细胞培养概述
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细胞工程-7 细胞培养的基本概念及培养细胞的生物学特征
一、细胞培养发展简史
• 动物细胞（组织）培养技术起源于1885年，德国人 Roux 用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之 存活了数月之久。 • 动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家 Harrison。在1907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴 培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存 活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。 Harrison - - isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres - grew them in frog lymph - observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.
5，由于细胞培养有可能在同一时期、相同条 件、相似性状的条件下提供大量的实验样 本，所以相对耗资较少，因而也就成为生物 制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的 重要手段。
6，细胞和组织生长在人工培养环境中，与体 内环境相比仍然存在一定的差异，培养的 细胞或组织，其形态或功能会发生不同程 度的改变。因此再利用培养细胞做实验对 象时，不能将其与体内细胞完全一样看 待，只能把它们视作一种既保持动物体内 原细胞一定的性状、结构和功能又发生某 些改变的特定的细胞群体。
四、体外培养细胞的分型
根据离体细胞在体外生长时是否贴壁的性 质，将其分为贴壁型与悬浮型两类
正常体内组织细胞类型
四、体外培养细胞的分型
贴壁型(anchorage-dependent cell)
按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
1)成纤维细胞型 （fibroblast） 2)上皮细胞型 （epithelium） 3) 游走细胞型 （wandering） 4)多形型细胞 （polymorphic）
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。
3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
细胞培养定义-概述说明以及解释
细胞培养定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞培养是一种重要的科学技术，用于在控制的实验室条件下，培养细胞体外生长和增殖。
通过提供合适的生长环境，包括适当的培养基、细胞状态维持剂和温度、湿度等因素的控制，细胞可以持续生长和繁殖。
细胞培养可以在无菌环境下进行，以保证培养过程中没有污染物的引入。
细胞培养的主要目的是研究细胞的特性和功能。
通过细胞培养，科学家可以观察和研究细胞在不同条件下的行为，进一步了解细胞的基本生理过程、信号转导途径和分化过程。
此外，细胞培养还被广泛应用于药物筛选、生物技术研究、生物工程和医药领域等。
细胞培养的发展历史可以追溯到19世纪末。
当时，人们开始尝试培养动物细胞，最早成功地实现了培养培养出鸟胚细胞。
经过长期的努力和技术改进，细胞培养的技术逐渐成熟，并被广泛应用于各个领域。
综上所述，细胞培养是一种重要的科学技术，通过在受控的实验室条件下培养细胞，可以研究细胞的特性和功能。
随着细胞培养技术的不断发展和完善，它在生物学研究、生物技术和医药领域的应用将会更加广泛。
1.2文章结构1.2 文章结构本文旨在探讨细胞培养的定义、历史、重要性以及应用领域。
为了更好地展示这些内容，本文将按照以下结构进行组织和展示：第一部分是引言部分，引言部分将对细胞培养进行概述。
我们将介绍细胞培养的基本概念，其在生物科学中的重要性以及本文的目的。
第二部分是正文部分，正文部分将分为两个小节。
首先，我们将详细介绍细胞培养的定义。
我们将解释什么是细胞培养，如何进行细胞培养以及细胞培养的目的和意义。
其次，我们将回顾细胞培养的历史，探讨细胞培养技术的发展和重要里程碑，以及这些里程碑对现代细胞培养的影响。
第三部分是结论部分，结论部分将总结细胞培养的重要性和应用领域。
我们将强调细胞培养在生命科学研究中的关键作用，并讨论细胞培养在医学、药物研发、生物工程等领域的广泛应用。
通过以上的文章结构，我们将全面、系统地介绍细胞培养的定义、历史、重要性和应用领域。
植物细胞培养
植物细胞培养
植物细胞培养是一种将植物细胞通过人工的方式在无菌条件下进行培养的方法。
它可以用来研究植物生长发育、植物组织和器官的形成、植物代谢产物的生产等。
植物细胞培养的步骤大致分为以下几个步骤：
1. 材料准备：准备需要培养的植物材料，如幼芽、种子、叶片等。
同时准备好无菌培养基、培养器皿和器械。
2. 表皮消毒：将植物材料表皮的细菌和真菌等杂质进行消毒处理，常用的方法有浸泡在含有消毒剂的溶液中，如酒精和次氯酸钠。
3. 组织分离：将消毒后的植物材料进行分离，常用的方法有切碎组织、分离细胞等。
4. 培养基制备：制备无菌的培养基，可以根据具体需求调整培养基的成分，常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
5. 培养：将组织或细胞转移到无菌培养基上进行培养。
可以选择不同的培养条件，如光照条件、温度、激素的添加等。
6. 培养过程中的观察和记录：观察培养物的生长情况，记录细胞的增殖、分化和器官的形成等变化。
植物细胞培养可以应用于植物繁殖、基因转化、抗病性筛选、药物生产等方面。
同时，植物细胞培养也属于一种生物技术手段，可用于保护濒危物种、加速育种进程等。
细胞灌流培养
Continuous removal of metabolites
-
Spent Medium Metabolites:Lac,NH4,et c
Very high titers
Very high cell densities
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
浓缩灌流式操作的优点是： ①细胞截流系统可使蛋白和细胞保留在反应器内，维持较高的细胞密度和蛋白浓 度，一般可达10e8/ml，表达量15g/l以上 ②连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积 累较低 ③反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高
Production biocreator
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
Fed-batch process profile Feed
Concentration Harvest Time Cell density Waste products Product of interest Nutrients
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
Perfusion Culture
传统灌流工艺 接种后灌流工艺开始 新培养基的持续加入，含产品的培养基持续收获 细胞截留装置将细胞保留在反应器中：微滤。旋转过滤器等 生产时间在20天以上，可达数月
Feed media
Cell retentilon device
Harvest
构建生物经济体系
打造生物经济旗舰
2.细胞培养方式的发展
80年代工业界普遍采用的灌流技术 -蛋白表达量低 -培养基技术水平低 90年代开始产品生产采用流加批次方式 -蛋白表达技术提高，培养基技术提高 -操作简单，失败率低 -单次收获。质量易控制 2000年后一次性反应器出现用于生产 -简单，快接，减少污染 -降低对设施要求，减少前期投入
细胞培养的名词解释是什么
细胞培养的名词解释是什么细胞培养是一种生物学技术，用于在体外创造和维持细胞的生存环境，以促进细胞的繁殖和生长。
通过控制培养基的成分和环境条件，细胞培养可以提供一个人工环境，使细胞能够在体外继续生长、分化和执行特定功能。
细胞培养是生物医学研究和生物制药领域中重要的实验技术之一。
1. 细胞培养的背景和意义细胞是生物体的基本单位，几乎所有生物体都是由细胞组成。
细胞培养通过实验室条件下的体外培养，为研究和理解细胞的生理、遗传和分子机制提供了有效工具。
细胞培养也可以用于疾病的研究和治疗开发，例如癌症细胞的培养和药物筛选。
2. 细胞培养的基本步骤细胞培养的基本步骤包括细胞分离、培养基的配制、培养基的稳定化、细胞的播种和培养。
首先，需要从生物样本中分离出细胞，这可以通过机械分离、酶消化或机械切割等方法实现。
然后，根据不同细胞类型的需求，配制适当的培养基，并将细胞转移到培养基中。
培养基中包含了各种营养物质和生长因子，以满足细胞的营养需求。
培养基的稳定化是为了保持其成分和性能的稳定性。
最后，将细胞播种到培养皿或培养瓶中，并提供适宜的环境条件，如适温、适湿度和适宜的氧气含量，以促进细胞的生长和繁殖。
3. 细胞培养的培养基和辅助物质培养基是细胞培养中的重要组成部分，它提供了细胞生长和繁殖所需的营养物质、生长因子和激素。
常用的培养基包括基础培养基和特定细胞类型的培养基。
基础培养基是一种通用的培养基，常用于各种类型的细胞培养。
特定细胞类型的培养基则根据细胞的特殊需求进行改良，以提供更适宜的生长环境。
除了培养基外，还可以添加一些辅助物质，如生长因子、抗生素和血清。
生长因子可以促进细胞的增殖和分化，抗生素用于预防细胞培养中的微生物污染，血清则含有丰富的营养物质和生长因子，有助于细胞的生长和存活。
4. 细胞培养的应用领域细胞培养在许多领域具有广泛的应用。
在基础研究方面，细胞培养可用于研究细胞的生命周期、分化和功能。
通过培养不同类型的细胞，科学家可以深入了解人体器官的发育和功能，并揭示疾病发生的机制。
细胞培养技术
三、培养细胞技术
（二）细胞来源 （2） 消化培养法 与组织块培养法区别： A. 用酶制剂处理组织块，除去细胞间
质，使细胞分离，形成细胞悬液； B. 细胞生长方式多为单层。
优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长 较快。
缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细 胞有损伤。
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三、培养细胞技术
（二）细胞来源 2. 细胞系（cell line） 原代培养物开始第一次传代培养后的细
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白
和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些
带正电荷的糖蛋白的Байду номын сангаас贴壁因子先吸附于底物
上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功 能基团）
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潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。
单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
克隆抗体。
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细胞培养目的和作用
基础研究 (1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生 机理。
2、生物制药 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗
等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的
过滤）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品
（1）培养瓶（25 、75 cm3）
6孔）
培养板（96、48、24、12、
培养皿（各种直径规格）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品 （2）离心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）冻存管、EP管 （5）试剂瓶等。
细胞培养基本知识
（2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定 程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常 二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代， 此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、
停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。
这一转折点有人称之危象临界点（crisis），有 些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞 可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们 称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。
（3） 细胞作为生命活动的基本单位的共同特点： 首先所有细胞 表面均有一层脂蛋白成分的生物 膜，即细胞膜，使细胞能与周围环境保持相对独 立性； 其次，所有细胞都有两种核酸，即DNA和RNA 作为遗传信息的复制和转录的物质基础； 第三作为蛋白质合成的“机器”-核蛋白，是一 切细胞不可缺少的基本结构； 第四所有细胞都是以一分为二的分裂方式增殖。 第五，细胞具有多样性，形状、大小悬殊很大， 结构复杂程度也很不一样。
株（Cell strain)
4. 组织（细胞）培养的医学生
物学意义
（1） 培养的组织器官或细胞，能在一定范围和 程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养 的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物
质基础
（2） 细胞培养与生物工程：细胞培养技术已经 成为商品化生物技术的核心。如目前可提供的产 品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗、乙肝疫苗； 非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素、集落刺
（3） 衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生 增殖缓慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡， 多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所
谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，
这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人 胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人 的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。
细胞培养概述
注意事项
• 1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫 及无菌操作台(laminarflow) 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以 外灯照射30-60分钟灭菌， 70%ethanol擦拭无菌操作抬 外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬 照射30 分钟灭菌 面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操 并开启无菌操作台风扇运转10分钟后， 10分钟后 作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不 每次操作只处理一株细胞株， 共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。 共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后 ，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬 将实验物品带出工作台， 70%ethanol擦拭无菌操作抬 面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行 操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后， 10分钟以上后 下一个细胞株之操作。 下一个细胞株之操作。
• 2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞， 必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸 管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完 即应移出，以利于气流之流通。实验用品 以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内 。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿 在边缘之非无菌区域操作。
• 3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污 小心取用无菌之实验物品， 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口， 染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦 不要在打开之容器正上方操作实验。容器 不要在打开之容器正上方操作实验。 打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身， 打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜 45°角取用， 约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放 置桌面。 置桌面。
(5)水
细胞培养技术
（3）微载体：由聚苯乙烯和聚丙烯酰胺制成的小球 微载体： 体，附着面大，利于大量繁殖细胞 附着面大， （4）饲细胞（Feeder Cells）：也称滋养细胞，如 饲细胞（ Cells）：也称滋养细胞， ）：也称滋养细胞 用成纤维细胞长成单层后，大剂量射 用成纤维细胞长成单层后， 线照射，细胞失去增殖能力但尚存活 线照射， 并有代谢活动； 并有代谢活动；再将其它细胞接种于 其上。饲细胞的代谢产物利于其它细 其上。 胞生长
五、培养细胞的生存环境
（一）无污染环境
细胞培养环境无毒、无菌是首要条件 细胞培养环境无毒、 人体：皮肤、黏膜；免疫系统；解毒器官 人体：皮肤、黏膜；免疫系统； 肝脏） （肝脏） 体外：保持细胞培养环境无任何污染， 体外：保持细胞培养环境无任何污染，及 时清除代谢物
（二）温度
人和哺乳动物培养细胞标准温度： 人和哺乳动物培养细胞标准温度： 36.5° 36.5°C ± 0.5°C 0.5° 培养细胞对低温的耐受力比其对高温强 ≤39 °C
3. 促生长因子
EGF, FGF, NGF, PDGF, EDGF等 EDGF等 激素：胰岛素——促进细胞利用葡萄 激素：胰岛素——促进细胞利用葡萄 糖和氨基酸 氢考——促进上皮细胞生长 氢考——促进上皮细胞生长
4. 其它物质
基本元素： 基本元素：钾、钠、钙、镁、氮和磷 微量元素：铁、锌、硒等 微量元素：
（四）体外培养细胞生存所需基本物质
1. 糖
六碳糖是主要的能源（葡萄糖、半 六碳糖是主要的能源（葡萄糖、 乳糖） 乳糖）
2. 氨基酸
所有的细胞都需要谷氨酰胺， 所有的细胞都需要谷氨酰胺，其所含的氨 是核酸中嘌呤和嘧啶的来源； 是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；其它还有精 氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨 蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、 酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、 组氨酸、 组氨酸、酪氨酸等 培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、 培养细胞也需要维生素，如生物素、叶酸、 泛酸、核黄素、硫胺素、 泛酸、核黄素、硫胺素、胭酰胺等
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几个操作间相通。
操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房
间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。
2、超净工作台：
超净工作台的工作原理是
利用鼓风机驱动空气遁过 高效滤器除去空气中的尘 埃颗粒，使空气得到净化。 净化空气徐徐通过工作台 面，使工作台内构成无菌 环境。
其它老师专门讲述实验室仪器：
恒温培养箱
第九次：胚胎技术：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集 程序、小鼠胚胎培养步骤、小鼠胚胎与小鼠子宫上皮共培养步骤、 小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离培养、小鼠外胎盘锥的培养、 外胎盘锥与蜕膜细胞的共培养、人绒毛的分离与培养、胚胎移植 技术、显微操作技术）
第十次：参观与讨论：
主要参考书：
其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化
装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、 细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、 消毒器、抽滤装置等）
3、如何维护无菌环境：
保持无菌的基本要求：
（1）实验前准备： 分门别类制定操作卡片，实验前按卡片 收集、清点、清洗及消毒所需物品，一 并放入无菌操作台内，实验器材准备数 要大于使用数，瓶盖数要大于瓶数。
1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。 2、离心管、吸管、盖子、TIP管、冻存管、烧 杯、量筒、容量瓶、饭盒,培养皿 3、枪头（TIP头） 4、培养板与培养皿 5、手术胞培养所用玻璃及塑料 制品的清洗与消毒
1、清洗
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非 常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗
（二）我国组织、细胞培养的发展：
20世纪30年代传入我国。 20世纪50年代起步。 20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
（三）细胞培养的优点：
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。 2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
第一章 细胞培养概述
主讲: 况海斌 Ph.D
南昌大学医学院生理学教研室 计划生育生殖内分泌研究室 khb9909@
课程安排:
第一次：细胞培养发展史（略讲）、细胞培养室的设计（重点理 解其原理，从而达到对细胞培养室要求的理解，如进出培养间要 关好每一扇门）。实验器械清洗、包装和清毒（清洗要领、清洗 液的配配制和使用的期限、包装的具体步骤：如何包装培养瓶， 清毒的方式、压力与时间。 第二次：实验室常用仪器、设备的使用与维护：净化台（使用的 区域、物品的摆放、操作方式、消毒、秽物处理）；自动双重纯 化水蒸馏器（使用与注意事项）；培养液的过滤器（简单与自动 抽气泵的过滤器使用介绍、操作关键点）；清毒器（种类、消毒 时间、压力、和注意事项），CO2培养箱（使用及注意事项）； 干燥箱；液氮生物容器；冰箱；显微镜；倒置显微镜；荧光显微 镜；天平；酸度计；电泳仪；PCR仪；离心机；振荡器，摇菌摇 床等相关设备。
其他设备
（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普 通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储 存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽 滤装置等）
1、无菌实验室：
设计原则：防治微生物污染和有害 因素影响，要求工作环境清洁、空 气清新、干燥和无烟尘。
1、无菌实验室：
总的要求：抽风过滤系统
无菌实验室：
组成： 更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。 缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与
如果有培养物污染而需要废弃时，应立刻从培养室 移出，并进行高压蒸汽灭菌处理。 进入实验室工作的所有人员，在每天进行实验工作 的前、后，用适当的消毒剂(如70%～75%酒精)擦拭 工作台面。
(6)实验室月维持任务—— 实验室月维持任务很少经常进行，但至少应该定期进行 一次。 如果实验室有多台培养箱连续工作，每月应有1台培养 箱停止运行，进行清理和保养，拆解培养箱，对各个培 养室部件进行消毒(我们半年进行一次,每月会更换孵育 箱的水)。
1955年 Dulbecco发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞 的方法，建立了单层细胞培养技术。 1961 Hatflick & Moorhead: 显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。 1965 Ham: 配制了第一个无血清培养液。 1975 Kohler & Miltein: 成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。
第五次：细胞培养的研究方法：活力的检测（死、活细胞鉴别； 凋亡细胞检测）；细胞增殖实验（MTT法、MTS法以及BrdU法）； 细胞和细胞器分离与培养（速度、等密度、流式细胞分离技术）； 细胞形态学研究方法（细胞固定、常用染色法、细胞免疫组化， 免疫荧光法）；细胞克隆技术（细胞克隆形成试验）。 第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（如心肌分 离与培养、从作者论文来分析论文设计及实验操作关键过程）。
第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长 期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的 流程和相关的指标）。
第八次：细胞转染技术（质粒序列选择、酶切位点选择及引物设 计、如何连接、接种，挑选阳性菌进行PCR扩增和测序，以及产 物鉴定。磷酸钙共沉淀法基因转染、脂质体转染法。了解病毒转 染法和RNA干扰技术。）
3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物--高等动物--人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤） 4、较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相 似的实验对象。
（四）细胞培养的缺点：
人工模拟的培养环境与体内相比仍然 存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态 或功能会发生不同程度的改变。
定期进行培养箱温度和CO2水平的校正，如果具有自动
调零功能，至少应1年1次，最好半年进行1次自动调零。
四、如何准备一次实验
分门别类制定操作卡片，实验前按卡片 收集、清点所需物品，进行相应清洗、 包装与消毒。 实验器材准备数要大于使用数（瓶盖数 要大于瓶数）。
（一）一般需要准备物品：
一、细胞培养发展史（略讲）: 二、细胞培养室的设计（重点理解其原理）: 三、细胞培养实验室无菌的基本要求: 四、如何准备一次实验(实验器械清洗、包装 和清毒):
一、组织培养发展简史
（一）发展史
Ross Harrison 1878 Claude Bernard: 证明一个器官在个体死亡以后仍然可以人工维持。 1885 Wilhelm Roux: 首次采用了“Tissue culture”这个名词。 1887 Ross Harrison: 利用的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经 嵴，维持其活性达数星期，并观察到了
（1）玻璃器皿的清洗
包括浸泡、刷洗、干燥、浸酸和冲洗 等步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不能残留任何物质
浸泡：
初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使 附着物软化或被溶掉
新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃 表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带 有一些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以 中和其中的碱性物质，再次使用的玻璃器皿则常附有大 量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入 水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上
试剂用后立即封闭瓶口。 专管专用，勤换吸管。 瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用干 酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。 盖瓶时瓶口和瓶盖经火焰消毒。
(4)实验后要求
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面 （一般先用加入新洁而灭或84的液体清 洗）。 关闭超净台灯、风和电源。 未使用过的器材放入饭盒中，用过的器材 清水浸泡。
(3)无菌操作要求：
小心取用无菌之实验物品，避免造成污 染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口， 亦不要在打开之容器正上方操作实验. 容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身， 倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口 朝上放置桌面。 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯 的火焰前方进行,瓶口、吸管、注射器使 用前要经过火焰消毒后使用。
率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.
培养器材：
Harrison（1906）通过采用单盖片悬滴培养法,用淋巴 液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织 细胞的基本模式的建立。
Carrel（1923）设计了卡氏培养瓶，进一步研究细胞 的营养问题。
Strengeway（1926）设计了表玻璃培养法，为研究动 物器官在体外的发育与功能作出贡献。 以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。
Ross Harrison被称为细胞培养之父。
早期培养
1898年 Ljunggren
将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后再移植手术获 得成功。
1903年Jolly
用玻片悬滴法培养蜂螺白细胞存活近一个月
1906年Beebe等 用动物血清培养狗的传染性淋巴瘤细胞达72小时。
1910 Burrows:
1. 《动物细胞培养技术》作者：程宝鸾，出 版 社：中山大学出版社 2．《细胞培养》 作者：司徒镇强，吴军正 出 版 社：世界图书出版公司 3. 《小鼠发育生物学与胚胎实验方法》作者： 金岩 出版社：人民卫生出版社 4. 《小鼠胚胎操作实验手册》 作者：安德拉 斯. 纳吉 翻译: 孙青原
操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房
间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。
2、超净工作台：
超净工作台的工作原理是
利用鼓风机驱动空气遁过 高效滤器除去空气中的尘 埃颗粒，使空气得到净化。 净化空气徐徐通过工作台 面，使工作台内构成无菌 环境。
其它老师专门讲述实验室仪器：
恒温培养箱
第九次：胚胎技术：（常用的昆明白小鼠超排卵方法及胚胎收集 程序、小鼠胚胎培养步骤、小鼠胚胎与小鼠子宫上皮共培养步骤、 小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离培养、小鼠外胎盘锥的培养、 外胎盘锥与蜕膜细胞的共培养、人绒毛的分离与培养、胚胎移植 技术、显微操作技术）
第十次：参观与讨论：
主要参考书：
其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化
装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、 细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、 消毒器、抽滤装置等）
3、如何维护无菌环境：
保持无菌的基本要求：
（1）实验前准备： 分门别类制定操作卡片，实验前按卡片 收集、清点、清洗及消毒所需物品，一 并放入无菌操作台内，实验器材准备数 要大于使用数，瓶盖数要大于瓶数。
1、培养瓶（培养液、消化液以及PBS）。 2、离心管、吸管、盖子、TIP管、冻存管、烧 杯、量筒、容量瓶、饭盒,培养皿 3、枪头（TIP头） 4、培养板与培养皿 5、手术胞培养所用玻璃及塑料 制品的清洗与消毒
1、清洗
在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非 常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗
（二）我国组织、细胞培养的发展：
20世纪30年代传入我国。 20世纪50年代起步。 20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
（三）细胞培养的优点：
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。 2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
第一章 细胞培养概述
主讲: 况海斌 Ph.D
南昌大学医学院生理学教研室 计划生育生殖内分泌研究室 khb9909@
课程安排:
第一次：细胞培养发展史（略讲）、细胞培养室的设计（重点理 解其原理，从而达到对细胞培养室要求的理解，如进出培养间要 关好每一扇门）。实验器械清洗、包装和清毒（清洗要领、清洗 液的配配制和使用的期限、包装的具体步骤：如何包装培养瓶， 清毒的方式、压力与时间。 第二次：实验室常用仪器、设备的使用与维护：净化台（使用的 区域、物品的摆放、操作方式、消毒、秽物处理）；自动双重纯 化水蒸馏器（使用与注意事项）；培养液的过滤器（简单与自动 抽气泵的过滤器使用介绍、操作关键点）；清毒器（种类、消毒 时间、压力、和注意事项），CO2培养箱（使用及注意事项）； 干燥箱；液氮生物容器；冰箱；显微镜；倒置显微镜；荧光显微 镜；天平；酸度计；电泳仪；PCR仪；离心机；振荡器，摇菌摇 床等相关设备。
其他设备
（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普 通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储 存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽 滤装置等）
1、无菌实验室：
设计原则：防治微生物污染和有害 因素影响，要求工作环境清洁、空 气清新、干燥和无烟尘。
1、无菌实验室：
总的要求：抽风过滤系统
无菌实验室：
组成： 更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。 缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与
如果有培养物污染而需要废弃时，应立刻从培养室 移出，并进行高压蒸汽灭菌处理。 进入实验室工作的所有人员，在每天进行实验工作 的前、后，用适当的消毒剂(如70%～75%酒精)擦拭 工作台面。
(6)实验室月维持任务—— 实验室月维持任务很少经常进行，但至少应该定期进行 一次。 如果实验室有多台培养箱连续工作，每月应有1台培养 箱停止运行，进行清理和保养，拆解培养箱，对各个培 养室部件进行消毒(我们半年进行一次,每月会更换孵育 箱的水)。
1955年 Dulbecco发明了用胰蛋白酶消化分离组织细胞 的方法，建立了单层细胞培养技术。 1961 Hatflick & Moorhead: 显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。 1965 Ham: 配制了第一个无血清培养液。 1975 Kohler & Miltein: 成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。
第五次：细胞培养的研究方法：活力的检测（死、活细胞鉴别； 凋亡细胞检测）；细胞增殖实验（MTT法、MTS法以及BrdU法）； 细胞和细胞器分离与培养（速度、等密度、流式细胞分离技术）； 细胞形态学研究方法（细胞固定、常用染色法、细胞免疫组化， 免疫荧光法）；细胞克隆技术（细胞克隆形成试验）。 第六次：具体原代细胞的分离与培养流程及实验设计（如心肌分 离与培养、从作者论文来分析论文设计及实验操作关键过程）。
第七次：干细胞的分离与培养流程、及实验设计（使学生了解长 期细胞培养流程、注意事项、以及干细胞诱导分化过程、鉴定的 流程和相关的指标）。
第八次：细胞转染技术（质粒序列选择、酶切位点选择及引物设 计、如何连接、接种，挑选阳性菌进行PCR扩增和测序，以及产 物鉴定。磷酸钙共沉淀法基因转染、脂质体转染法。了解病毒转 染法和RNA干扰技术。）
3、应用广： 领域多：医学研究、生物技术、基因工程等 对象广：各种动物（低等动物--高等动物--人类） 一种动物（不同年龄、不同组织） 正常或异常（肿瘤） 4、较经济： 可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相 似的实验对象。
（四）细胞培养的缺点：
人工模拟的培养环境与体内相比仍然 存在一定差异，培养的细胞或组织，其形态 或功能会发生不同程度的改变。
定期进行培养箱温度和CO2水平的校正，如果具有自动
调零功能，至少应1年1次，最好半年进行1次自动调零。
四、如何准备一次实验
分门别类制定操作卡片，实验前按卡片 收集、清点所需物品，进行相应清洗、 包装与消毒。 实验器材准备数要大于使用数（瓶盖数 要大于瓶数）。
（一）一般需要准备物品：
一、细胞培养发展史（略讲）: 二、细胞培养室的设计（重点理解其原理）: 三、细胞培养实验室无菌的基本要求: 四、如何准备一次实验(实验器械清洗、包装 和清毒):
一、组织培养发展简史
（一）发展史
Ross Harrison 1878 Claude Bernard: 证明一个器官在个体死亡以后仍然可以人工维持。 1885 Wilhelm Roux: 首次采用了“Tissue culture”这个名词。 1887 Ross Harrison: 利用的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经 嵴，维持其活性达数星期，并观察到了
（1）玻璃器皿的清洗
包括浸泡、刷洗、干燥、浸酸和冲洗 等步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不能残留任何物质
浸泡：
初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使 附着物软化或被溶掉
新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃 表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带 有一些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以 中和其中的碱性物质，再次使用的玻璃器皿则常附有大 量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入 水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上
试剂用后立即封闭瓶口。 专管专用，勤换吸管。 瓶口液滴不能倒回瓶内，液滴用干 酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。 盖瓶时瓶口和瓶盖经火焰消毒。
(4)实验后要求
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面 （一般先用加入新洁而灭或84的液体清 洗）。 关闭超净台灯、风和电源。 未使用过的器材放入饭盒中，用过的器材 清水浸泡。
(3)无菌操作要求：
小心取用无菌之实验物品，避免造成污 染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口， 亦不要在打开之容器正上方操作实验. 容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身， 倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口 朝上放置桌面。 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯 的火焰前方进行,瓶口、吸管、注射器使 用前要经过火焰消毒后使用。
率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞.
培养器材：
Harrison（1906）通过采用单盖片悬滴培养法,用淋巴 液培养蛙胚神经组织数周，从此标志着体外培养组织 细胞的基本模式的建立。
Carrel（1923）设计了卡氏培养瓶，进一步研究细胞 的营养问题。
Strengeway（1926）设计了表玻璃培养法，为研究动 物器官在体外的发育与功能作出贡献。 以及现在培养瓶、培养板和培养皿的发展。
Ross Harrison被称为细胞培养之父。
早期培养
1898年 Ljunggren
将人体皮肤保存在腹水中几天至几周后再移植手术获 得成功。
1903年Jolly
用玻片悬滴法培养蜂螺白细胞存活近一个月
1906年Beebe等 用动物血清培养狗的传染性淋巴瘤细胞达72小时。
1910 Burrows:
1. 《动物细胞培养技术》作者：程宝鸾，出 版 社：中山大学出版社 2．《细胞培养》 作者：司徒镇强，吴军正 出 版 社：世界图书出版公司 3. 《小鼠发育生物学与胚胎实验方法》作者： 金岩 出版社：人民卫生出版社 4. 《小鼠胚胎操作实验手册》 作者：安德拉 斯. 纳吉 翻译: 孙青原