海马细胞培养流程

实验记录一、实验名称：海马细胞培养二、实验目的：在细胞水平评估给药后是否能够提高突触可塑性三、实验时间：年月日四、实验地点：五、实验人：六、实验试剂：1.完全DMEM培养基：2.1×PBS：厂家：HyClone；3.0.25%胰酶消化液：4.硼酸盐缓冲液（poly-L-lysine)：5.Neurobasal全培+双抗：6.HBSS缓冲液：七、实验仪器：1.湘仪TD5A-WS台式低速离心机，转子号为853590，水平转子，容量为32×15 ml。

2.培养箱：Thermo SCIENTIFIC培养箱，HERACELL 150i CO2 Incubator。

3.倒置显微镜4.解剖镜八、实验过程：1.准备24孔板，每孔放入一个处理好的玻片，共24孔。

分别加poly-L-lysineBuffer 500μl/孔，放入37℃培养箱中包被2小时以上。

2.4小时后，准备3个10-cm无菌培养皿，分别加20ml的HBSS-buffer，放在冰袋上预冷。

3.用75% 乙醇喷洗剪刀一把、尖头镊子两把、称量勺一把、手术刀片一个；将新生E19小鼠的头和身体分离，把头放在其中一个预冷的平皿中。

4.取大脑：左手用一把尖头镊子压住小鼠头部的眼睛处，右手用手术刀片将头顶处划开，再用另一把尖头镊子扒开头部的皮和脑壳，（注意不要弄坏大脑）右手拿称量勺尾端轻轻插入需出的大脑的底部，轻挑出大脑，放入到另一个干净的平皿中。

5.用上述取大脑的方法将剩余的小鼠大脑取出。

6.取海马体：在解剖镜下，左手用尖头镊子压住小脑处，右手翻开大脑的半球，去除血网，分离血网下的海马体（带状深色，半透明，靠近大脑半球的边缘），将海马体移入最后一个干净的平皿中。

7.用上述取海马体的方法将剩余的海马体取出。

8.全部海马体取出出后，用1ml 枪把海马体轻吸到1个无菌的1.5 ml EP管中，等海马体沉淀后，吸出上清，用PBS清洗10次，1ml/次。

小鼠海马神经元细胞的原代分离培养方法1、培养板的包被用0.01%的L-多聚赖氨酸溶液包被培养板和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

吸弃L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2、小鼠海马神经元细胞的分离及培养（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

（2）无菌分离海马组织。

保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。

（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。

巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。

（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。

加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。

（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。

以8.0 ×104至1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或100µL/孔接种 96 孔培养板。

（7）置37℃、5%CO2培养箱培养4-6h，全量更换为无血清培养液。

（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。

（9）此后每3d半量换液1次, 体外培养第7～21d的细胞用于实验。

显 示 神 经 元 、 状 胶 质 细胞 、 星 寡树 突 细胞 抗 原 阳性 。 结论 ： 海 马 分 离 出 的 细 胞 具 有 自我 更 新 、 殖 和 分 化 能 从 增
力 ， 神经 干细胞。 是
关 键 词 神 经 干 细 胞 海 马 大 鼠 细 胞 培 养
分类 号 Ｒ７ １ ０ ４ ．５
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第 １ ２卷 第 １ ９期 ２０ ０ ２年 ｌ Ｏ月
中 国 现 代 医学 杂 志 Ｃｈｎ ｏ ｍ ￣ ｏ ｏ ｅｎ Ｍ ｅ ｉｉ ｉａＪ ｕ ｆＭ ｄ Ｆ ｄｃｎｅ
Ｖｏ ． ２ Ｎｏ． ９ １１ １ ０Ｃ ．２ ０ ｔ ０２
Ｉ ＯＬＡＴＩ Ｎ ． Ｓ Ｏ ＣＵＬＴＵＲＥ ＡＮ Ｄ ＤＥＮＴＩ ＣＡＴＩ Ｎ Ｆ ＮＥＵＲＡ Ｌ Ｉ ＦＩ Ｏ Ｏ Ｓ ＴＥＭ ＣＥＬＬＳ Ｉ ＲＡ ＴＳ’ Ｈ Ｉ Ｎ ＰＰＯ ＣＡＬＭ ＰＵＳ
Ｌｉ ｕ Ｂａｉａｎ ， ｉ ｇｑ ｙ ＬｉＸ ｎ ｕｎ ， ａｎ Ｚｈ ｇｈｕ ｘｉ ， ｅ ． ａ ａｎ ｔａ１
个 克 隆 进 行 连 续 传 代 培 养 ， 免 疫 组 化 检 测 ｎｓｉ 原 和 分 化 后 神 经 细 胞 特 异 性 抗 原 。 结 果 ： 海 马 获 得 的 用 ｅｔ ｎ抗 从
细胞 群 能 够 连 续 传 代 ， 离后 的 单 个 细 胞 能 形成 事 迹 球 ， 疫 检 测 为 ｎｓｉ 性 ； 外 、 内分 化 的细 胞 分 别 分 免 ｅｔ ｎ阳 体 体
［ ｂｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅＴｏｉ ｌｔ ｎａ ｄｉｅｔｉ ｔ ｎｏ ｅ ｒｌｔｍ ｅｓｉ ｒｔ’ ｉｐｃｌ ｕ ． ｔｏ ｓＣ ｌ Ａ ｓ ｃ］ ｊｃｉ ： ｏａｉ ｎ ｎｉｃ ｉ ｆ ｕａ ｓ ｃｌ ａｓ ｈｐｏａｍｐｓ Ｍｅｈｄ ： ｅ ｓ ｒ ｖ ｓ ｏ ｄ ｆａｏ ｎ ｅ ｌｎ ｌ

海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。

暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。

2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。

培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。

一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。

其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。

4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。

后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。

结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。

6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。