和EcoRI双酶切。
空载体酶切产物长度为235 bp，阳性克隆酶切产物长度为288 bp。
鉴定正确的克隆可以用引物M13R-48测序验证插入的寡核苷酸序列是否正确无误。
步骤5：转染细胞
pRI系列载体可用常用的转染方法进行细胞转染。
包括：磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等。
您可以购买市售的商品化转染试剂并且参照供应商说明书进行细胞转染实验。
步骤6：观测GFP荧光和稳定表达细胞系筛选
如果细胞转染成功，并且您使用了带GFP的载体，根据细胞生长速度的不同，在转染后3-5天能在荧光显微镜下观察到细胞发出绿色荧光。
请注意，绿色荧光蛋白的表达表明转染细胞成功，不能说明RNA 干扰实验成功。
如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R的载体，这时您可以加入合适浓度的相应药物如G418进行稳定表达细胞株的筛选。
步骤7：检测RNA干扰效率
您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。
一般情况下蛋白的表达变化与mRNA水平的表达变化一致，也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白表达下降明显。
为检测蛋白表达情况，您可以使用Western-Blot。
为检测mRNA表达情况，您可以使用逆转录+Realtime PCR或Northern-Blot。
具体检测方法请参照分子克隆使用指南或者您实验室的常用实验方法。
疑难问题
遇见RNA干扰效果不理想，可以参考以下问题：
1. 寡核苷酸合成设计错误的核苷酸较多，致使序列与设计不符。
建
议做转染之前对载体进行验证，可以通过酶切以及测序进行测试。
2. 如果细胞转染效率不高，建议加入GFP进行标记检测。
